Набор реагентов для выявления антител к антигенам вирусов иммунодефицита человека первого и второго типов методом иммунного блоттинга с применением рекомбинантных вирусоспецифических полипептидов "Блот-ВИЧ 1/2+0" по ТУ 9398-001-10839330-2006 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДЕНА Приказом РосмравнадзораПриказом ^осздравнадзора ^ А / От 2 0 о2 г . № Г енеральный директор ЗАО Биотехнологической компании «УТВЕРЖДАЮ» ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления антител к антигенам вирусов иммунодефицита человека первого и второго типов методом иммунного блоттинга с применением рекомбинантных вирусоспецифических полипептидов "Блот-ВИЧ 1/2 + О" 1. НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов "Блот-ВИЧ 1/2 + О", далее по тексту - Набор, предназначен для подтверждения выявления антител к отдельным антигенам ВИЧ-1, ВИЧ-1 группы О и ВИЧ-2 в сыворотке или плазме крови человека методом линейного иммунонализа (иммунного блоттинга). 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1. ПРИНЦИП МЕТОДА На поверхности иммуносорбента - полосок нитроцеллюлозных мембран в виде поперечных линий иммобилизованы очищенные рекомбинантные полипептиды - аналоги антигенов ВИЧ и контрольные антигены специфичности и правильности проведения реакции; 1) рекомбинантный антиген "Envl-160" представляет собой синтезированный в Е . с о И полипептид, содержащий аминокислотную последовательность протективного белка (Р-галактозидазы Е . с о И ) и антигенных детерминант гликопротеина gpl60 ВИЧ-1; 2) рекомбинантный антиген "Envl-41" представляет собой синтезированный в Е . с о И полипептид, содержащий аминокислотную последовательность протективного белка (р-галактозидазы Е . с о И ) и аминокислотную последовательность антигенных детерминант гликопротеина gp41 ВИЧ-1; 3) рекомбинантный антиген "Gagl" представляет собой синтезированный в Е . с о И полипептид, содержащий аминокислотную последовательность протективного белка --- стр. 2 --- (Р-галактозидазы E . c o l i ) и антигенных детерминант белков р24 и р17 ВИЧ-1; 4) рекомбинантный антиген "Poll" представляет собой синтезированный в E . c o l i полипептид, еодержащий аминокислотную последовательность протективного белка (Р-галактозидазы E . c o l i ) и антигенных детерминант белка полимеразы р51 ВИЧ-1; 5) рекомбинантный антиген "Inti" представляет собой синтезированный в E . c o l i полипептид, содержащий аминокиелотную последовательноеть протективного белка (Р-галактозидазы E . c o l i ) и антигенных детерминант белка интегразы р31 ВИЧ-1; 6) рекомбинантный антиген "Env2" представляет собой синтезированный в E . c o l i полипептид, содержащий аминокислотную последовательность протективного белка (Р-галактозидазы E . c o l i ) и антигенных детерминант гликопротеинов gpllO и gp38 ВИЧ-2; 7) рекомбинантный антиген "Env-0" представляет собой синтезированный в E . c o l i полипептид, содержащий аминокислотную последовательность протективного белка (Р-галактозидазы E . c o l i ) и аминокислотную последовательность антигенных детерминант белка оболочки ВИЧ-1 группы 0; 8) контрольный антиген специфичности реакции (Кдг) представляет собой синтезированный в E . c o l i рекомбинантный полипептид, аминокислотную последовательность протективного белка (Р-галактозидазы E . c o l i ) и не содержащий антигенных детерминант ВИЧ. 9) контрольный антиген правильности проведения реакции (Кр) представляет собой сыворотку против IgG человека. Положительный контрольный образец инактивированный представляет собой сыворотку крови человека, содержащую антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и не содержащую антител к вируеу гепатита С, HBsAg. Инактивирована прогреванием при температуре от 54 до 56 °С в течение 3 ч. Отрицательный контрольный образец инактивированный К~ представляет собой сыворотку крови человека, не содержащую антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2, к вирусу гепатита С, HBsAg и антигена р24 ВИЧ. Инактивирована прогреванием при температуре от 54 до 56 ° С в течение 3 ч. Конъюгат представляет собой моноклональные антитела мыщи против IgG человека, связанные с ферментом пероксидазой хрена. Раствор № 4 для разведения хромогена содержит субстрат ферментативной реакции. Хромогеном является ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин). J --- стр. 3 --- Анализируемые образцы инкубируют с иммуносорбентом в канавках планшетов для проведения реакции. Содержащиеся в образцах иммуноглобулины к вирусу иммунодефицита человека специфически взаимодействуют с рекомбинантными антигенами на твердой фазе, образуя иммунные комплексы антиген-антитело. Контрольный антиген правильности проведения реакции связывается с иммуноглобулинами класса G, присутствующими в образцах сывороток. Контрольный антиген специфичности реакции выявит связывание с иммуносорбентом антител к протективному белку, если таковые неспецифические для данного анализа антитела будут присутствовать в исследуемом образце. После удаления несвязавшихся антител в канавки планшетов с мембранами добавляют конъюгат, который взаимодействует с комплексами антиген-антитело, образовавшимися на предыдущем этапе реакции. После отмывки несвязавшихся молекул конъюгата, мембраны выдерживают с индикаторным раствором, включающим субстрат и хромоген ТМБ. Содержащийся в конъюгате фермент катализирует разложение субстрата, приводящее к окрашиванию хромогена в фиолетово-синий цвет в области линий, содержащих иммобилизованные вируеоспецифические рекомбинантные антигены и контролъный антиген правилъности проведения реакции. После остановки реакции результаты учитывают визуально по окрашиванию линий на полосках. 2.2. СОСТАВ НАБОРА Набор выпускается в виде набора компонентов, упакованных в коробку: Наименование компонента набора Количество Описание Иммуносорбент 24 мембраны 1 пробирка Полоски нитроцеллюлозной мембраны белого цвета размером 40x4 мм, маркированные по верхнему краю цифрами, е выпуклыми поперечными линиями, на которых иммобилизованы антигены. Положительный контрольный образец инактивированный 0,25 мл 1 пробирка Прозрачная или слегка опалесцирующая, жидкость розового цвета. Отрицательный контрольный образец инактивированный К” 0,25 мл 1 пробирка Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость синего цвета. Конъюгат От 0,5 до 2,0 мл 1 пробирка Прозрачная светло-желтого цвета жидкость. 1 --- стр. 4 --- Концентрат раствора №2 блокирующего 31 мл 1 флакон Пенящаяся опалесцирующая бесцветная жидкость; допускается выпадение рыхлого комкующегося осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Раствор № 3 для разведения сывороток 25 мл 1 флакон Пенящаяся опалесцирующая бесцветная жидкость, допускается выпадение рыхлого комкующегося осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Раствор № 4 для разведения хромогена 30 мл 1 флакон Прозрачная бесцветная жидкость Хромоген 1.0 мл 1 пробирка Прозрачная бесцветная жидкость Раствор № 6 для остановки реакции 25 мл 1 флакон Прозрачная бесцветная жидкость Планшет для проведения реакции 2 или 3 шт. Пластмассовый планшет с 12- или 8- канавками соответственно Набор рассчитан на проведение 24 анализов, включая контрольные. 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА 3.1. Чувствительность. Чувствительность на «Стандартной панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) в различных концентрациях» (ОСО 42028-212-02П, ТУ 9398-027-26329720-2007, РУ № ФС 2007/00953), составляет 100% . Чувствительность на «Стандартной панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека второго типа (ВИЧ-2) в различных концентрациях» (ОСО 42028-214-02, ТУ 9398-027-26329720-2007, РУ № ФС 2007/00953), составляет 100%. 3.2. Специфичность. Специфичность на «Стандартной панели сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1,2) и антиген р24 ВИЧ-1» (ОСО 42028-214-02П, ТУ 9398-027-26329720-2007, РУ № ФС 2007/00953), составляет 100%. На линиях мембран с иммобилизованными антигенами ВИЧ при анализе сывороток стандартных панелей допускается окрашивание очень слабой интенсивности --- стр. 5 --- (+/-) в связи со слабой реактивностью отдельных сывороток стандартных панелей к отдельным рекомбинантным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2. 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ Со всеми тестируемыми образцами, сточными растворами, а также с оборудованием и материалами, находящимися с ними в контакте, следует обращаться как с потенциально инфицированными объектами: - не пипетировать растворы ртом, при работе использовать индивидуальные средства защиты (резиновые перчатки и защитные очки); - вее еточные растворы обрабатывать 4 %-м раствором хлорамина или 6 %-м раствором перекиси водорода при температуре от 18 °С до 25 °С в течение 3 часов; - все твердые отходы сбрасывать в специальный контейнер с пломбируемой крышкой и затем подвергать автоклавированию в течение 60 мин при 121 °С или сжигать; - инструменты и оборудование до и после работы протирать 70 %-м спиртом; - утилизировать отходы, соблюдая законодательство по охране окружающей среды. 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛБ1. Для проведения анализа необходимо использовать: - качающее устройство типа КУ-400, позволяющее производить качание с углом колебаний 2-10 градусов и частоте от 10 до 15 колебаний в минуту, или аналогичные ему; - аспиратор вакуумный типа ОХВЗ-01-«Дубна»; - дистиллятор типа АДЭ-25; - пинцет пластмаееовый; - пипетки автоматические одноканальные («Gilson», Франция, Р200, Р1000, Р5000) со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 0,01 мл до 5,0 мл, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %); - цилиндры мерные вместимоетью 10 мл и 200 мл; - етаканы мерные вместимостью 10 мл и 200 мл; - перчатки резиновые хирургичеекие; - чашка Петри (диаметр 100 мм); - спирт этиловый; --- стр. 6 --- - перекись водорода; - вода дистиллированная; - контейнер для сбора твердых отходов; - контейнер для слива отработанных жидкостей; - флаконы стеклянные вместимостью 20 мл; - вата медицинская гигроскопическая; - бумага фильтровальная; - одноразовая посуда для приготовления рабочих растворов конъюгата и хромогена; - липкая пленка для заклейки планшетов. 6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ Для проведения анализа используются образцы (сыворотка или плазма крови человека) в объеме 20 мкл. В наборе могут быть исследованы образцы, находящиеся в пробирках, содержащих цитрат натрия, гепарин или ЭДТА в качестве антикоагулянтов, а также образцы, содержащие азид натрия в качестве консерванта. Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Следует осветлять образцы сывороток, содержащие агрегаты и осадок, центрифугированием. Собранные образцы сыворотки или плазмы хранят при температуре от 4 °С до 6 °С. Если образцы невозможно протестировать в течение 72 ч, то их следует хранить при температуре не выше минус 15 °С. При этом рекомендуется замораживать и оттаивать образцы не более одного раза. Помните, что исследование образцов с выраженным гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания, может привести к получению ложных результатов. Каждый образец сыворотки или буферный раствор необходимо отбирать новым наконечником. ВНИМАНИЕ! Нельзя использовать компоненты из наборов разных серий или смешивать их в процессе приготовления растворов! Анализ проб следует проводить так, чтобы на одного оператора одновременно приходилось не более одного набора. --- стр. 8 --- синтетических моющих средств, поскольку даже их следы приводят к неконтролируемому разложению ТМБ в ходе пероксидазной реакции. Избегайте также контакта этих реагентов с металлами. 7.2. ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ Все операции с полосками нитроцеллюлозных мембран проводите с использованием пластмассового пинцета. Обратите внимание, чтобы при инкубации и промывании полоски мембран были полностью погружены в жидкость, а реагенты не переливались через бортики канавок во избежание смешивания. После окончания отдельных стадий реакции и промывок все растворы необходимо тщательно удалять при помощи насоса или автоматической пипетки. Следите, чтобы капли влаги не оставались под мембраной. При необходимости осторожно приподнимите мембрану пинцетом и удалите из-под нее остатки влаги. Обратите внимание, чтобы растворы не попадали внутрь пипетки. Процедура проведения анализа с 2-часовой инкубацией с образцами. 7.2.1. Необходимое количество полосок мембран извлеките из пробирки и поместите по одной в каждую канавку планшета. Внесите в каждую канавку по 1 мл раствора № 3 так, чтобы мембраны погрузились в раствор. Поместите планшет на качалку и вьщержите 10 мин при температуре от 20 °С до 25 °С при угле колебаний 2- 10 градусов и частоте от 10 до 15 колебаний в мин. 7.2.2. Не удаляя раствор, внесите в канавку планшета, предназначенную для исследования положительного контроля, 20 мкл К^, в канавку планшета, предназначенную для исследования отрицательного контроля, 20 мкл К'. В остальные канавки внесите по 20 мкл испытуемых образцов сывороток или плазмы крови. При внесении каждого (исследуемого и контрольного) образца необходимо регистрировать в протоколе анализа номер соответствующей полоски мембраны. Каждую пробу вносите в соответствующую канавку планшета новым наконечником. Внесение образцов сывороток должно сопровождаться быстрым и тщательным перемешиванием автоматической пипеткой. Заклейте занятые канавки липкой пленкой и поместите планшет с мембранами на качалку. Вьщержите 2 ч при температуре от 20 °С до 25 °С, покачивая планшет, как описано в п.7.2.1. 7.2.3. Удалите жидкость из канавок планшета (с этой целью здесь и далее используйте лабораторный вакуумный аспиратор или автоматическую пипетку). --- стр. 9 --- Внесите в каждую канавку по 1 мл рабочего раствора № 2, после чего раствор сразу удалите. 7.2.4. Внесите в каждую канавку по 1 мл рабочего раствора № 2, выдержите 5 мин, раствор удалите. Операцию повторите. 7.2.5. Внесите в каждую канавку по 1 мл рабочего разведения конъюгата, предписанного для 2-часовой длительности инкубации (см. п.7.1.3). Выдержите 1 ч при температуре от 20 °С до 25 °С, покачивая планшет, как описано в п.7.2.1. 7.2.6. Раствор конъюгата удалите. Внесите в каждую канавку по 1 мл рабочего раствора № 2 (см. п.7.1.1), раствор сразу удалите. Промывки и удаление жидкости после реакции с конъюгатом требуют особого внимания, т.к. даже следы конъюгата при контакте с субстратом могут привести к неспецифическому окрашиванию всей мембраны, а не отдельных полос. 7.2.7. Внесите в каждую канавку по 1 мл рабочего раетвора № 2, выдержите 5 мин, жидкость удалите. Операцию повторите. 7.2.8. Быстро промойте мембраны дистиллированной водой, поочередно добавляя в каждую канавку по 1 мл и сразу же удаляя. После промывки всех мембран тш;ателъно удалите из канавок остатки воды. 7.2.9. Внесите в каждую канавку по 1 мл свежеприготовленного индикаторного раствора (см. п.7.1.4). Выдержите, покачивая планшет (см. п.7.2.1), 15 мин при температуре от 20 до 25 °С в защищенном от света месте (например, накрыв планшет крышкой). Жидкость удалите. 7.2.10. Внесите в каждую канавку по 1 мл раствора № 6, выдержите 5 мин. Раствор удалите. Дважды тщательно промойте мембраны дистиллированной водой объемом не менее 2 мл. 7.2.11. Положите полоски мембран на лист фильтровальной бумаги и, не промокая их, поместите в защищенное от света место до полного высыхания. Учет результатов следует проводить сразу же после полного высыхания мембран. 7.2.12. Процедура проведения анализа с 18-часовой инкубацией с образцами. В этом более чувствительном варианте иееледования измените только следующие параметры проведения реакции: а) Исследуемые и контрольные образцы вносите так же, как описано в п.7.2.2, но увеличьте длительность инкубации до 18-20 часов; --- стр. 10 --- б) Вносите в каждую канавку по 1 мл рабочего разведения конъюгата, предписанного для 18-часовой длительности инкубации (см. п.7.1.3). Выдержите 30 мин при температуре от 20 до 25 °С, покачивая планшет, как описано в п.7.2.1. 8. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 8.1. Убедитесь, что в результате проведения реакции контрольные сыворотки (К^ и К ) дают фиолетово-синее окрашивание в области линий на полосках мембран (рис. 1) СТРОГО В СООТВЕТСТВИИ с таблицей 1. Рис 1. Размещение линий с иммобилизованными вирусоспецифическими и контрольными антигенами на полоске нитроцеллюлозной мембраны. 1. Envl-160 2. Envl-41 3. Gagl 4. Poll 5. Inti 6. Env2 7. EnvO 8. Контрольный антиген специфичности реакции 9. Контроль проведения реакции Таблица 1. Окрашивание линий на полосках мембран при анализе контрольных СЫВОРОТКА Номера линий № 1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 № 8 №9 есть есть есть есть есть есть есть нет есть К" нет нет нет нет нет нет нет нет есть В елучае ЛЮБОГО отличия результатов анализа и К~ от приведенных в табл.1 иееледование считается выполненным некорректно и его следует повторить. 8.2. ЕСЛИ на полоске мембраны с исследуемым образцом НЕ ПРОИЗОШЛО окрашивания линии № 8 (контроль специфичности реакции) и ПРОИЗОШЛО окрашивание линии № 9 (контроль правильности проведения реакции) то интерпретацию результата анализа данного образца проводите в еоответствии с табл. 2. Если при этом исследование проводилось по варианту с двухчасовой инкубацией образцов и произошло столь слабое окрашивание вирусоспецифических линий мембраны, что оно не дает возможности интерпретировать результат как i L 10