Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Туляремия-РВ) по ТУ 939816-016-46395995-2013 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1 Полное название набора «Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Туляремия-РВ)». 1.2 Предназначение набора и его диагностическая роль Набор реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» предназначен для качест венного определения (скрининг, мониторинг) ДНК возбудителя туляремии (Francisella tularensis) в биологическом материале - содержимое бубона, мате риал из зева, конъюнктивы глаза, отделяемое язвы, мокрота, кровь, секционный материал от умерших людей (увеличенные лимфатические узлы, измененные участки легких и селезенки), а также в материале от диких млекопитающих, кровососущих насекомых (клещи, комары, слепни, блохи и другие), в пищевых продуктах, объектах внешней среды - солома, фураж, вода из естественных и искусственных водоемов, ил, гидробионты, содержимое нор грызунов и т.д., а также в культурах микроорганизмов методом ПЦР-РВ. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфической патологии (туляремия) при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА), в объектах окружающей среды; как ускоренного предварительного теста при выполнении биологического метода исследования и идентификации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга. 1.3 Область применения набора Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика ту ляремии, специфическая индикация патогенных биологических агентов, эпиде миологический мониторинг, научные исследования. Набор может быть исполь зован в учреждениях медицины и здравоохранения, в лабораториях Центров ги гиены и эпидемиологии и противочумных учреждениях Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах, а также в стационарных и мобильных лаборато --- стр. 3 --- риях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства обороны. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА Компоненты набора являются одноразовыми. Набор реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» не требует технического обслуживания и калибровки. 2.1 Состав набора Набор реагентов состоит из 5 реагентов. № п/п Состав комплекта Описание Объем Кол-во 1. Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-Тул сухое вещество белого цвета 1 мг 6 стрипов 2. Разбавитель, РБ прозрачная бесцветная жидкость 0,8 мл 1 пробирка 3. Положительный контрольный образец, ПКО-Тул сухое вещество белого цвета 2 мг 3 пробирки 4. Раствор для разбавления ПКО, ОКО прозрачная бесцветная жидкость 1 мл 1 пробирка 5. Внутренний положительный контроль вьщеления, ВПК-В сухое вещество белого цвета 2 мг 1 пробирка Реакционная смесь в стрипованных микропробирках (лиофилизованная), РС-Тул, расфасована в микропробирки в стрипах объемом 0,2 мл, упакованные в непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 9x12 см, состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, шесть олигонуклеотидных праймеров, четыре флуоресцентных зонда, фермент Taq ДЬЖ-полимераза, синтетическая ДНК внутреннего положительного контроля (ВПК), трегалоза. Разбавитель РБ, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчиваюш,ейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: ПЦР-буфер, хлорид магния, глицерол, вода для ПЦР. Положительный контрольный образец (лиофилизованный), ПКО-Тул расфасован в три пробирки из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчиваю щейся крышкой, упакованные в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: смесь трех рекомбинантных плазмид pGem-T, содержащих встроенные специфические последовательности ДНК: фрагмент гена ISFtu5, --- стр. 4 --- ш специфичного для F.tularensis подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica; фраг мент гена FTT_1272(G), специфичного в отношении F.tularensis подвид tularensis', фрагмент гена FTT_1272(A), специфичного для F.tularensis подвидов holarctica, mediasiatica и novicida. Раствор для разбавления ПКО, ОКО, расфасован в пробирьсу из полипро пилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэти леновый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: ТЕ буфер. Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В (лиофилизо- ванный), расфасован в пробирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчи вающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: рекомбинантая плазмида pGem-T со встроенным специфиче ским фрагментом ДНК. Примечание: ингредиентами, которые могут влиять на измерения, явля ются праймеры и флуоресцентные зонды, основной характеристикой которых для конечного пользователя является температура отжига Та, составляющая 62 °С. Данная характеристика реализуется с помощью температурно временного режима амплификации, следовательно, его соблюдение является строго обязательным. 2.2 Количество анализируемых проб Набор реагентов рассчитан на 48 определений, включая контрольные образцы. 2.3 Метод исследования Обнаружение специфических фрагментов нуклеиновых кислот F.tularensis основано на использовании метода мультиплексной полимеразной цепной реакции с получением результата в режиме реального времени - ПЦР-РВ. В основе метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) лежит изменение сигнала флуоресценции в ходе реакции. Это изменение происходит благодаря использованию специфического для искомой ДНК олигонуклеотидного зонда, который, подобно праймеру, в ходе реакции связывается с одной из цепей ампликона. К 5’ и 3’ концам зонда присоединены --- стр. 5 --- флуорофор и гаситель флуоресценции соответственно. При возбуждении молекулы флуорофора светом определенной длины волны данная молекула испускает свет другой длины волны. За счет близости молекул флуорофора и гасителя флуоресценции, находящихся на одном зонде, последний поглощает флуоресценцию и изменения аналитического сигнала не происходит. В результате расщепления специфического для искомой ДНК олигонуклеотидного зонда Taq-полимеразой на этапе элонгации при температурах около 60 °С, гаситель прекращает поглощать флуоресценцию данной молекулы флуорофора (технология TaqMan). С каждым циклом ПЦР число освобожденных молекул флуорофора экспоненциально возрастает (рисунок 1). Рисунок 1 - Принцип аналитического процесса Постановка ПЦР-РВ осуществляется на специальных приборах, например, «АНК-32 (32М, 48)» (ПАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX- 96» («BioRad», США), или эквивалентных по характеристикам (см. п. 5.1 настоящей инструкции). При амплификации методом ПЦР-РВ используются шесть олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих специфические фрагменты ДНК F.tularensis, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие ДНК внутреннего положительного контроля ПЦР-РВ, а также четыре флуоресцентных зонда. Процесс амплификации специфичных фрагментов --- стр. 6 --- заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой с детекцией результатов в режиме реального времени. Набор реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный для F.tularensis подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica фрагмент гена ISFtu5 — по каналу флуоресцен ции ROX, фрагмент гена FTT_1272(G), специфичный в отношении F.tularensis подвид tularensis — по каналу флуоресценции R6G; фрагмент гена FTT_1272(A), специфичный для F.tularensis подвидов holarctica, mediasiatica и novicida - по каналу FAM, а также внутренний положительный контроль - по каналу флуо ресценции Су5. Положительный результат теста означает, что исследуемый материал со держит ДНК возбудителя туляремии. Отрицательный результат теста означает, что исследуемый материал не содержит ДНК возбудителя туляремии. 2.4 Ограничения метода В инфицированном материале ДНК Francisella tularensis может быть не обнаружена по причине ингибирования ПЦР-РВ и/или недостаточной эффек тивности выделения ДНК. Для достижения показателей аналитической чувст вительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффек тивность выделения 1Ж на уровне не менее 20 %. Причиной получения ложноположительного результата является конта минация на этапе выделения ДНК либо проведения реакции ПЦР-РВ. Ложно положительный результат выявляется с помощью отрицательных контрольных образцов выделения и ПЦР-РВ (п. 7,5 настоящей инструкции). Причиной получения ложноотрицательного результата является ингиби рование ПЦР-РВ и/или недостаточная эффективность выделения ДНК. Ложно отрицательный результат выявляется с помощью внутреннего положительного контрольного образца ПЦР-РВ и выделения (п. 7.5 настоящей инструкции). --- стр. 7 --- 3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1.1 Чувствительность -5 Чувствительность - не менее 1,0-10 копий ДНК в миллилитре пробы (копий мл"'). Данный показатель достигается при условии объема аликвоты исходного материала (пробы) не менее 100 мкл. 3.1.2 Специфичность Специфичность - ложноотрицательные результаты при анализе образцов ДНК штаммов F.tularensis подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida (10 заведомо положительных образцов) отсутствовали, ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК гетерологичных микроорганизмов Escherichia hermannii, Escherichia coli, Enterobacter, Staphylococcus aureus. Streptococcus spp., Pantoea, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Proteus vulgaris, Morganella morganii. Bacillus anthracis. Yersinia pestis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei. Vibrio cholerae (25 заведомо отрицательных образцов) отсутствовали. 3.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Диагностическая чувствительность - при исследовании 62 проб бактериальных суспензий культур микроорганизмов и 48 проб биологического материала и объектов окружающей среды (ПО положительных проб) содержащих F. tularensis подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica, novicida в о концентрации 1x10 м.к./мл положительный результат получен во всех ПО случаях. Диагностическая чувствительность - не менее 97,5% с доверительной вероятностью 90 %. Диагностическая специфичность - при исследовании ПО положительных образцов, содержащих туляремийный микроб разных подвидов, положительный результат получен во всех ПО случаях, при исследовании 60 отрицательных образцов, содержащих гетерологичные микроорганизмы в л концентрации не менее 1x10 м.к./мл, отрицательный ответ в ПЦР получен во всех 60 случаях. Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90%. --- стр. 8 --- 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ Работу проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безо пасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нук леиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляре мией». Потенциальный риск применения набора — класс 3 (п. 9 приложения № 2 к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н). 4.1 Необходимость обучения персонала Для выполнения анализа с помощью данного набора реагентов необхо димо участие специалиста с высшим медицинским образованием, прошедшего обучение на лицензированных курсах специализации по работе с ПБА I-II групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также лаборанта со средним спе циальным медицинским образованием. Персонал должен иметь навыки работы с биохимическими реактивами и современным лабораторным оборудованием. 4.2 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора Все компоненты набора в используемых концентрациях являются неток сичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для лаборато рий: - пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные ха латы; - не принимать пишу, пить или курить в лабораторных помещениях; - после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом. Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попа дании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов за медицинской помощью следу ет обратиться немедленно. 8 --- стр. 9 --- 4.3 Необходимые меры предосторожности в отношении влияния фи зических факторов При использовании набора реагентов нет необходимости принимать ме ры предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних элек трических воздействий, электростатических разрядов, давления или перепадов давления, перегрузки, источников термического воспламенения. 4.4 Необходимые меры предосторожности против специальных рис ков При использовании набора реагентов нет необходимости принимать ме ры предосторожности против любых специальных рисков при использовании или реализации, поскольку в состав изделия не входят вещества человеческого или животного происхождения с учетом их потенциальной инфекционной при роды. 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ 5.1 Рекомендуемое измерительное оборудование Прибор для ПЦР-РВ - зарегистрированный в РФ как медицинское изделие и имеющий каналы детекции, соответствующие красителям FAM, R6G, ROX, Су5 (либо их спектральным аналогам) со следующими характеристиками - А.макс.возб/^акс.эм. (№1 - 490нм/520нм, №2 - 525нм/550нм, №3 - 550нм/580нм, №4 - 630нм/665нм), например, «АНК-32 (32М, 48)», «CFX-96». 5.2 Указания о необходимости использования специального оборудования Работу с набором следует проводить в настольном боксе с бактерицидной лампой (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», г. Миасс, Россия), установленном в рабочей зоне 3 (МУ 1.3.2569-09). 5.3 Дозирующие устройства Набор автоматических пипеток переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 10-100 мкл и на 20-200 мкл; --- стр. 10 --- штатив-карусель для данных пипеток. 5.4 Другое используемое оборудование Микроцентрифуга-вортекс (например, «Циклотемп-901»); микроцентрифуга для стрипов (например, «Циклотемп-903»); штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 и 1,5 мл; штатив для работы со стрипами (кат. номер СТ-15, ЗАО Синтол); холодильник на 2-8 °С. 5.5 Лабораторная посуда Емкости для сброса наконечников и микропробирок. 5.6 Материалы и реагенты, не входящие в состав набора Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 10 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 20 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл; набор реагентов для выделения ДНК/Р1Ж; ТЕ-буфер (кат. номер В-014, ЗАО «Синтол»); отдельный халат и одноразовые медицинские перчатки; комплект средств для обработки рабочего места. 6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ Получение и обработка биологического материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителем туляремии не являются частью процедуры анализа с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин- Туляремия-РВ». 6.1 Тип исследуемых образцов В соответствии с МУ 3.1.2007-05 материалом для исследований служит: суспензии культур туляремийного микроба или подозрительных изолятов; пунктаты бубона, отделяемое язв, мазок из носоглотки, кровь, мокрота. 10 --- стр. 11 --- промывные воды бронхов - от больных или подозрительных на заболевание людей; увеличенные лимфатические узлы, измененные участки легких и селезенки - от умерших людей. При эпизоотологическом обследовании исследуют органы грызунов, зайцеобразных, остатки пиш;и из гнезд хищных птиц, их погадки, экскременты грызунов и хищников, членистоногих (преимущественно иксодовых клещей) и кровососущих насекомых (вшей, клещей, блох, комаров, слепней), объекты внешней среды (солома, фураж, вода из естественных и искусственных водоемов, ил, гидробионты, содержимое нор грызунов и другие). 6.2 Процедура получения и предварительной подготовки биологиче ского материала и проб из объектов окружающей ереды Все работы по забору проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроор ганизмами I-II групп патогенности (опасности)», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбо ра и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы ам плификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим мик роорганизмы I-IV групп патогенности», МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией». 6.2.1 Взятие материала от человека Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью одноразовой иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Vacuett» с ЭДТА или цитратом натрия либо стерильным шприцем в стерильные стеклянные или пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9) Аккуратно перемешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом. Мокроту забирают в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл. Для разжижения мокроты применяют либо 11 --- стр. 12 --- приготовленную ex tempore смесь NALC (М-ацетил-Ь-цистеина 0,25 г, 25 мл 4 % раствора NaOH, 25 мл 0,1 М тризамещенного натрия цитрата), либо раствор «Муколизин» (Na2HP0 4 0,0774 М, NaH2P04 0,0226 М, бетаМЭ 0,094 М, 5 % азид натрия в конечной концентрации 0,05 %). Пробу объемом 1-2 мл смешивают либо с равным объемом смеси NALC, либо с пятикратным объемом раствора «Муколизин». Пробы со смесью NALC перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 15 мин, периодически встряхивая. Затем разводят 0,067 М фосфатным буфером (pH 6,8) до конечного объема 50мл. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 9000 об. мин'*. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Пробы с раствором «Муколизин» перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 20-30 мин, периодически встряхивая. Затем отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Для получения промывных вод бронхов при бронхоскопии вводят до 7 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. После чего 2-3 мл лаважной жидкости отбирают в стерильную пробирку. Из пробы отбирают 1 мл в 1,5 мл чистую пробирку, центрифугируют при 12000 об.-мин'* в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Взятие мазка из носоглотки проводят натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды. Корень языка придавливают шпателем, материал берут сте рильным зондом, не касаясь языка, слизистой полости рта, зубов, и помещают в пробирку с транспортной средой или 0,9 % раствором натрия хлористого объе мом 100 мкл. Забор материала язвы или бубона производят стерильным шприцем. Если бубон имеет сохранившуюся кожу (невскрывшийся бубон), то ее проти рают предварительно спиртом. Пункцию бубона производят как в его центре, так и на периферии. Из вскрывшегося бубона материал забирают в местах с со- 12 --- стр. 18 --- Для определения эффективности выделения ДНК из исследуемого материала в каждую пробу на этапе ее подготовки к анализу добавляют внутренний положительный контроль выделения (ВПК-В) из состава набора реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ». Для его приготовления в пробирку с сухим содержимым ВПК-В вносят 200 мкл элюента из состава наборов реагентов для выделения, перемешивают на вортексе до полного растворения, центрифугируют 5 секунд при 3000 об-мин'*. Полученный раствор ВПК-В добавляют по 10 мкл во все пробирки с исследуемыми образцами после их обеззараживания и в пробирку с ОКО-В. При применении на этапе пробоподготовки наборов производства ЗАО «Синтол» добавления ВПК-В для контроля выделения нуклеиновых кислот не требуется, поскольку он входит в состав лизирующего компонента. 7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1 Процедура приготовления положительного контрольного образца В пробирку с сухим содержимым ПКО-Туляремия из набора реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» добавляют 200 мкл ОКО, перемешивают на вортексе до полного растворения, центрифугируют 5 секунд при 3000 об-мин'\ Хранение разведенных препаратов ПКО-Туляремия допускается при температуре не выше минус 20 °С не более месяца. 7.2 Разведение препарата ДНК (при необходимости) Для выявления и идентификации ДНК возбудителя туляремии необходимо внести в реакцию 20 мкл препарата ДНК. В случае необходимости, раствор препарата ДНК разводят с помощью ТЕ-буфера. При исследовании чистых культур микроорганизмов, препараты ДНК, выделенные из 100 мкл бактериальной суспензии с концентрацией пх10^м.к.-мл’\ разводят в 100 раз с помощью ТЕ-буфера. 18 --- стр. 19 --- 7.3 Проведение ПЦР Расход каждого реагента На одну постановку ПЦР-РВ (без учета повторов) требуются: 1 пробирка - для ОКО; 1 пробирка - для ОКО-В; 1 пробирка - для ПКО; необходимое количество пробирок по числу исследуемых образцов. На каждый анализ расходуется: 20 мкл ПКО-Тул; 20 мкл ОКО. Последовательность проведения этапов анализа Анализ с помощью набора реагентов проводится в один этап: - включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией по эксплуатации; - вводят согласно таблице 1 в диалоговый интерфейс программы ампли- фикатора параметры температурно-временного режима ПЦР-РВ и вводят кра сители FAM, R6G, ROX и Су5; Таблица 1 - Температурно-временной режим амплификации № Т емпературно-временной Число п/п режим циклов 1 95 °С - 300 секунд 1 2 62 °С - 40 секунд 503 95 °С - 15 секунд - вводят сведения об образцах по соответствующему красителю (при ис пользовании прибора «АНК32 (32М, 48)» ввод сведений об образцах возможен после запуска программы амплификации) и активируют прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации; - набор реагентов извлекают из холодильника, РБ, ОКО перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 секунд при 3000 об-мин'*; 19 --- стр. 20 --- - устанавливают необходимое количество микропробирок с реакционной смесью РС-Тул в штатив (количество микропробирок соответствует числу исследуемых проб и контрольных образцов: ПКО, ОКО, ОКО-В) и маркируют в соответствии с протоколом исследования на боковой стенке, либо на крышке пробирки (в зависимости от прибора); - открывают крышки микропробирок и вносят в них по 15 мкл РБ; - используя наконечники с аэрозольным барьером последовательно вносят в микропробирки согласно их маркировке по 20 мкл ОКО, ОКО-В и исследуемых образцов, в необходимой повторности*, закрывают крышки дан ных микропробирок. - вносят в микропробирку с маркировкой ПКО 20 мкл ПКО-Тул, закрывают крышку микропробирки. - перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и центрифугируют 5 секунд при 3000 об-мин'* Помещают микропробирки в прибор для ПЦР-РВ в соответствии с таблицей 2 и прикатывают крышки микропробирок. Таблица 2. Порядок исследования образцов № ячейки Образец 1 ОКО 2 ОКО-В 3 ПКО 4 исследуемый образец 1 5 исследуемый образец 1 6 исследуемый образец 2 7 исследуемый образец 2 8 - закрывают крышку прибора, запускают реакцию ПЦР-РВ и фиксируют в рабочем журнале название файла с результатом работы прибора (расчетное время анализа составляет около 2-х часов). * Примечание: каждый образец рекомендуется анализировать в двух по вторах. 20 --- стр. 21 --- 7.4 Процедура измерения результатов анализа Оценку результатов проводят с помощью приборов для ПЦР-РВ, напри мер, «АЬЖ-32 (32М, 48)», «СРХ-96» или эквивалентных им (см. п. 5.1 настоя щей инструкции). Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции (регистрация роста сигнала) означает любую величину порогового цикла Ct менее 50. Отсутствие регистрации роста сигнала прибором описывается программой прибора, на пример, как величина порогового цикла (Ct > 50 в приборах «АНК»), либо как ее отсутствие (N/A в приборах фирмы «BioRad») и т.п. Подробная информация приведена в руководстве по эксплуатации конкретного прибора. Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналам FAM, R6G и ROX относительно отрицательного контроля свидетельствует о наличии специфических фрагментов ДНК F.tularensis в данной микропробирке. Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналу Су5 в слу чае отсутствия роста сигнала по каналам FAM, R6G и ROX свидетельствует об успешном прохождении реакции ПЦР-РВ и подтверждает отсутствие специфи ческих фрагментов ДНК F.tularensis в данной микропробирке. При этом нали чие сигнала флуоресценции в данной микропробирке по каналу Су5 с порого вым циклом Ct менее 31,0 в сравнении с сигналом флуоресценции по каналу Су5 ОКО (Ct > 35), также свидетельствует об успешном выделении ДНК. 7.5 Учет результатов реакции 7.5.1. Оценка амплификации ВПК-В Регистрация в пробирке с ОКО-В роста сигнала флуоресценции по каналу Су5 с пороговым циклом Ct менее 31,0 свидетельствует об успешном выделении ДНК внутреннего положительного контроля в пробирке ОКО-В (рисунок 2). Регистрация в пробирках с исследуемыми образцами сигнала флуоресценции по каналу Су5 пороговым циклом Ct менее 31,0 свидетельствует об успешном выделении ДНК в пробирках с исследуемыми образцами. 21 --- стр. 25 --- 8 РАСЧЕТЫ 8.1 Используемые компьютерные программы Для проведения ПЦР-РВ и оценки её результатов используют специали зированное программное обеспечение, поставляемое производителем прибора, например программа А1Ж_8Ье11 версия 33 и выше, поставляемая с приборами «АНК-32М», «АНК-48» или Bio-Rad CFX Manager 2.0 и выше, поставляемая с прибором CFX-96. Работу с программным обеспечением осуш,ествляют соглас но руководству по эксплуатации прибора. 9 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУА ТАЦИИ НАБОРА 9.1 Условия хранения набора В соответствии с ТУ 9398-016-46395995-2013 — в сухом, заш,ищенном от света месте при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Суммарный срок хране ния при температуре от плюс 9 до плюс 20 °С не должен превышать 14 суток в течение срока годности набора реагентов. 9.2 Условия транспортирования набора Транспортирование набора реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» долж но производиться в соответствии с ТУ 9398-016-46395995-2013 крытым транс портом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Допускается транспортирование до 14 суток при тем пературе до 20 °С. 9.3 Срок годности набора Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев с даты выпуска предприятием-изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком год ности применению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов соответст вует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Срок годности разведенных препаратов ПКО-Тул не более месяца при температуре хранения не выше минус 20 °С. 25 --- стр. 26 --- 9.4 Информация по безопасной утилизации Использованные пробирки с ампликонами, наконечники, перчатки, ве тошь для обработки поверхностей в ПЦР-боксе, собирают в пластиковые за крывающиеся емкости, выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предна значенное вспомогательное помещение (МУ 1.3.2569-09) с целью последующей инактивации согласно требованиям СанПиН 2.1.7.2790-10. Наборы с истекшим сроком годности, а также в случае повреждения упа ковки, утилизируют по классу А, как эпидемиологически безопасные отходы, по составу приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10). 9.5 Гарантийные обязательства производителя Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и экс плуатационной документации, в течение установленного срока годности (12 месяцев) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» направлять на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, тел. (495) 984-69-93, факс. (499) 977-74-55 E.mail: syntol@syntol.ru). При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по при менению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и меди цинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется напра вить сообщение на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» по адресу, ука занному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую органи зацию в соответствии с действующим законодательством. Директор ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора академик РАН, д.м.н., профессор «)|йВ^В. Кутырев 26 --- стр. 27 --- прошито, пронумеровано, проброшюровано листов