Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000, с принадлежностями — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- «УТВЕРЖДАЮ» Зам. генерального директора ООО «Био-Рад Лаборатории» / Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 Руководство по эксплуатации B I O - R A D --- стр. 2 --- 1. Введение............................................................................................................ 1 Платформа Bio-Rad серии 1000......................................................................1 Исполнения термоциклера серии 1000, их характеристики.... .....1 Рабочие характеристики и свойства термоциклера 1000 ..........................2 Ресурсы и справочная информация Bio-Rad................................................2 Условные обозначения, используемые в данном руководстве................4 2. Начало работы..............................................................................................6 Установка термоциклера 1000 ........................................................................ 6 Общее представление о термоциклере 1000...............................................7 Вид спереди без реакционного модуля ...................................................8 Вид сверху с реакционным модулем..............................................................8 Задняя панель базового блока термоциклера............................................. 9 Панель управления и главное меню..............................................................9 Функции клавиш панели управления .......................................................... 10 Главное меню...................................................................................................11 USBA-порт....................................................................................................... 11 Библиотека файлов................................................................................... 11 Регистрация в системе термоциклера 1000 и выход из системы .......14 Переименование термоциклера 1000 ........................................................ 15 3. Реакционные модули................................................................................. 17 Сменные реакционные модули.................................................................... 17 Вставка и извлечение реакционного модуля..............................................18 Вставка реакционного модуля......................................................................18 Извлечение реакционного модуля...............................................................19 Работа с регулируемой крышкой..................................................................20 Открывание крышки....................................................................................... 20 Закрывание крышки и регулировка усилия зажима крышки...................23 Загрузка сосудов с пробами в блок..............................................................24 Руководство для термоциклера 1000 С о д е р ж а н и е ______________________________________________________ --- стр. 3 --- 4. Автоматический генератор протоколов................................................25 Общее представление об автоматическом генераторе протоколов... 25 Создание протокола при помощи автоматического генератора протокола.......................................................................................................26 Автоматический генератор протоколов дополнительная информация ................................................................. 31 Калькулятор Та - Дополнительная информация ..................................32 5. Выполнение протоколов..........................................................................34 Запуск протокола с помощью клавиши RUN (выполнить) ....................34 Контроль выполнения протокола с помощью клавиш STATUS и VIEW .........................................................................................................................38 Контроль с помощью клавиши V IE W ......................................................39 Контроль нескольких блоков с помощью клавиши STATUS ..............39 Приостановить и продолжить выполнение протокола с помощью кнопки Pause..................................................................................................43 Пропустить этапы с помощью кнопки Skip Step......................................44 Отмена выполнения с помощью кнопки Cancel Run ..............................45 Инкубация пробы с помощью клавиши INCUBATE ................................47 6. Создание и редактирование протоколов..............................................50 Открытие нового или существующего протокола ................................50 Изменение параметров на этапе температурного воздействия .........51 Изменение заданной температуры и времени выдержки ..................52 Добавить и удалить температурный градиент ......................................53 Добавить и удалить температурное приращение..................................54 Добавить и удалить скорость линейного нарастания ..........................56 Добавить и удалить время Extend (продления) ...................................57 Добавить и удалить звуковой сигнал ...................................................... 59 Изменение параметров на этапе GOTO (перехода).............................. 60 Вставить и удалить этап............................................................................. 62 Вставить этап протокола............................................................................ 62 Удалить этап протокола........................................................................... 64 Присвоение имени протоколу.....................................................................65 Присвоение имени новому протоколу.....................................................65 Переименование существующего протокола........................................66 Изменение объема пробы и температуры крышки................................ 67 Сохранение протокола............................................................................. 70 Сохранить отредактированный протокол................................................71 Выбор объема пробы и температуры крышки.........................................72 Режим терморегулирования................................................................... 73 Выбор температуры крышки......................................................................73 7. Оптимизация ПЦР-анализа с помощью 1000™....................................74 Оптимизация для ускорения протокола................................................... 74 Оптимизация температуры на этапе гибридизации с помощью градиента.......................................................................................................76 Оптимизация режимов работы с малыми объемами проб ...................77 Перенос протоколов с другого термоцикпера.........................................78 Выявление и устранение проблем ПЦР-анализа ...................................78 Лабораторный инвентарь: микропланшеты, пробирки, уплотнители и колпачки.........................................................................................................79 Руководство для термоциклера 1000/содержание --- стр. 4 --- 8 Папки и файлы протокола.............................................................................82 Содержание файла протокола .................................................................... 82 Опции для этапов температурного воздействия и градиента................84 Управление файлами и папками протокола..............................................85 Создание и копирование папок, переименование термоциклеров .....86 Создание папки ....................................................................................... 86 Копирование всего содержимого..........................................................89 Переименование термоциклера............................................................90 Копирование, перемещение, удаление и переименование папок ......90 Перемещение папки.......................................................................................91 Копирование папки.........................................................................................92 Удаление папки............................................................................................... 92 Переименование папки................................................................................. 92 Копирование, перемещение, удаление и переименование протоколов .......................................................................................................................... 94 Копирование протокола................................................................................ 94 Перемещение протокола..............................................................................96 Удаление протокола.......................................................................................96 9 Техническое обслуживание и устранение неисправностей ....................96 Очистка и содержание в исправном состоянии термоциклера 1000... 96 Очистка основания термоциклера 1000 .....................................................97 Очистка модулей обратной связи...............................................................98 Обеспечение достаточного воздушного потока .......................................99 Проведение испытаний относительно достаточного воздушного потока .......................................................................................................................... 99 Установление недостаточного воздушного потока ..............................100 Замена плавких предохранителей..........................................................100 Устранение неполадок при появлении сообщений об ошибках термоциклера.............................................................................................. 102 Повторный запуск после отключения питания .....................................102 Сообщения об ошибках и предупреждения...........................................102 10 Расширенные функции.........................................................................107 Меню сервисных программ и функции ................................................... 107 Функция калькулятора градиента............................................................103 Меню настроек администратора.............................................................103 11. Термоциклер cepyin СЮОО Touch™ 12. список принадлежностей с описанием --- стр. 5 --- Термоциклер 1000 - Руководство 1. Введение Поздравляем вас с приобретением термоциклера 1000™, который является основным компонентом платформы термоцикпирования Bio-Rad® серии 1000 для выполнения полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) и ПЦР-анализа в режиме реального времени (real time PCR). Прибор отличается большой теплопроизводительностью в сочетании с непревзойденной гибкостью и способностью к расширению возможностей, поэтому он с успехом может использоваться как в маленьких, так и в больших лабораториях. Данная глава включает в себя знакомство с термоцикпером 1000 и т.д., в том числе: • Знакомство с платформой термоциклеров серии 10 О О (ниже) • Знакомство с особенностями и рабочими характеристиками термоциклера 1000 • Ресурсы компании Bio-Rad Laboratories для поддержки ПЦР-анализа • Условные обозначения, применяемые в данном руководстве Платформа Bio-Rad серии 1000 Партия контрольно измерительных приборов для ПЦР серии 1000 представляет собой гибкую и модульную платформу, проявляющую лучшие в своем классе рабочие характеристики и свойства в простой и надежной в использовании комплектации. Платформа серии 1000 проектируется в соответствии с вашими рабочими условиями посредством последовательной интеграции ваших производственных операций с такими функциями, как температурная оптимизация, сочетаемость сосуда и уплотнителя, опции программирования, онлайновая поддержка и возможность подключения с помощью USB портов. Исполнения термоциклера серии 1000, их характеристики С 1000 S 1000 Дисплей ЖК, 12x9 см, цветн. с высоким разрешением ЖК, черно-белый Размеры 13x18x8 см 13x18x8 см Вес 10,4 кг 10,4 кг Модернизация (возможность работы с оптическим реакционным модулем) Возможна за счет присоединения 6-канального CFX модуля Не возможна Количество образцов 96 для реакционного модуля 96x0.2мл, 384 для реакционного модуля 384x15мкл 96 для реакционного модуля 96х0.2мл, 384 для реакционного модуля 384x15мкл Диапазон температур 0- 100°C 0-100°С Способ нагревания и охлаждения термоблока Элементы Джоуля-Пельтье Элементы Джоуля-Пельтье Диапазон временных интервалов 00:01 - 99:59 мин 00:01 - 99:59 мин Точность поддержания температуры (Через ЗОсек после установления 90 °С) ± 0.3°С ± 0.3°С Неравномерность поддержания температуры по планшету (через Юсек после установления 90 °С) ± 0.4°С ± 0.4°С Наличие градиента температур в термоблоке Есть (1-24 °С) Есть (1-24 °С) --- стр. 6 --- Рабочие характеристики и свойства термоциклера 1000 Термоциклер 1000 является основополагающим элементом платформы серии 1000. Он отличается большой производительностью и интуитивной простотой использования в качестве автономного термоциклера, с применением новейших функций, таких как автоматический генератор протоколов (Protocol Autowriter). Свойства термоцикпера 1000: • Надежные результаты с точным терморегулированием: постоянство температуры блоков с пробами +0.4°С при 90°С после 10 секунд с погрешностью +0.2°С; регулируемая температура крышек для дальнейшего регулирования температуры реакции и предотвращения выпаривания. • Гибкие сосуды со сменными реакционными модулями: просто замените реакционный модуль, если вам необходимы блоки с 48, 96, или 384 лунками на базе того же термоциклера. • Единообразное и повторяемое уплотнение микропланшетов при регулируемом усилии зажима крышки. • Автоматическое создание заказных протоколов с помощью функции автоматический генератор протоколов (Protocol Autowriter): Создание протоколов на основании параметров, заданных пользователем. • Легко модифицируется до 5-цветной, 6-канальной системы реального времени: с оптическим модулем реального времени CFX. • Сокращенное время выполнения протоколов: Система 1000 обеспечена превосходной термодинамикой для сокращения времени выполнения и получения срочных результатов. • Зашифрованные журналы регистрации и уведомления о достоверности информации: Простое соответствие надлежащей лабораторной практике (GLP) при каждом прогоне с автоматическим созданием синхронных протоколов, системных журналов и уведомлений о достоверности информации. Выборочный административный контроль во время пользовательского доступа. • Предварительно установленные настраиваемые протоколы для использования в качестве образцов: Составление протокола бьютродействия посредством настраиваемых предварительно установленных протоколов. • Готовность к высокой производительности: Управление термоциклерами в количестве до 32. Использование устройства считывания штрихового кода и опции подтверждения правильности температуры для контроля потока данных и качества. • Температурные градиенты: Оптимизация проведения реакции с использованием температурных градиентов через блоки с пробами. • Большой цветной экран: отображение и управление посредством интуитивно понятного интерфейса пользователя, полноцветной графики и текста. Термоциклер 1000 - Руководство! Введение Ресурсы и справочная информация Bio-Rad Компания Bio-Rad Laboratories предоставляет для ученых множество ресурсов. Следующие веб-сайты содержат полезную информацию по проведению ПЦР-анализа: • Gene Expression Gateway (межсетевой шлюз экспрессии генов) (www.bio rad, com/qenomics/) Этот сайт предоставляет обширные технические ресурсы по широкому выбору методик и использованию, касающиеся ПЦР и ПЦР реального времени. Данный сайт, также отличается наличием инструментария, ссылок, технической поддержки и ресурсов по выявления и устранению неисправностей. • Веб-сайт Life Science Research (изучение науки о жизни) (discover.bio-rad.com) Данный сайт включает в себя ссылки на технические комментарии, руководства, информацию о товарах и техническую поддержку. Щелкните по следующим ссылкам для того, чтобы скачать или запросить копию данного руководства или другой литературы компании Bio-Rad Laboratories: • 1Целкните по иконке PDF для того, чтобы скачать копию формата PDF и открыть ее с помощью программы Adobe Acrobat Reader (www.adobe.com). • Щелкните по иконке папки и закажите печатную копию. --- стр. 7 --- Термоциклер 1000 - Руководство] Введение • Щелкните по иконке FAX для заказа копии, присылаемой по факсу. • Свяжитесь с вашим местным офисом компании Bio-Rad Laboratories по телефону для заказа печатной копии документа. Для Соединенных Штатов и Канады можно позвонить потел. 1-800-424-6723 (бесплатный звонок), и выбрать материал по интересующему вас предмету. Используйте следующие ресурсы для определения того, что вам необходимо: Ресурс Как связаться Местные представители компании Bio-Rad Laboratories Найдите местную информацию и контакты на веб-сайте компании Bio-Rad Laboratories, выбрав вашу страну на главной странице (www.bio-rad.com). Также, из междунаоодных офисов, перечисленных на обратной стороне данного руководства, установите ближайший. Технические комментарии и литература Зайдите на сайт Gene Exoression Gateway (www. bio rad.com/genomics/) и поместите поисковое окно в верхнем правом углу веб-станицы. Впечатайте поисковый термин в этом окне для получения ссылок на продукцию, технические комментарии и руководства. Специалисты по техническим вопросам Компания Bio-Rad Laboratories предоставляет квалифицированную техническую поддержку. Сотрудники нашего отдела Технической поддержки - квалифицированные научные работники, предоставляющие нашим заказчикам практические и квалифицированные решения. Для того чтобы получить в веб-сети техническую поддержку, зайдите на сайт Gene Expression Gateway (www.bio-rad.com/aenomics). Для того чтобы получить местную техническую поддержку, свяжитесь с ближайшим офисом компании Bio-Rad Laboratories, Для получения технической поддержки в США и Канаде, наберите 1-800-424-6723 (бесплатный звонок), и выберите вариант технической поддержки. --- стр. 25 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Реакционные модули 1 . Закройте крышку Опустите рычаг вниз и удостоверьтесь в том, что передняя часть крышки прочно вошла в корпус, и закройте рычаг по месту: Рычаг крышки 2, Настройка усилия зажима крышки Поворачивайте зажимную головку для настройки усилия зажима крышки: • Для увеличения усилия зажима поверните головку на 1/4 оборота по часовой стрелке (вправо). • Для уменьшения усилия зажима, поверните головку на 1/4 оборота против часовой стрелки (влево). Настройка одной и той же силы зажима крышки каждый раз устанавливается путем поворота головки в одно и то же положение. Обратите внимание, позиционные отметки на крышке указывают 1/4 поворота. Зажимная головка Загрузка сосудов с пробами в блок При использовании малого числа пробирок, они должны быть расположены в центре блока для обеспечения однородного термоцикпирования всех проб. Также, поместите хотя бы по одной пустой пробирке в каждом уголу блока для обеспечения того, чтобы крышка оказывала равномерное давление на пробирки с пробами. Для обеспечения равномерного нагрева и охлаждения проб, должен обеспечиваться полный контакт сосудов с блоком. Соответствующий контакт будет гарантирован, если следующие условия всегда будут соблюдаться: • Блок должен быть очищен перед загрузкой в него проб • Плотно вставляйте отдельные пробирки или микропланшеты в лунки блока Совет: При использовании всего одной или нескольких пробирок, используйте планшет для пробирок (номер по каталогу 184-7000) для обеспечения дополнительной поддержки. 21 --- стр. 26 --- Термоциклер 1000 - Руководство 4. Автоматический генератор протоколов Термоциклер 1000™ оборудован автоматическим генератором протоколов. Автоматический генератор предоставляет альтернативный метод программирования, основанный на характеристиках ампликона и на праймерах, а так же на требуемой скорости реакции. Прочитав данную главу, вы узнаете больше о следующих темах: • Общее представление об автоматическом генераторе протоколов (ниже) • Написание протокола с помощью автоматического генератора протоколов (стр. 24) • Дополнительная информация по автоматическому генератору протоколов и калькулятору Т а (Та Calculator) (стр. 29 и стр. 30, соответственно) Общее представление об автоматическом генераторе протоколов _ Автоматический генератор протоколов использует информацию по вашей реакции и 9 автоматически пишет протокол. Введите следующую информацию по вашему ПЦР- анализу: • Праймеры: Введите температуру гибридизации реакции (т^) для используемых праймеров. Если температура гибридизации вами не установлена, введите последовательность праймеров в Т а C a l c u l a t o r (калькулятор Та), и автоматический генератор рассчитает Т а. Примечание: Температура Т а устанавливается исходя из информации праймера Тт, на основании выбранного фермента и выбранной скорости протокола. • Длина ампликона: введите ожидаемую длину продукта ПЦР-анализа. • Тип фермента: Введите фермент полимеразы ДНК (iTaq™, iProof™, или другой). Если вы используете фермент отличный от полимеразы ITaq или iProof, введите дополнительную информацию, включающую период активации горячего запуска и время итогового удлинения. 1 . Скорость выполнения: Выберите скорость реакции (Стандартная, Быстрая, Супербыстрая). Автоматический генератор протоколов оптимизирует протоколы в зависимости от выбранной вами скорости. Например, типовой протокол ПЦР ^ вкпючает три следующие серии этапов, полное время выполнения занимает от 1,5 до 2,0 часов: 2. Денатурация исходной матрицы и активация фермента (95°С в течение 3-10 мин.). 3. Циклы для трех данных этапов температурных воздействий (30-40 циклов): • Денатурация матрицы (94-95°С в течение 15-30 сек.) • Гибридизация праймеров (гибридизировать в течение 15-30 сек.) • Удлинение продукта (72°С в течение 15-60 сек.) 4. Итоговое удлинение (72°С в течение 10 мин.). 22 --- стр. 27 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Автоматический генератор протоколов Полное время определяется числом этапов и циклов, периодом инкубации на каждом этапе и временем, требуемым для получения однородности при достижении заданной температуры. Для уменьшения общего времени выполнения, генератором протокола выполняются одно или несколько следующих изменений: • Уменьшение общего количества этапов протокола (для вьюоких праймеров, этапы гибридизации и удлинения могут быть объединены в один этап). • Уменьшение количества циклов • Сокращение времени выдержки на каждом этапе температурного воздействия • Сокращение времени линейного изменения между этапами путем уменьшения температурного изменения от одного этапа к другому Например, автоматический генератор протоколов может выполнить следующие изменения по укорачиванию протокола: • Изменение условий этапа денатурации исходной матрицы и активации фермента с 95°С в течение 3 минут на 98°С в течение 30 секунд • Изменение условий этапа денатурации для каждого цикла с 95°С в течение 30 секунд на 92°С в течение 1 секунды • Объединить гибридизацию и удлинение в один этап при 70°С в течение 20 секунд. Создание протокола при помощи автоматического генератора протокола Выполняйте следующие действия для запуска генератора протоколов и создания нового протокола: 1 . Нажмите клавишу генератора протокола на запустит генератор протокола в работу. 2. Введите температуру гибридизации в °С и длину ампликона в парах оснований Если вам не известна температура гибридизации, подходящая для ваших праймеров, выберите кнопку Т а Calc (F1), введите последовательность праймеров, используя кнопки А, G, С, и I, затем нажмите C a l c u l a t e (вычислить). Генератор рассчитает значения праймеров и соответствующую температуру гибридизации (Та). Нажмите ок ( F 4 ) для возвращения к главному экрану генератора. Примечание: Та Calculator (калькулятор Та) определяет температуру гибридизации для стандартной скорости с полимеразой iTaq. Различные режимы скорости фермента автоматически отрегулируют Т а . Дополнительную информацию о работе Та calculator (калькулятора Та) можно найти в разделе «Та Calculator (калькулятор Та) - исходные данные» на стр. 30. 3. Выберите нужный фермент нажатием клавиш со стрелками U P (вверх) и d o w n (вниз), затем нажмите ENTER (ввод) 4. В заключение выберите N e x t (следующий), чтобы перейти к экрану Run Time (период выполнения) Используйте клавиши со стрелками R IG H T (вправо) и l e f t (влево) для выбора нужной скорости реакции на линейке с ползунком. Примеры использования автоматического генератора: 23 --- стр. 28 --- Создание протокола с помощью автоматического генератора протоколов А. Температура гибридизации известна • Исследуемый ампликон успешно амплифицирован при температуре гибридизации 52°С; его длина составляет 494 пар оснований • На первом экране генератора протоколов [«Введите заданное значение/фермент (требуемый)»] •Введите 4 9 4 в окне Amplicon Length (длина ампликона), затем стрелка d o w n (в н и з ) и л и E N T E R (ввод) для перехода к окну Annealing Temperature (температура гибридизации) •Введите 52 в окне Annealing Temperature (температура гибридизации); затем стрелка R I G H T (вправо) или E N T E R (В В О Д ) Д Л Я перехода К ОПЦИЯМ ферментов. •По умолчанию выбран "iTaq". Если должен использоваться "iProof - стрелка d o w n (вниз) к iProof Amplicon Length Annealing Temperature ‘ 494 bp О iT a q ( 3 other ‘ Enter Annealing temperature or use the Та Calculator. The Annealing Temperature will be automatically adjusted based on enzyme and speed selections. О IProof enzyme adds +3*0 to Annealing Temp Примечание: при выборе iProof к температуре гибридизации автоматически добавляется 3°С. •При выборе "Other" (другой), появляются дополнительные опции, например период горячего запуска M i Amplicon Length Annealing Temperature ‘ Values/Enztf m e 494 52.0 bp °c о iTaq Q IProof ® other triHltlona! ParametBrs ДиЦсидйГ Temp Gradient Range Hot Start Activation Final Extension °C s s о Enter required values and any desired optional values 24 --- стр. 29 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Автоматический генератор протоколов Нажмите F 2 (N e x t - следующий), чтобы перейти к экрану скорости реакции. Заданный размер, температура гибридизации и выбранный фермент перечислены через всю верхнюю часть экрана. rotocof AutoWrtcerЕ ....... ............ Target: 494Ь р A nneal; 53°С E nzym e: Proof Standard! lifitrafast ( 0 ) Estimated Run Time: 00:57;СЮ . Sel«ct spe e d s e ttin g u sin g le ft a n d rig h t anowsj P re ss VIEW lo s e e beieci sp e e o th e p ro to c o l •Выберите нужную скорость, используя клавиши со стрелками r i g h t (вправо) и l e f t (влево); обратите внимание на изменение температуры гибридизации и предполагаемого полного времени выполнения в зависимости от изменения скорости. Используемая в программе температура гибридизации будет на 4°С ниже средней температуры праймера Т^ для режима Standard Speed (стандартная скорость), на 2°С ниже средней температуры праймера Т п, для режима Fast (быстрый), а для режима UltraFast (супербыстрый) будет использоваться средняя температура праймера без поправок. Эти периоды отображаются на экране выбора скорости так же, как и на дисплейных экранах последующих программ. Выберите F2 (N e x t - следующий) Протокол автоматического генератора теперь отображается в графическом формате 1 2 3 ; 4 ^ S ( i 98.0 С 98.0 С bi3o # 1 1 72.0 С 72.0 С I \S5.0 С •/0:08 s S lO O i O ilO 0 T 0 1 г 29 I ,4.0 с . Use the keypad to enter uilues a n d navigate ' th ro ugh the p ro to co l s te p s. Fomver Esti OOi«iOO 25 --- стр. 31 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Автоматический генератор протоколов Затем нажмите F2 c a l c u l a t e ( в ы ч и с л и т ь) . каждого праймера, среднее для значений Т щ и температура гибридизации (Та) вычисляются и отображаются на экране Forward Prim er Reverse Prim er M) О Entar d«sir«d values: CTG GAG CCT TCA GTT GCA G GAA GAT GG T GAT G G G AAT TC Forward Tm ; Reverse Tm : 59.7 "C Average of Drimer Tm 's S8.3 ® C а й ш й а а а й • Обратите внимание, если отклонения значений Т щ праймера больше 4°С, то генератор А использует нижнее значение праймера T m +2°С в качестве основы для расчета Т а, которая может быть в дальнейшем изменена выбором фермента и скорости реакции Примечание: Калькулятор Т а определяет температуру гибридизации для стандартной скорости с полимеразой iTaq. Различные режимы скорости фермента автоматически отрегулируют Т д . • Нажмите ок для перехода к главномцу экрану автоматического генератора • Знкачение Т а из предыдущего экрана автоматически переносится в окно температуры гибридизации (Та) • Продолжайте аналогично указанному выше в примере А. Ампликон, используемый в данном примере, состоит из последовательности глицеральдегидфосфатдегидрогеназы генома человека (GenBank асс № J04038) 5. Анализ протокола и добавление опции Просмотрите новый протокол в графическом виде. Для перехода к текстовому редактированию нажмите клавишу v i e w ( в и д) . Для того, чтобы добавить опции к выбранному этапу протокола, нажмите кнопку O p t i o n s (опции) (F 4 ) и л и нажмите D e l e t e (удалить) (F3) для удаления выделенного этапа, или I n s e r t (вставить) ( F i ) , чтобы вставить новый этап после выделенного этапа # (стр. 48) 6. Сохранить новый протокол Выберите D o n e (готово), чтобы сохранить новый протокол, затем с помощью клавиш со стрелками выберите каталог, в котором вы хотите сохранить протокол. Для того, чтобы свернуть каталог, нажмите клавишу со стрелкой l e f t (влево). Чтобы открыть каталог, нажмите клавишу со стрелкой R IG H T (вправо). Вы можете использовать c r e a t e F o l d e r (создать каталог) для нового каталога. В конце, выберите S a v e (сохранить, чтобы сохранить новый протокол в выбранном каталоге. 27 --- стр. 32 --- Автоматический генератор протоколов - дополнительная информация В этом примере, протокол называется FST2, и он сохранен в каталоге GRANT: \EV0001 Ц\ЖАМДР5Т2 В ' ^ EV000111 : SCJMAIN j в £Э GRA IS n ’ Ш ^ PREVIOUS RUNS Ш SYSTEM Ш U SERS 0 Fll« s u cce s s fu lly S 4ued 1 Continue „ C diH na i 1 M ETH O D C A L C HOTUD 105,30 V O U U M E 50 T EM P 95.0,180 T EM P 45.0,30 T EM P 54.3,30 TEM P 72.0,36 GOTO 2,39 TEM P 72.0,300 TEM P 4.0,0 E N D Ш 7. Запустите выполнение протокола или вернитесь в главное меню Выберите RUN (выполнить), чтобы запустить выполнение протокола или выберите M a in M en u (главное меню) для возвращения в главное меню. Примечание: Если вы решили выполнить дальнейшие изменения в данном протоколе, выберите кнопку Continue Editing (продолжить редактирование). А в т о м а т и ч е с к и й г е н е р а т о р протоколов-дополнительная информация в программном обеспечении автоматического генератора протоколов используется стандарт нормативов П 1 4 Р , который автоматически создает протоколы циклирования с денатурацией исходной матрицы и активацией фермента, после чего следуют циклы денатурации, гибридизации и удлинения, затем заключительные этапы удлинения. Протоколы основаны на введенных пользователем параметрах, включающих в себя заданную длину ампликона, тип фермента и температуру гибридизации или последовательность праймеров. Протоколы, созданные автоматическим генератором протоколов при различных режимах скорости (Стандартная, Быстрая и Супербыстрая), могут приводить к различным выходным результатам. Это происходит потому, что создавая эти протоколы, автоматический генератор протоколов может регулировать температуру гибридизации, уменьшать общее число этапов протокола, уменьшать число повторений переходов (GOTO), укорачивать время выдержки или уменьшать перепад температур между этапами. В автоматическом генераторе протоколов используются установленные стандарты ПЦР, которые базируются на таблицах данных при создании окончательных предлагаемых протоколов. Все протоколы являются или стандартными 2-этапными или 3-этапными с этапом итогового удлинения. Автоматический генератор протоколов создает следующие этапы и диапазон значений: 1 . Этап первоначальной активации горячего запуска/денатурации - в диапазоне 95-98°С в течение 30 или 180 сек., в зависимости от типа фермента и режима скорости. 2. Этап денатурации - 95 или 98°С в течение 5 - 30 сек., в зависимости от типа фермента и режима скорости. 3. Этап гибридизации - Автоматическим генератором протоколов используется или праймер Та при «стандартной» скорости, в соответствии с расчетом калькулятора Т а , или значение, введенное пользователем. • Диапазон периода гибридизации от 10 до 30 секунд зависит от режима скорости. Двухэтапный протокол сочетает в себе этапы гибридизации и удлинения. • Температура гибридизации (Та) рассчитывается на основании характеристик праймера и выбранной скорости реакции. В разделе «Калькулятор Та - дополнительная информация» можно найти более подробную информацию о том, как действует калькулятор Т а. Если выбран фермент iProof, к Т а добавляются 3 градуса. 28 --- стр. 33 --- J l « W I I I / IS /f f M l I I W -I W V l t M M W \./f ( 4. Этап удлинения (только трехэтапный протокол) полностью проводится при 72°С с периодами удлинения, основанными на расчете периодов из установленных периодов времени на кило-пар оснований/нуклеотидов (например, 60 сек./ кило пар оснований/нукпеотидов) наибольшего ампликона в двоичном размере, часто с некоторыми изменениями при меньших размерах ампликона. 5. Число повторений - в диапазоне от 25 до 40 в зависимости от выбранной скорости 6. Этап итогового удлинения- 72°С в диапазоне от 1 до 5 минут в зависимости от режимов скорости. Калькулятор Т а - Дополнительная информация Калькулятор Т а рассчитывает значения для каждого праймера, а также Т а для протокола при «стандартной» скорости. Величина Т а для протокола базируется на среднем значении Т^ праймера с применением следующих выражений: • Если разница между значениями Т^ праймера > 4, то Т а = (нижнее из двух значений праймеров Т щ З +2) - 4°С. • Если разница между значениями Т^ < или = 4, то Та = (среднее для значений праймера Тт) - 4°С. Для каждого праймера калькулятор Т а использует методику расчета пар оснований для последовательности из не более 14 пар. • Т,„ = ((w‘A + х*Т) * 2) + ((y*G + z*C) * 4) где w,x,y,z количество оснований A,T,G,C в последовательности, соответственно. Для последовательности, длина которой превышает 14 пар (Ьр), используется методика «ближайшего соседа»: В методике «ближайшего соседа» расчет температуры плавления базируется на термодинамической связи между энтальпией и энтропией, свободной энергией и температурой, где: ДН = ДС + Т* Д8 где ДН = значение энтальпии, кал/моль*К Т = температура, Кельвин. Д8 = значение энтропии, кал/моль*К Д0 = свободная энергия Гиббса в кал/моль*К Изменение в энтропии (порядок или мера случайности олигонуклеотидов) и энтальпии (тепло, высвобожденное илил поглощенное олигонуклеотидом) непосредственно рассчитывается путем суммирования значений для пар нуклеотидов, метод Breslauer и др., Ргос. Nat. Acad. Sci. 83, 3746-50, 1986 (методика Национальной Академии Науки за номером 83, 3746-50, 1986). Взаимосвязь между свободной энергией и концентрацией реагентов и продуктов в состоянии равновесия дана в следующем выражении: Д6 = R*T*ln ((ДНК * Праймер) / (ДНК + Праймер)) где R - газовая постоянная (1,986 Ккал/моль*К) 29 --- стр. 34 --- Калькулятор Та - Дополнительная информация Подставляя G в два уравнения и вычисляя Т, получаем: Т = ДН / (?S + R*Ln((flHK * Праймер) / (ДНК + Праймер))) Принимаем, что концентрация ДНК и концентрация комплекса ДНК- праймера равны. Эмпирически определено, что существует изменение свободной энергии, равное 5 (3,4 - Sugimoto и др.) ккал, в течение перехода от единичной цепи к ДНК В-формы, Это предположительно энергия закладки спирали. В итоге, добавляя поправку на соль, получаем уравнение, используемое калькулятором Т а : Т = (ДН - 5(ккал/К*моль)) / (AS + (R * 1 п (1 / (праймер)))) + 16.61одЮ(молярность соли) Не требуется никаких поправочных коэффициентов на соль, т.к. различные параметры были определены при 1 молярной соли NaCI, а учетная запись для 1 равняется нулю. Допущения: В термодинамических расчетах допускается, что гибридизация происходит при pH 7.0. При расчете температуры плавления (Тт) допускается, что последовательность не симметричная и содержит хотя бы один G или С. Длина олигонукпеодтидовой последовательности должна равняться, по крайней мере, 14 основаниям для обеспечения достаточных значений Т^. Если длина последовательности меньше 14 оснований, то используется метод подсчета пар оснований. Константы взаимодействия Бреслера Бреслер и др. Взаимодействие дельта(Н) дельта(8) дельта(О) АА ТТ 9.1 24 1.9 АТ ТА 8.6 23.9 1.5 АС TG 6.5 17,3 1.3 AG ТС 7.8 20.8 1.6 ТА АТ 6 16.9 0.9 11 АА 9.1 24 1.9 ТС AG 5.6 13.5 1.6 TG АС 5.8 12.9 1.9 СА GT 5.8 12.9 1.9 СТ GA 7.8 20.8 1.6 СС GG 11 26.6 3.1 CG GC 11.9 27.8 3.6 GA СТ 5.6 13.5 1.6 GT СА 6.5 17.3 1.3 GC CG 11.1 26.7 3.1 GG СС 11 26.6 3.1 30 --- стр. 35 --- Термоциклер 1000 - Руководство 5. Выполнение протоколов Термоциклер 1000™ запускает выполнение протоколов для одного или более блоков реакционного модуля. До того, как запустить выполнение протокола у вас есть возможность отредактировать протокол (стр. 48). Для вашего удобства, термоциклер 1000 содержит комплект предварительно установленных, стандартных протоколов, которые вы можете использовать (стр. 109). Для получения инструкций по выполнению протоколов прочитайте разделы данной главы о том, как: • Запустить протокол с помощью клавиши RUN (выполнить) (ниже) • Контролировать выполнение протокола с помощью клавиш s t a t u s (состояние) и V IE W (вид) (стр. 37) • Приостановить и продолжить выполнение протокола с помощью кнопок P a u s e (пауза) и R esu m e (продолжить) (стр. 40) • Пропустить этапы в процессе выполнения протокола с помощью кнопки sk ip s t e p (пропустить этап) (стр. 41) • Отменить выполнение протокола с помощью клавиши CANCEL (отмена) (стр. 42) • Нажать клавишу IN C U B A T E (инкубировать) для незамедлительной инкубации проб при одинаковой температуре (стр. 44) Запуск протокола с помощью клавиши r u n ( в ы п о л н и т ь) Начните выполнение, используя один из следующих методов: • Нажать клавишу r u n (выполнить): Нажмите r u n, и выберите протокол в библиотеке файлов. Нажмите RUN или e n t e r (ввод) снова для начала последовательности выполнения. • Выбрать протокол в каталоге P R E V IO U S r u n (предварительное выполнение) и нажмите r u n: выберите каталог P r e v i o u s R u n для выбора протокола, который недавно выполнялся. Затем нажмите клавишу r u n и л и e n t e r д л я повторного выполнения выбранного протокола. • Открыть библиотеку файлов и выбрать протокол: Щелкните F i l e s (файлы) в главном меню для того, чтобы открыть библиотеку файлов и выбрать протокол. Нажмите кпавишу r u n и л и e n t e r д л я выполнения выбранного протокола. • Выполнить отредактированный протокол: после редактирования протокола нажмите клавишу RUN, чтобы начать выполнение данного протокола. • Выполнить новый протокол: после создания нового протокола (стр. 47), нажмите кпавишу RUN, чтобы начать выполнение этого протокола. Чтобы запустить протокол нажатием клавиши RUN, выполните следующие действия: 31 --- стр. 37 --- Запуск протокола с помощью клавиши RUN Если с прибором 1000 соединено более одного блока, выберите блок, необходимый вам для выполнения протокола. В этом примере термоциклером запускается реакционный модуль Dual- 48: 3. Выберите один или несколько блоков для запуска выполнения (необязательно) йОпТТЩШм;' S * l* ct on» or m u ltip l* b lo ck s and prest “RUN" k«y Совет: Для выбора более одного блока, сначала выберите один блок путем нажатия клавиш со стрелками и нажатия s e l e c t B lo c k (выбрать блок). Затем, выберите следующий блок, снова нажимая кпавиши со стрелками и снова нажимая S e l e c t B lo c k . 4. Выберите метод запуска нескольких блоков (не обязательно) Если вы хотите запустить выполнение протокола на более чем одном блоке, сначала выберите метод, а затем нажмите ок, чтобы начать выполнение. • Запустить все блоки одновременно: выбирайте данный метод для начала выполнения протокола на всех блоках в одно и то же время. • Подтвердить выполнение по одному: выбирайте данный метод для начала выполнения протокола для каждого блока по отдельности. В этом примере, протокол будет запущен одновременно для всех блоков: M ore than 1 block has been selected on which to run I T A Q -F S T ...j Confirm each run one at a time 33 --- стр. 38 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Выполнение протоколов 5. Подтверждение параметров выполнения Перед началом выполнения подтвердите или измените параметры выполнения. Параметры объема пробы и температуры крышки влияют на успешное проведение реакции. Дополнительная информация по выбору данных параметров представлена на стр. 64. Совет: Ввод данных объема пробы определяет режим управления температурой. Введите значение S a m p le v o lu m e (объема пробы) большее О (нуля) мл для управления расчетной температурой, при котором термоциклер использует объем пробы для расчета заданной температуры. Введите О (ноль) для использования управления температурой блока, при котором термоциклер принимает, что температура пробы равна температуре блока. В этом примере параметры выполнения включают в себя имя пользователя e v a, объем пробы и температуру крышки 85°С: (Также можно пропустить данные поля и запустить выполнение протокола без введения параметров или идентификатора пробы (Sample ID) путем нажатия Run). on EVOOOOOl - Block A? S aiTiple Volum e: 1 0 Sample ID; User! EVA I I I L id Temperature: 85 0 Turn on hodid (Optional) (Optional) О Confitm senings «nd p re s s "RUN" or "OK" to p ro ce e d Virtual Keyiwd: 6. Запуск в режиме эмуляции (не обязательно) Для выполнения протокола при той же линейной скорости, что и у термоциклера iCycler и механизма ДНК, выберите опцию эмуляции. Нажмите кнопку O p t io n s (опции), затем выберите E n a b le emulation mode (включить режим эмуляции) и задайте нужную линейную скорость: . - Й У У ; ? .' М Ё Н а М Н В !!!!! Send to bbcl'Cs) foe remots? sta-t 0inabie em ulation m ode;! @ DNA Engine Thennal Cyder ( 3 iCycler Thermal Cycler О S e le ct a d d itio n a l s e ttin g s F o r th is tu n 34 --- стр. 39 --- Контроль выполнения с помощью клавиш STATUS и VIEW 7. Начать выполнение Чтобы начать выполнение, нажмите ок. В этом примере выполнение протокола начинается на блоке А, а крышка предварительно подогревается: Sttpi lo fS R«pt*i! 1 oF 1 Volume! lO pI HeMing Remaining I 07:20:38 у , 38.0*C Udi %*C 8. Контроль выполнения протокола Как только начинается выполнение протокола, на экране состояния отображаются подробности хода выполнения протокола, В этом примере проба охлаждается в термоциклере до заданной температуры 65.0°С: аяа8йя-.-тая; User; ADMIN 1 г SamptelDi 3 ; 4 Б 7 2.0 < S te p s 3 of 5 R*p««tg 1 oFBI Velum *! lO p I 0i30 :» I Cooling Simple; 88.0*C R«m»inln9! 07:19:59 Udi lOS'C Контроль выполнения протокола с помощью клавиш s ta tu s и view в процессе выполнения клавиши STATUS (статус) и view (вид) обеспечивают быстрый способ контроля всех блоков: • Клавиша view (вид): Нажмите эту кпавишу, чтобы отобразить оставшееся время на одном блоке. • Клавиша status (состояние): Нажмите эту кпавишу для отображения состояния выполнения процесса на нескольких блоках. 35 --- стр. 46 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Выполнение протоколов 2. Щелкните C a n c e l R u n (отменить выполнение) или C a n c e l A l l (отменить все) Щелкните кнопку C a n c e l R u n (отменить выполнение), чтобы остановить работу одного блока. В этом примере открыт экран протокола и выполнение отменено: User: EVA 1 г '*,0 SamplelD; 2345 О.; RUN WAS CANCELLED 00:37 01/02/2006 о I Idle.. L id Temp; 100’ Sample Temp; 93,9» в этом примере открыт экран состояния блока, и выполнение отменено: Cycler Block Status E V O O O O O I А -48 Run Cancelled В-48 Run Cancelled Highlight block ind press "STATUS" k»y for more info Совет: Чтобы отменить несколько циклов, но не все, выберите блоки и щелкните C a n c e l R u n (отменить выполнение). Инкубация пробы с помощью клавиши incubate Щелкните клавишу i n c u b a t e (инкубировать) (0) для поддержания постоянной температуры проб в течение любого количества времени. Инкубация будет продолжаться неограниченное количество времени. Чтобы завершить инкубацию, нажмите кнопку C a n c e l (отмена). Внимание! Инкубация проб в течение длительного периода времени при температуре 4-10°С, особенно в местах с большой влажностью, может привести к чрезмерной конденсации влаги вокруг блока. Выполните следующие действия для начала и завершения Инкубации проб при одной температуре: 42 --- стр. 47 --- Инкубация пробы с помощью клавиши INCUBATE 1 . Нажмите i n c u b a t e (инкубировать) Загрузите свои пробы и нажмите клавишу i n c u b a t e (инкубировать) (0) для начала инкубации: Ж « с 105 Target Temperature; L id Temperature: 0 Use Heated L id О P re ss Run or OK" lo confim i s e ttin g s «vJ be gin ru n Совет; Установите температуру инкубации по умолчанию в меню u t i l i t i e s (утилиты) (стр. 101). Примечание; Если инкубация происходит при температуре ниже C u t o f f (порога выключения), то температура крышки будет поддерживаться на отметке 31°С для пpeдoтвpaLцeния образования чрезмерного конденсата. Порог отключения ( C u t o f f ) может быть изменен в меню u t i l i t i e s (утилиты). 2. Введите параметры инкубации Измените параметры T a r g e t T e m p e r a t u r e (заданной температуры) и L i d T e m p e r a t u r e (температуры крышки) при необходимости. В этом примере Target Temperature (заданная температура) изменена до 90°С: 9 С | 105 Target Temperature: L id Temperature; 0 Use Heated L id P re ss "RUN" or "OK" to co n firm s*ttinjs and be gin ru n 43 --- стр. 48 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Выполнение протоколов 3. Нажмите ок для начала инкубации Для начала инкубации нажмите кнопку ок дважды: Ршгого «Л Г е д а step: 1 of 1 lid Preheating., Volum e! 1 0ц 1 L id Terrp: 93® Sample Temp: 33,7® Estimated Tim e Remaining: 00:00:00 Примечание: Если подсоединено несколько блоков, то вы можете выбрать блоки, инкубацию которых вы хотите начать. 4. Нажмите C a n c e l R u n (отменить выполнение) для завершения инкубации Нажмите кнопку C a n c e l R u n для завершения инкубации, при этом отобразится итоговый экран отмены (“Cancelled"): s ft л . . RUN WAS CANCELLED 00:4101/02/2006 Idle L id Tem p: 100® Sample Temp; 33,5® I'leioM O TU 44 --- стр. 49 --- Термоциклер 1000 - Руководство 6. Создание и редактирование протоколов Процессы создания и редактирования протоколов просты и интуитивно понятны. Если новый протокол создается без помощи автоматического генератора протоколов, то термоциклер 1000™ предоставляет протокол-образец. Совет: Для того, чтобы термоциклер 1000 создал протокол автоматически, нажмите клавишу автоматического генератора протокола («Создание протокола с помощью автоматического генератора протоколов» на стр. 24). Данная глава содержит инструкции по созданию и редактированию протоколов. Процессы создания и редактирования протоколов включают как обязательные, так и не обязательные задачи; после осмысления этих простых действий, можно создавать протоколы, применяя данные задачи в любом порядке: 1 . Открыть новый протокол или существующий протокол (ниже). 2. Изменить параметры этапа температурного воздействия или этапа градиента (необязательное действие, стр. 48). 3. Изменить параметры этапа сото (перехода) (необязательное действие, стр. 57). 4. Вставить или удалить этап (не обязательно, стр. 59). 5. Присвоение имени протоколу (обязательно, стр. 62). 6. Изменить объем пробы и температуру крышки (необязательное действие, стр. 64). 7. Сохранить протокол (обязательно, стр. 66). Дополнительная информация об использовании панели управления и главного меню - на стр. 13. Дополнительная информация о содержании файлов протоколов - на стр. 79. Инструкции по выполнению протоколов - на стр. 33. Открытие нового или существующего протокола Следуйте данным инструкциям, чтобы создать или отредактировать протокол: 1 . Выберите New P r o t o c o l (НОВЫЙ протокол), или нажмите кпавишу E D IT (редактировать). Чтобы создать новый протокол в главном меню, выберите New P r o t o c o l (новый протокол) чтобы открыть образец нового протокола. Для изменения существующего протокола нажмите клавишу e d i t (редактировать) , чтобы открыть библиотеку файлов и выбрать протокол для редактирования. 45 --- стр. 50 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 2. Переключение между графическим и текстовым режимами (необязательное действие). Протокол открывает графический режим изображения. Нажмите клавишу v i e w (вид) для переключения между графическим и текстовым режимами изображения в любое время: • Это образец нового протокола в графическом режиме изображения: Use the keypad to «г(ег i/»luennd nivigal* Esti OlilbiOO ^ through the protocol steps, Это образец протокола в текстовом режиме изображения: 1 ^ с for 3:00 2 95.0 с for 0:30 3 72.0 С for 1:00 — 4 GOTO 2 j34 more tim es 5 72.0 С for 5:00 6 4.0 С Forever ЕЮ Use the keypad to enter values and navigate through the protocol steps. Esti OlilbiOO О Изменение параметров на этапе температурного воздействия Этапы температурных воздействий являются самым общим видом типовых протоколов. Параметры этапа температурного воздействия включают в себя заданную температуру и время выдержки, и другие, требуемые для завершения этапа. Дополнительно вы можете добавить больше параметров к данному этапу, щелкнув по кнопке O p t io n s (опции). Следующий список содержит все возможные параметры для этапов температурного воздействия. Многие из данных параметров могут быть объединены в один этап: • Температура и время (обязательно): изменение заданной температуры и времени выдержки в течение этапа (ниже). 46 --- стр. 51 --- Изменение параметров на этапе температурного воздействия • Градиент: создать температурный градиент сквозь блок в течение этапа («Добавить и удалить температурный градиент» на стр. 50). • Приращение: изменять заданную температуру с каждым циклом (стр. 51). • Скорость линейного нарастания: изменить скорость линейного нарастания на этапе (стр. 53). • Продлевать: увеличивать время выдержки на этапе с каждым циклом (стр. 54). • Звуковой сигнал: добавить звуковой сигнал в конце этапа (стр. 56). Изменение заданной температуры и времени выдержки Для изменения заданной температуры и времени выдержки в течение этапа температурного воздействия, следуйте данным инструкциям: 1 . Выбрать этап протокола На этом примере представлен стандартный образец для нового протокола. Обратите внимание, что каждый этап температурного воздействия включает заданную температуру и время выдержки: N am e. ж ш т ш ш ш г 1 95,0 С • 3:00 |б5,0 с : 72,0 с 72.0 С SE1 С /1:00 Q 5:00 1 0:30 0)30 : 0 т о 4 ., С 1 2 1 34 I 1 Use the keypad to enter values and navigate through the protocol steps. Esti 01i36;00 2. Введите требуемые параметры Для выбора параметров нажимайте кпавиши со стрелками. Используйте буквенно цифровые клавиши для ввода нового числового значения для любого выделенного параметра. Совет: Для перехода между режимами графического и текстового изображения нажмите клавишу V I E W (вид). 47 --- стр. 52 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов В этом примере заданная температура на этапе 3 изменяется до 65°С: О Use the keypad to enter values and navigate Esti 0l!33i00 throufh the protocol steps. Добавить и удалить температурный градиент Чтобы добавить температурный градиент к этапу температурного воздействия, выполните следующие инструкции: 1. Выберите этап протокола и выберите O p t io n s (опции), или нажмите I n s e r t (вставить), затем G r a d i e n t (градиент). Выберите этап температурного воздействия и нажмите O p t i o n s , чтобы открыть окно с опциями: 5tep3 Temperature З Ж 1 С Gradient Range С Increment С/cycle Ramp Rate C/sec Time 0;30 Extend sec/cycle Beep к < р п с 2. Введите диапазон градиента (Gradient Range) Используйте буквенно-цифровые клавиши для ввода G r a d i e n t R a n g e (диапазона градиента). Нажмите D o n e (готово) для продолжения. Примечание: диапазон градиента должен быть от 1 до 24°С.Высшее значение температуры градиента равняется нижнему значению температуры плюс диапазон градиента. В этом примере диапазон градиента равен 20.0°С, а нижняя температура равна 55°С. Таким образом, верхнее значение температуры равно 75°С. Как только диапазон градиента введен, на экране отображается градиент, распределенный по рядам лунок в блоке. 48 --- стр. 53 --- е 3. Изменение параметров на этапе температурного воздействия В этом примере показан градиент, распределенный сквозь блок с 96 лунками, начиная с задней части (ряд А, верхнее значение температуры) по направлению к передней (ряд Н , нижнее значение температуры): - - ■ : r 1 Seep UptlOfK steps Gradient A 75.0 Temperature 55,0 с В 73.6 Gradient Range I E с С 71,0 Increment C/cyde D 67.4 Ramp Rate C/sec E 62,9 Tim e 0;30 F 59.2 |56.5Extend sec/cycle G H '55.0 Peep 1 Примечание: этап градиента также может включать в себя параметр удлинения (Extend), но не вкпючает приращение, звуковой сигнал или скорость нарастания. Просмотрите градиент Просмотрите протокол в предпочтительном для вас виде (текстовом или графическом). Это также дает дополнительную возможность для редактирования параметров градиента. Совет: Как только на этапе появляется градиент, вы можете редактировать верхнюю и нижнюю температуры в графическом или текстовом формате изображения, не открывая экран с опциями В этом примере градиент от 55 до 75°С: ВШбЕ Верхние и нижние параметры Use the keypad to enter values and navigate ’ through the protocol steps. ................. Est! 01i33:00 4. Удалить температурный градиент Выберите этап градиента и откройте окно O p t io n s (опции). Затем выберите G r a d i e n t R a n g e (диапазон градиента) и удалите значение диапазона, нажав кпавишу b a c k (назад). Затем нажмите ок. Добавить и удалить температурное приращение Приращение увеличивает или уменьшает заданную температуру на этапе с каждым цикпом. Чтобы добавить и удалить температурное приращение, выполните следующие инструкции: 49 --- стр. 54 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 1 . Выберите этап протокола и щелкните O p t io n s (опции) Выберите этап температурного воздействия и нажмите O p t i o n s , чтобы открыть окно с опциями: Temperature С Gradient Range С Increment с/cycle Ramp Rate C/sec Tim e 0:30 Extend sec/cycle ^ Beep 2. Добавить приращение Нажимайте клавиши со стрелками, чтобы выбрать окно in c r e m e n t (приращение). Затем нажимайте буквенно-цифровые клавиши, чтобы ввести температуру приращения, и нажмите ок для завершения: stepa Temperature 55.0 С Gradient Range С Increment IE С/cycle Ramp Rate C/sec Tim e 0:30 Extend sec/cycle 3]Веер 50 --- стр. 55 --- Изменение параметров на этапе температурного воздействия 3. Просмотрите приращение Просмотрите приращение в текстовом формате изображения протокола. В этом примере на 3 этапе протокола есть приращение: 1 95.0 с for 3:00 2 55.0 с for 0:30 3 S E Cfor0;30 Inaement temperature ЬуО.5 С per cycle 4 72.0 CforliOO 5 fj0T02 ,34 more tim es 6 72.0 С for 5:00 7 4.0 С Forever END Use the keypad to enter values and navigate through ihe protocol jteps. Est! 01:34:00 4. Удалить приращение Выберите этап протокола и откройте окно с опциями. Затем удалите значение температуры приращения ( I n c r e m e n t ) , нажав клавишу b a c k (назад). Затем нажмите ок. Добавить и удалить скорость линейного нарастания Измените скорость линейного нарастания этапа протокола, если требуется эмулировать термоциклер, работающий с более медленной скоростью линейного нарастания, чем термоциклер 1000. Для изменения скорости нарастания для этапа температурного воздействия следуйте данным инструкциям: 1 . Выберите этап протокола и выберите O p t io n s (опции) Выберите этап температурного воздействия и нажмите O p t i o n s , чтобы открыть окно с опциями: 1 5tep3 Temperature Ш с Gradient Range с Increment С/сус1е Ramp Rate C/sec Time 0:30 1 Extend sec/cycle --- Веер 51 --- стр. 56 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 2. Добавить изменение скорости линейного нарастания Используйте клавиши со стрелками для размещения курсора в окне Ramp R a t e (скорость линейного нарастания). После этого, нажимайте буквенно-цифровые клавиши, чтобы ввести значение скорости нарастания, и нажмите ок, чтобы добавить указанную скорость нарастания: ер DptronS 55,0Temperature Gradient Range Increment Ramp Rate Э й Time Extend 0:30 С С с /cycle C/sec sec/cycle Beep 3. Просмотрите скорость линейного нарастания Скорость нарастания можно увидеть в текстовом формате отображения протокола. В этом примере на 3 этапе протокола есть изменение скорости линейного нарастания: 30 т 1 95.0 с for 3:00 2 55,0 С for 0:30 3 ЗЭЯ с for 1:00 Slow Ramp Rate to 2,0 С per second 4 GOTO 2 ,34 more times 5 72.0 С for 5:00 6 4,0 CForever END О Us« the keypad to «nUr values ind n4vqa<e Est; 01:15:00 (hrciuqh ih e ptwocol «*ps. 4. Удалить изменение скорости линейного нарастания Чтобы удалить скорость линейного нарастания, выберите этап и откройте окно с опциями. Затем выберите скорость линейного нарастания и удалите ее значение нажатием кпавиши b a c k (назад). Затем нажмите ок. Добавить и удалить время E x te n d (продления) Добавьте время продления к этапу протокола, если вы хотите, чтобы время выдержки увеличивалось или сокращалось с каждым цикпом. Чтобы добавить или удалить время продления, следуйте данным инструкциям: 52 --- стр. 57 --- Изменение параметров на этапе температурного воздействия 1 . Выберите этап протокола и щелкните O p t io n s Выберите этап температурного воздействия и нажмите O p t i o n s , чтобы открыть окно с опциями: 5tep3 Temperature Gradient Range Increment Ramp Rate Time Extend 0:30 С С С/cycle C/sec sec/cycle Beep 2. Добавить время продления Нажимайте клавиши со стрелками, чтобы поместить курсор в окно E x t e n d (продление). Затем, с помощью буквенно-цифровых клавиш введите время продления и нажмите ок, чтобы добавить функцию: srejrtjprtons 5tep3 Temperature Gradient Range Increment Ramp Rate Time Extend 55.0 0;30 С С с /cycle C/sec sec/cycle 53 --- стр. 58 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 3. Просмотрите время продления Время продления можно увидеть в текстовом формате отображения протокола. В этом примере на 3 этапе протокола есть время продления: в 1 95,0 С for 3:00 2 55,0 С for 0:30 3 С for 1:00 Extend time by 1 seconds per cycle 4 GOTO 2 ,3 4 more times 5 72,0 С for 5:00 6 4.0 С Forever END Use the keypad to enter values and navigate through the protocol steps. Esti 01:24!00 4. Удалить время продления Чтобы удалить время продления, выберите этап и откройте окно с опциями. Затем, удалите значение времени продления нажатием клавиши b a c k. Затем нажмите ок. Добавить и удалить звуковой сигнал Звуковой сигнал это звук, который термоциклер подает при достижении им этапа протокола. Чтобы добавить или удалить звуковой сигнал, выполните следующие инструкции: 1 . Выберите этап протокола и нажмите O p t io n s Выберите этап температурного воздействия и нажмите O p t i o n s , чтобы открыть окно с опциями: Step3 Temperature С Gradient Range С Increment с/cycle Ramp Rate qsec Tim e 0:30 Extend sec/cycle □ в е е р 54 --- стр. 59 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 2. Добавить звуковой сигнал Используйте клавиши со стрелками для выделения слова “Веер" (звуковой сигнал). Затем, нажмите ENTER (ввод), чтобы выбрать окно и нажмите ок для подтверждения: steps Temperature 55.0 С Gradient Range С Increment C/cyde Ramp Rate C/sec Time 0:30 Extend sec/cycle I 3. Просмотр звукового сигнала Просмотрите информацию о звуковом сигнале в текстовом формате отображения протокола. В этом примере, к 3 этапу протокола добавлен звуковой сигнал: 1 95,0 С for 3:00 2 Ж | С for 0:30 Веер at end of step 3 72,0 С for 1:00 — 4 GOTO 2 ,3 4 more times 5 72.0 С for 5:00 6 4.0 С Forever END Use the keypad to enter values and navigate Esti 01:14i00 through the protocol steps. 4. Удалить звуковой сигнал Чтобы удалить звуковой сигнал, выберите этап и откройте окно с опциями. Затем, выберите В еер (звуковой сигнал) и удалите его нажатием клавиши e n ter (ввод). Затем нажмите ок. Изменение параметров на этапе GOTO (перехода) Этап GOTO (перехода) дает указание термоцикперу повторить последовательность этапов в цикпе. Этот этап создает цикл в процессе ПЦР-анализа. Для изменений параметров этапа GOTO, выполните следующие инструкции: 55 --- стр. 60 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 1 . Выберите этап GOTO (перехода). Выберите этап GOTO в графическом или текстовом формате отображения. В этом примере параметры этапа включают переход к 1 этапу (GOTO step 1) и 34 дополнительные повторения. Обратите внимание, что стрелка GOTO указывает на 1этап: 2. Измените номер этапа GOTO (перехода) С помощью кпавиш со стрелками выберите номер этапа в этапе GOTO. В том примере этап перехода (GOTO) меняется с 1 этапа на 2 этап. Обратите внимание, что стрелка GOTO движется к 2 этапу: . Us« the keypad ts enter values and navigate ^ through th* piwocol steps. Esti 01il4;00 56 --- стр. 61 --- Вставить и удалить этап Цикл GOTO представляет собой количество повторяемых последовательностей этапов в течение этапа GOTO. В этом примере количество циклов GOTO изменяется с 34х на 35х: 3. Изменение цикла GOTO (повторений) О Us* (he keypad lo ewer values and nawiqate Esti 0Ы4Ю0 through th* protocel steps. 4. Просмотр параметров GOTO в тестовом формате Просмотрите изменения в тестовом или графическом формате. В этом примере протокол отображен в текстовом формате: GOTO параметры Т д 'Д Гзо -||пм И р П о Гк« < 95.0 55.0 О С For3;00 С for 0:30 С for 1:00 Extend time by 1 — 4 G 0T02 ,S a 5 72.0 С for 5:00 6 4.0 С Forever END seconds pbr cycle more times О Use the keypad to enter values and navigate 01:26i00 through the protocol steps. Вставить и удалить этап Вставьте этап протокола, если требуется новый этап температурного воздействия (Tem p), этап GOTO (переход), или этап градиента. Сотрите этап, чтобы удалить его из протокола. Вставить этап протокола Следуйте данным инструкциям, чтобы вставить этап справа от уже существующего этапа протокола: 57 --- стр. 62 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 1. Выберите место вставки нового этапа и выберите i n s e r t (вставить) Выберите этап слева от того места, где вы хотите вставить этап. Затем, щелкните I n s e r t (вставить) чтобы начать вставку этапа. В этом примере выбран 2 этап: 1 а ш 1 3 0 iitittgcij 1 0 5 * 1 2 3;Л 4 ?5.0 С 1 Э:00 1 72,0 \ SS.0 < < 3 / 0:03 jE I 0 1 о 2 35 1 4.0 С О Use th e keypad « о enter vjiues ind navigate thraugh the protocol steps. Forever Esti 00:24:00 2. Выберите тип этапа для вставки Выберите T e m p, чтобы вставить этап температурного воздействия; g o t o, чтобы вставить этап GOTO (перехода); или G r a d i e n t , чтобы вставить этап градиента: 3. Редактировать параметры нового этапа На новом этапе по умолчанию задана температура 50°С и время зо секунд (0:30). Выберите и отредактируйте параметры нового этапа (2 этап на стр. 49). 58 --- стр. 63 --- Вставить и удалить этап Вставить и удалить этап В этом примере вставлен этап температурного воздействия. Обратите внимание, что этап вставлен внутри повторения GOTO: Вставлен ныйэтап Ж.0 с зю о [ 5 5 .0 С 0 : 3 0О О О О т о ! 2 <----- . I 3 S . U s e t h e k e y p .a d t o e n t e r v ^ i l u e s a n d n ^ u i^ a t e Е л ; 0 0 : 4 7 Ю 0 1 1 0 5 tyi 1 ^ 7 2 .0 С ( о ю з [ 4 .0 С F o « v e r О through the protocol steps. Ш Удалить этап протокола Чтобы окончательно удалить этап из протокола, выполняйте следующие инструкции: 1 . Выберите удаляемый этап Выберите этап. В этом примере выбран 6 этап: 3 0 1 2 ■ - ■ 3 - ■ 4^ 5 9 5 .0 С I 3 : 0 0 7 2 .0 С 1 5 5 ,0 С 5 0 .0 << 3/ 0 : 0 3 0 3 0 0 : 3 00 т 0 г 3 5 I . Use the lo y p id Ю enter values and navlg.»te 0 0i4 7i00 ’ through the protocol steps. 59 --- стр. 65 --- Присвоение имени протоколу Впечатайте имя протокола в окне. Используйте буквенно-цифровые клавиши для ввода букв или цифр. Нажмите Done (готово) для подтверждения имени и перехода к библиотеке файлов. В этом примере имя нового протокола STD3GRAD: 2. Введите имя 9S.0 с 3iO Q 95,0 С 0 3 0 3 : 4 ■ М б - 7 5 , 0 С 5S.0 С 0 3 0 1з О т о 34 X 72.0 С О Use the keypad to enter v ilu ts «nd n^vigtte (hrou^h ihe protocol steps. E s li 0 1 Ю Э Л 0 Примечание: Имя протокола может включать до восьми букв и цифр. Оно не может повторяться в том же каталоге или содержать пробелы, точки или тире. Переименование существующего протокола Когда вы редактируете существующий протокол, у вас есть возможность переименовать протокол. При переименовании протокола первоначальный протокол и его имя не будут удалены. Чтобы переименовать протокол, выполните следующие действия: 1 . Выберите имя в окне Name (имя) Используйте кпавиши со стрелками, чтобы выбрать имя протокола в окне Name. В этом примере имя существующего протокола STD3GRAD: Имя существующего протокола ........ 61 --- стр. 66 --- Термоциклер 1000 - Руководство | Создание и редактирование протоколов 2. Впечатайте новое имя протокола Нажмите клавишу BACK (назад), чтобы удалить имя. Затем, впечатайте новое имя в окне Name. Используйте буквенно-цифровые клавиши для ввода буквы или цифры. Нажмите ENTER (ввод) для подтверждения имени. В этом примере новое имя STD3GRAD: Ф Inserts to the right of th« highlighted st«p. ?G o tQ .' B S t f Новое имя протокола Изменение объема пробы и температуры крышки Параметры объема пробы и температуры крышки влияют на успешно течение протокола. Термоциклер 1000 предлагает три способа установки объема пробы и температуры крышки в протоколе: • Установить параметры протокола, заданные по умолчанию, при создании и редактировании протокола (ниж е). • Изменить DEFAULT (СТаНДЭрТНЫ Й) протокол в каталоге SYSTEM/TEMPLATE (система/образец). • Установить данные параметры во время начала выполнения (стр. 33) И з м е н е н и е о б ъ е м а п р о б ы Введите объем ваших проб или ноль. Введенный вами объем пробы определяет режим терморегулирования в ходе процедуры («Режим терморегулирования» на стр. 70). Выполните следующие действия, чтобы изменить объем пробы: 1 . Выберите объем пробы Чтобы изменить объем пробы, заданный по умолчанию для данного протокола, выберите окно ввода объема пробы (vol). 62 --- стр. 67 --- Изменение объема пробы и температуры крышки В этом примере, объем пробы, заданный по умолчанию для нового протокола, равен 50 микролитров: 3 4 5 1 1 , 7 5 .0 С 7 2 Л С j \ 5 5 .0 СQ 5 Ю 0 0 : 3 0 0 Т 0 2 3 4 I О Inserts 10 (h« right of th« highlighted step, Esti 01ЮЗ:00 2. Введите объем пробы Используйте буквенно-цифровые клавиши для ввода нового объема пробы. В этом примере, новый объем пробы составляет 2 5 микролитров: Insertslo the right of (h« highlighted step, 01СЗЮ0 Совет: При вводе значений объема пробы в диапазоне от 1 до 50 устанавливается расчетный режим терморегулирования (Calculated temperature control rnode), являющийся стандартным режимом. При вводе нулевого значения (0 ) устанавливается блочный режим (Block mode). Расчетный режим является рекомендованным, т.к. он наиболее точно показывает действительную температуру пробы. 3 . Выберите температуру крышки Чтобы изменить температуру крышки, установленную по умолчанию для данного протокола, выберите окно ввода температуры крышки (Lid) с помощью клавиш со стрелками. Примечание: Нагрев крышки предотвращает образование конденсата в реакционных сосудах. 63 --- стр. 71 --- Выбор объема пробы и температуры крышки 2. Введите новое имя (не обязательно) Чтобы сохранить протокол под новым именем, выберите E d it Filename (изменить имя файла) и впечатайте новое имя. Примечание: при сохранении протокола под новым именем добавляется новый протокол, а исходный протокол или его имя не удаляются. В этом примере новое имя STD3INC1: Новое имя файла \ E V 0 0 0 0 0 1 \ E V A В ^ Е V O O D O O 1 s ’ Q M A I N В Q I23 S T D 3 I N C ^ S T D 3 G R A 0 Ш U S E R S i О то c h a n g e p r a s s t h e " С Ь « п 9 в Foldtt'' button Change 3 . Выберите каталог Обратите внимание, что термоциклер 1000 откроет каталог, содержащий исходный протокол. В этом примере отредактированному файлу присвоено имя: \ E V 0 0 0 0 0 1 \ E V A \ 5 T D 3 I N C а ^ E V 0 0 0 0 0 1 s ’ G M A I N В £Ь E V A ЖM E T H O D C A L C H O T U D 1 0 0 , 3 0 У О Ш М Е 2 5 T E M P 9 5 .0 ,1 8 0 T E M P 9 5 .0 ,3 0 Q R A D 5 5 .0 ,7 5 .0 ,3 0 T E M P 7 2 .0 , 3 0 G O T O 2 ,3 4 T E M P 7 2 .0 ,3 0 0 E N D I^^HB6BI5TD3INC11 5 T D 3 I N C 1 ; : : ^ S T D 3 G R A D Ш P R E V I O U S R U N S Ш S Y S T E M S М U S E R S ▼ F ile s u c c e s if u lt y liv e d Совет: чтобы сохранить исходный файл, присвойте другое имя отредактированному файлу. 4. Выберите Save (сохранить) чтобы сохранить отредактированный протокол. Нажмите кнопку Save (сохранить) чтобы завершить сохранение отредактированного протокола и заменить исходный файл. Выбор объема пробы и температуры крышки Как объем пробы так и температура крышки влияют на результаты ПЦР-анализа: 67 --- стр. 72 --- Термоциклер 1000 - Руководство • Объем пробы определяет режим терморегулирования, который влияет на время выдержки ваших проб при заданной температуре (ниж е) • Установочные параметры температуры крышки определяют температуру нагрева крышки и момент его откпючения. Если температура слишком высока, то температура пробы может превысить заданную температуру (ниж е) В приборе 1000 предусмотрено три способа для ввода и регулирования этих основных параметров: • Изменить стандартные настройки в протоколе • Изменить стандартные настройки системы в u t i l i t i e s (утилиты) (стр. 101) • Изменить настройку при запуске протокола (стр. 33) Режим терморегулирования Термоцикпер 1000 использует один из двух режимов терморегулирования для определения момента достижения пробой заданной температуры: • Расчетный режим: если введенное значение объема пробы находится в пределе от 1 до 50 мкп (или 30 мкл для реакционных модулей с 384 лунками), то термоциклер рассчитает температуру пробы на основании объема пробы. Этот режим является рекомендованным режимом терморегулирования, т.к. он наиболее точно представляет действительную температуру пробы. • Блочный режим: если вы вводите нулевое значение объема пробы ( О мкп), то термоцикпер допускает, что температура пробы равна температуре, замеренной в блоке. Выбор температуры крышки Регулируемая нагреваемая крышка позволяет пользователю изменять температуру и усилие зажима крышки. Нагрев крышки предохраняет пробирки и планшеты от образования внутреннего конденсата. В процессе выполнения анализа нагреваемая крышка прибора СЮОО поддерживает температуру, указанную для выполняемого в этот момент протокола. Без нагреваемой крышки может произойти потеря воды из реактивов и образование конденсата, увеличивая тем самым концентрацию реактивов в пробирках и планшетах. По умолчанию задана температура крышки термоциклера 105°С. Примечание: если блок работает в режиме бесконечной выдержки при температуре ниже параметра Cutoff (порог выкпючения), то нагревателем крышки будет поддерживаться температура 31,0°С. Стандартная настройка Cutoff (порог выкпючения) равна 30.0°С. Для изменения стандартной настройки Cutoff, выберите u t iiitie s > Adm inistrator Settings> Incubate Settings (утилиты - настройки администратора - настройки инкубации), зарегистрировавшись, как администратор. 6 8 --- стр. 73 --- Термоциклер 1000 - Руководство Т. Оптимизация ПЦР-анализа с помощью 1000™ Оптимизация ПЦР-анализа очень важна для успешного проведения реакций и их повторяемости. Оптимизация включает выбор лучших реактивов, а также выбор оптимальных температур и времени выдержки для каждого этапа протокола. Совет: Используйте автоматический генератор протоколов для создания рекомендованного протокола ПЦР для запуска («Создание протокола с помощью автоматического генератора протокола» на стр. 24). В этой главе рассказывается, как использовать свойства термоцикпера С 1000 для дальнейшей оптимизации протоколов ПЦР: • Оптимизация для ускорения протокола ПЦР (ниж е) • Оптимизация температуры гибридизации путем введения температурного градиента (стр. 73) • Оптимизация режимов работы с малыми объемами проб (стр. 74) • Перенос выполненных протоколов на другой термоциклер (стр. 75) • Выявление и устранение проблем ПЦР-анализа (стр. 75) • Выбор совместимого инвентаря для ПЦР-анализа, в том числе микропланшеты, уплотнители, пробирки и колпачки (стр. 76) Более полную информацию и пособия по оптимизации ПЦР-анализов можно получить на сайте Genomics ( www.bio-rad.com/genomics) . Этот сайт включает Am plification Central (амплификационный центр), где вы можете найти ссылки на множество ресурсов для проведения ПЦР-анализов, вкпючая Tutorials (руководства), подсказки Assay Design (по составлению проб), PCR Doctor (диагностика ПЦР-анализа) для выявления и устранения неисправностей и технической поддержки. Чтобы открыть, зарегистрируйтесь на сайте Genomics ( www.bio-rad.com/ genomics), и выберите Support > Am plification Central (поддержка - амплификационный центр). Оптимизация для ускорения протокола Оптимизируя протокол для ускорения ПЦР-анализа, можно сократить общее время выполнения на одну треть. По сравнению с этим, выполнение того ж е протокола на термоциклере, у которого увеличена только скорость линейного нарастания, сократит общее время выполнения на минуты. Кроме того, оптимизация протокола ради улучшения показателей скорости может также улучшить результаты ПЦР-анализа. Совет: автоматическое создание протокола, оптимизированного для улучшения показателей скорости, с помощью автоматического генератора протокола (стр. 23). Полная оптимизация протокола включает подбор соответствующих реактивов, ферментов и праймеров, а также тестирование параметров протокола ПЦР. Более подробную информацию по оптимизации протоколов по ускорению ПЦР-анализа можно найти на сайтах, перечисленных здесь. 69 --- стр. 74 --- В этих статьях содержаться советы по оптимизации реактивов в дополнение к советам по оптимизации протокола ПЦР, представленных в данном разделе: • Gene Expression Gateway ( www.bio-rad.com/aenomics) : Зайдите на сайт и выберите Application I Techniques > Quantification > Fast PCR. (применение|технологии - определение количества - быстрый ПЦР-анализ) • BioRadiations Magazine (журнал радиобиология), подшивка 118 в PDF: зайдите на сайт discover.bio-rad.com и найдите Literature (литература) (стр. 3 ) касательно «быстрого Ш ЦР- анализа» ( “Fast PCR” ) . Для оптимизации протокола ПЦР ради его ускорения с использованием свойств термоциклера, выполняйте следующие рекомендации: • Укорачивание этапа денатурации в течение цикпирования Для начального этапа денатурации требуется более длительное время выдержки, чем для этапов денатурации в течение каждого цикла. Это отличие вызвано активацией полимеразы и большей длиной исходного образца (матрицы) ДНК. Как только объект ПЦР амплифицирован (многократно копирован), то ампликоны, затем, будут служить в качестве коротких образцов (матриц), которые проще денатурировать в ходе циклирования. Для укорачивания этапа денатурации введите время выдержки 1 секунда для продуктов ПЦР, которые состоят из менее 500 пар оснований (Ь р). Затем протестируйте укороченное время выдержки, чтобы убедиться, что 1 секундная денатурация достаточна для продуцирования ампликонов. В качестве альтернативы, можно добавить приращение (стр.51) на этапе денатурации для определения наилучшего времени выдержки. • Создание двухэтапного протокола путем объединения гибридизации и удлинения в один этап Большинство полимераз остаются активными на протяжении всего диапазона температур гибридизации (от 55 до 70°С). Сократите общее время выполнения путем создания двух этапного протокола, в котором этапы гибридизации и удлинения объединены в один этап. Двухэтапный протокол может выдавать результаты, схожие с результатами трехэтапного протокола для заданной последовательности до 200 пар оснований. Чтобы создать двухэтапный протокол, оставьте этап гибридизации с температурным воздействием и пропустите этап удлинения. Затем настройте время выдержки этапа гибридизации на основании длины вашего ампликона. Начните со времени выдержки, которое равняется 10 секунд на 100 пар оснований объекта. В качестве альтернативы, оптимизируйте температуру гибридизации, используя температурный градиент через блок, и выберите итоговую температуру гибридизации из лучших результатов исследования градиента. В качестве примера см. «Оптимизация температуры на этапе гибридизации с помощью градиента» (на стр. 73). Оптимизация этапа гибридизации важна, т.к. она определяет специфичность реакции. Если температура гибридизации слишком высока, то праймеры не будут свободно гибридизировать, а, если температура гибридизации слишком низкая, то результатом реакции будет низкая продуктивность ПЦР, ошибочное спаривание праймеров и неспецифическая амплификация. • Оптимизировать этапы температурного воздействия для минимизации линейного нарастания Чем больше температурный перепад между двумя последовательными этапами протокола, тем больше времени требуется для достижения следующего заданного значения температуры. Сократите время выполнения путем минимизации перепада заданных температур между последовательными этапами. Для минимизации температурных перепадов используйте температурный градиент, предварительно добавив его в протокол (стр.50), Начните с оптимизации разности температуры гибридизации и температуры удлинения. Используйте результаты эксперимента по введению градиента для определения максимально возможной температуры гибридизации без ущерба продуктивности ПЦР-анализа. В качестве примера см. «Оптимизация температуры на этапе гибридизации с помощью градиента» (на стр. 73). В заключение, выберите температуру гибридизации с самым маленьким температурным перепадом между ней и температурой удлинения. • Минимизировать этап итогового удлинения Термоциклер 1000 - Руководство | Оптимизация ПЦР с помощью СЮ ОО™ 70 --- стр. 80 --- Руководство для термоциклера 1000 8 . П апки и файлы протокола Необходимо прочитать данную главу, чтобы ознакомиться с компонентами протокола 1000 и методами управления файлами протокола: • Опции и этапы протокола (ниж е) Управление папками и файлами протокола, включая копирование, переименование, удаление и перемещение файлов и папок (стр. 82) Содержание файла протокола Протокол ПЦР основан на этапах температурных воздействий, при которых пробу выдерживают при расчетной температуре в течение особого периода времени (называемого время выдержки). Кроме того, протокол ПЦР включает цикл, при котором этапы температурного воздействия повторяются много раз. Этапы градиентной температуры - специальные этапы, которые включают температурный градиент модуля. В целом, протокол ПЦР включает следующие типы этапов: 1 . Первоначальный этап температурного воздействия Данный первоначальный этап температурного воздействия изменяет естественные свойства матрицы, а также активирует полимеразу. Для того чтобы добавить исходный этап в файл протокола 1000, добавьте этап температурного воздействия в этап (стр. 48). 2 . Цикл этапов для расширения изделия ПЦР Данный ряд этапов температурного воздействия циклично повторяется и расширяет изделие ПЦР. Обычно цикл включает три этапа температурных воздействий, называемых этапами денатурации, гибридизации и удлинения. Данные этапы изменяют естественные свойства матрицы ДНК, обеспечивают гибридизацию праймера для матрицы и позволяют полимеразе растянуть комплементарную нить ДНК. Хотя при определенных условиях этапы гибридизации и удлинения сочетаются в более коротком двухэтапном цикле. Для того чтобы добавить этапы денатурации, гибридизации или удлинения в файл протокола 1000, необходимо добавить этап температурного воздействия (стр. 59) или этап градиента (стр. 50). Чтобы периодически повторять данные этапы температурных воздействий, необходимо добавить этап GOTO непосредственно после последнего этапа, который вы хотели бы, чтобы повторился (стр. 57). 3 . Заключительный этап температурного воздействия для расширения изделия ПЦР Данный заключительный этап температурного воздействия предназначен для завершения усиления любого изделия ПЦР, которое было растянуто не полностью во время циклической работы. Для того чтобы добавить заключительный этап удлинения в файл протокола 1000, необходимо добавить этап температурного воздействия. 77 --- стр. 81 --- Руководство для термоциклера 1000 | Папки и файлы протокола Этап протокола 1000 отличается от типового этапа протокола ПЦР. Если вы пересылаете типовой протокол ПЦР на 1000, вы транслируете этапы на три типа этапов протокола: • Температурное воздействие, которое идентично типовому этапу протокола ПЦР • Градиент, который является этапом температурного воздействия, которое вкпючает температурный градиент • GOTO, который используется для добавления контуров и создания цикла в ПЦР Параметры и этапы протокола Термоцикпера 1000. Наименование этапа Параметры и диапазон Описание Температурное воздействие Температура С: Расчетная температура между 0,0 и 100,0 °С в десятых градуса Послать команду на термоцикпер для перехода на расчетную температуру, и выдержать данную температуру в течение определенного количества времени Время: Время выдержки между 1 секундой и 18 часами в формате часы: минуты: секунды. Чтобы ввести бесконечную выдержку, нажмите клавишу °° (бесконечное, 0 ) Градиент Нижний: Нижняя температура в градиенте. Ввести число между 30,0 и 99,0°С в десятых градуса. Верхний: Верхняя температура в градиенте. Максимальная температура составляет 100°С. Ввести температуру в пределах 24,0°С нижней температуры. Диапазон: Диапазон градиента Послать команду на термоциклер для перехода на расчетный температурный градиент по всему модулю, и выдержать данный температурный градиент в течение определенного количества времени Время: Время выдержки между 1 секундой и 18 часами в формате часы: минуты: секунды. Чтобы ввести бесконечную выдержку, нажмите клавишу °° (ноль, 0 ) GOTO GOTO: Число первого этапа во время повтора ADDTNL r e p e a t s: Количество дополнительных раз, при которых этапы температурных воздействий повторяются Этап протокола, который посылает команду на термоциклер для повтора ряда этапов в течение определенного периода времени ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество циклов в протоколе - число повторов GOTO плюс первый цикл 78 --- стр. 82 --- Содержание файла протокола Опции для этапов температурного воздействия и градиента Каждый этап температурного воздействия или градиента 1000 может включать дополнительные параметры. На экране Options (Опции) отображаются данные параметры. Далее изображен экран Options (Опции): S te p 3 T e m p e ra tu re ^ G r a d ie n t R a n g e I n c r e m e n t R a m p R a te T im e E x te n d 0 :3 0 С С C / c y c le C / s e c s e c / c y c le □ в е е р Каждый этап температурного воздействия может включать следующие параметры: • Температура и Время (требуемое): Изменить расчетную температуру и время выдержки на этапе • Градиент: Создать температурный градиент по всему модулю во время этапа • Увеличение: Изменить расчетную температуру при каждом цикпе • Скорость перехода: Изменить скорость перехода в течение этапа • Увеличение: Увеличить время выдержки во время этапа при каждом цикле • Звуковой сигнал: Добавить звуковой сигнал в конце этапа 79 --- стр. 83 --- Руководство для термоциклера 1000 | Папки и файлы протокола В Таблице представлены все дополнительные параметры для этапов температурного воздействия и градиента. Кроме того, в таблицу включены границы и диапазоны параметров: Опции для этапов температурного воздействия и градиента Опция Параметры и диапазон Описание Увеличение Температура от -10,0 до 10,0°С на цикл в десятых градуса Применяется только для этапов температурного воздействия (стр. 48). Послать команду на термоциклер для увеличения (изменения) расчетной температуры этапа с каждым циклом, при котором положительное число увеличивает температуру, а отрицательное число уменьшает температуру Скорость перехода Число от 0,1 до 5°С/ сек. Применяется только для этапа температурного воздействия (стр. 48). Послать на термоциклер команду перехода на расчетную температуру при заданной скорости перехода во время этапа. Используется только для двойных 48 и 96 модулей бьютрой обратной связи Увеличение Время от -60 до 60 секунд/цикл Применяется как для этапов температурного воздействия, так и для этапов градиента. Послать на термоциклер команду увеличить время выдержки с каждым циклом, при котором положительное число увеличивает время выдержки, а отрицательное число - уменьшает Звуковой сигнал • (Нет параметров) Применяется только для этапов температурного воздействия (стр. 48). Послать на тремоциклер команду подачи звукового сигнала по достижению термоциклером расчетной температуры данного этапа Относительно более подробной информации касательно создания протокола с данными этапами см. стр. 47. Управление файлами и папками протокола Для управления файлами и папками протокола, нажать кнопку f i l e s ( файлы) в Main Menu (Главном меню) , чтобы открыть библиотеку файлов. Меню клавиш в библиотеке файлов предусматривает опции для управления папками и файлами. Опции кнопки меню будут меняться зависимости от выбора библиотеки файлов. Далее в таблице перечислены все функции в опции Files (Файлы): 80 --- стр. 84 --- Создание и копирование папок, переименование термоциклера Перечень функций в опции f i l e s (файлы) Функция Описание протоколы : Копирование/перем ещение протокола Копирование или перемещение существующего протокола в другое местоположение папки Удсшить протокол Удаление протокола Переименование протокола Переименовать протокол папки : Создание папки Создать новую папку Копировать ВСЕ Копирование всех файлов из одного положения в другую папку существующего протокола Копирование/перем ещение папки Копирование или перемещение существующей папки на другой термоциклер или флеш-память Удавление папки Удалить папку и все содержимое Переименовать папку Переименовать папку Переименовать термоциклер Переименовать термоциклер Главное меню Возврат в главное меню ПРИМЕЧАНИЕ: Название файла может содержать до 8 символов Создание и копирование папок, переименование термоциклеров Библиотека файлов на единичном уровне отображает функции доступные для управления папками и переименования термоцикперов. В настоящем разделе представлены последовательные инструкции по использованию данных функций: • Выбрать Create Folder (Создать папку) для создания новой папки на термоциклере С 1000, и подкпючить S1000 или флеш-память. • Выбрать Сору A ll (Копировать все), чтобы скопировать все файлы из одного источника в другой, подключив термоциклер или USB флеш-память, • Выбрать Rename Cycler (Переименовать датчик циклов) Д Л Я переименования термоциклера • Выбрать Main Menu (Главное меню) для возврата в Главное меню Создание папки Для того чтобы начать создание новой папки, необходимо выбрать f i l e s (файлы) в Главном меню, чтобы выбрать Create Folder (Создать папку). При создании новой папки необходимо следовать данным инструкциям: 1 . Выбрать термоциклер или флеш-память для создания новой папки 81 --- стр. 92 --- Копирование, перемещение, удаление и переименование протоколов Выбрать папку, в которую будет копироваться протокол, нажать yes ( д а) S o u r c e 8 B S S S rary - I P R F 8 K B ± ^ I P R F 1 5 K B liiJ S T D 2 liU 5 T D 3 I liJ T C H D O W N • 1 l £ 1 2 | N E S T P R 2 = l ± l о A V A Ы ^ U S B D R I V E E ^ L U C Y i ftl£3MAlN . Й 0|Дйз в U S B D R I V E И ! £) m ain ( 1 + i Q D A V I D ! ± I t U S E R S ^ С о р у " I J U C Y W A I N V H E S T P R 3 '' Т о "Ш СтУА"? 89 --- стр. 93 --- Руководство для термоциклера 1000 Подтверждение, что протокол был успешно скопирован \ L U C Y \ A V A \ N E S T P R 3 В ^ L U C Y а M A I N Э 0 A V A ^l2!123jS tliJ r S C R I P T а # U S B D R I V E P R E V I O U S R U N S Ш S Y S T E M В ^ U S E R S » M E T H O D C A L C ж H O T U D 1 0 5 3 V O L U M E 1 0 T E M P 9 5 .0 , 1 8 0 T E M P 9 5 .0 ,3 0 T E M P 5 5 .0 ,3 0 T E M P 7 2 .0 ,3 0 G O T O 2 ,3 9 T E M P 7 2 .0 ,4 2 0 T E M P 4 .0 ,0 T E M P 9 5 ,0 ,3 0 T E M P 5 5 .0 ,3 0 T E M P 7 2 .0 ,3 0 P r o t o c o l s u c c e s s f ij ly c o p ie d f Copy/M ove « C v * D elete Renam e . ; ; рго*теы „^1^лс*осы 1 Protect Перемещение протокола ^ Для начала перемещения протокола необходимо выбрать FILES (файлы) в Главном меню, затем посредством СТРЕЛОК выбрать протокол, далее нажать copy/Move Protocol (Копировать/переместить протокол) Для перемещения протокола необходимо следовать следующим инструкциям: 1 . Выбрать Move Protocol (Переместить протокол) 2. Посредством СТРЕЛОК ВВЕРХ И ВНИЗ выбрать новое положение папки 3 . Нажать yes ( д а) для подтверждения Удаление протокола Для начала удаления протокола необходимо выбрать FILES (файлы) в Главном меню, затем посредством СТРЕЛОК выбрать протокол, далее нажать Delete Protocol (Удалить протокол) Для удаления протокола необходимо следовать следующим инструкциям: 1 . Посредством СТРЕЛОК ВВЕРХ И ВНИЗ выбрать папку для удаления 2 . Выбрать Delete Protocol (Удалить протокол) ^ 3 . нажать Yes (ДА) для подтверждения 9. Техническое обслуживание и устранение неисправностей В настоящей главе представлены предложения по техническому обслуживанию и устранению неполадок в термоциклере 1000™. • Очистить и содержать в исправности термоцикпер 1000 для оптимальной безопасности и эксплуатационных характеристик (далее) • Поддерживать достаточный воздушный поток вокруг термоциклера для оптимизации температурного контроля во время эксплуатации ПЦР (стр. 95) • Устранения неполадок при появлении сообщений об ошибках термоциклера, включая интерпретацию и реакцию на сообщения об ошибках (стр. 96) Очистка и содержание в исправном состоянии термоциклера 1000 Для термоциклера 1000 требуется техническое обслуживание в небольшом объеме для поддержания надлежащей эксплуатации и точного температурного контроля. Однако при длительном и непрерывном использовании для термоциклеров будет 90 --- стр. 94 --- Руководство для термоциклера 1000 требоваться небольшая очистка и прочее техническое обслуживание: • Очистка основания (далее) • Очистка реакционного модуля (стр. 94) • Замена плавких предохранителей (стр. 96) ПРИМЕЧАНИЕ: Для роботизированной установки, при которой постоянно эксплуатируется большое количество инструментов, необходимо применять регулярную программу проверок на пыль, разлитые жидкости и грязь, которые могут препятствовать оптимальной работе инструментов. Очистка основания термоциклера 1000 1000 должен проходить очистку регулярно по графику, чтобы удалить любой мусор или грязь, которые могут препятствовать надлежащей эксплуатации. Необходимо очистить основание, чтобы предотвратить повреждение воздухозаборник а или отсека реакционного модуля. В целом, всегда следует использовать мягкую ткань и воду для быстрого вытирания разлитых растворов и отходов. ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно инструкций по транспортировке и очистке радиоактивных или биологически опасных материалов, проконсультируйтесь с указаниями по радиоактивной и биологической безопасности, представленными вашей организацией. Данные указания вкпючают методы очистки, контроля и устранения опасных материалов. Для того чтобы очистить основание, необходимо следовать следующим инструкциям, обратив особое внимание на предупреждения: Ф 91 --- стр. 96 --- • Очистка лунок блока: немедленно удалите пролитую жидкость, чтобы не допустить их высыхания. Использовать одноразовые пластиковые пипетки с водой (рекомендовано), 95% этиловым спиртом или раствором отбеливателя и воды 1:100. Всегда промывать лунки водой несколько раз, чтобы удалить все следы этилового спирта, отбеливателя или мыла. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Отбеливатель, этиловый спирт или мыло, которые остаются в блоках, могут разъедать блок и/или уничтожать трубки и микропланшеты во время эксплуатации. Всегда следует промывать лунку блока после очистки любым раствором отличным от воды. Не рекомендуется использовать масло в лунках. Однако если используется масло, лунки должны часто и тщательно очищаться. Очистить масло, если оно обесцвечено или содержит грязь. Необходимо использовать 95% этиловый спирт для очистки масла. Нельзя допустить, чтобы масло накапливалось в блоке. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Никогда не нагревайте блок после добавления моющего раствора. Нагревание блока с моющим раствором повредит блок, крышку и основание термоциклера. • Очистка внутренней крышки: Необходимо использовать мягкую ткань и воду для удаления грязи и растворов с поверхности внутренней крышки. Никогда не используйте абразивных моющих средств или грубого материала, который может поцарапать поверхность. Очистка внутренней крышки улучшает точность нагревания и охлаждения пробы. • Очистка поверхности наружной крышки: Необходимо использовать влажную ткань или материю для удаления разлитых растворов с наружного корпуса. При необходимости следует использовать мягкий мыльный раствор, а затем протереть поверхность влажной тканью. Очистка крышки предотвратит коррозию. Обеспечение достаточного воздушного потока Термоциклер 1000 требует достаточного воздушного потока для точного нагрева и охлаждения, Если поток воздуха блокируется, температурный датчик цикла не может достичь надлежащей температуры в течение заданного время. В данный раздел включены инструкции по проведению испытаний воздушного потока и предложения по установлению низкого или теплого воздушного потока. Проведение испытаний относительно достаточного воздушного потока Воздушный поток является достаточным, если термоциклер бьютро нагревается и охлаждается до определенной заданной температуры. Если вы установили термоциклер 1000 в новое местоположение в первый раз, вы можете провести испытание относительно достаточного местного воздушного потока посредством следующих этапов: 1 . Установить прибор в то место, в котором вы планируете его использовать, и включить питание. Относительно инструкций по установке термоциклера см. стр. 5 . 2 . Отрегулировать местную среду для типовых условий Включить любое расположенное поблизости оборудование, такое как вентиляторы. Кроме того, открыть любые жалюзи для воспроизведения типовых условий во время эксплуатации. Если на участке находится более одного термоциклера, запустить протокол на всех термоциклерах одновременно. 3 . Запустить типовой протокол ПЦР на 30 минут Чтобы запустить протокол, вам не потребуется включать пробу, но обязательно необходимо включить пустой микропланшет или трубки. Крышка не будет нагреваться должным образом, если она соприкасается с горячим блоком модуля реакции обратной связи. 4. Измерение температуры воздуха на отверстиях воздухозаборника всех термоциклеров Если температура воздухазобрника превышает 3 1 °С, необходимо использовать следующую таблицу для обеспечения достаточного воздушного потока. Руководство для термоциклера 1000 | Техническое обслуживание и устранение неисправностей 93 --- стр. 97 --- Установление недостаточного воздушного потока Если температура воздуха возле температурного датчика цикла выше 3 1 °С, выполните одно или более из следующих изменений, чтобы увеличить поток воздуха охладителя вокруг термоциклера: • Отрегулировать кондиционирование воздуха до температуры ниже температуры окружающего воздуха • Переместить термоцикпер в другое положение Обеспечить больше пространства вокруг термоциклера 1000 и между соседними приборами. Расположить приборы таким образом, чтобы теплый отработанный воздух из одного прибора не поступал в отверстия воздухозаборника другого. • Защитить термоциклер от источников тепла, таких как радиаторы, прочих приборов, производящих тепло, и яркого солнечного света Замена плавких предохранителей Плавкие предохранители термоциклера 1000 предназначены для размыкания электрической цепи в случае резких скачков напряжения или других случаев электрического замыкания. Данный процесс защищает и пользователя, и прибор от чрезмерного электрического заряда. Данные плавкие предохранители необходимо заменять редко. Однако некоторые организации предпочитают производить замену плавких предохранителей регулярно для поддержания бесперебойной эксплуатации. Если термоциклер не включен, сначала проверьте, чтобы сетевой шнур был подключен к рабочему источнику питания. Кроме того, проверьте, чтобы сетевой шнур и источник питания находились в пределах технических характеристик для данного прибора (стр. 115). Чтобы заменить сетевой шнур, подключить техническую поддержку Bio-Rad (стр. 3 ). В конце проверить, чтобы плавкие предохранители не были повреждены. СЮОО работает с двумя плавкими предохранителями, которые имеют технические характеристики, перечисленные на стр. 115. Чтобы удалить и проверить плавкие предохранители, необходимо выполнить следующее: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Предотвращение повреждения электрическим током. Всегда отключайте прибор от электрического выхода перед проверкой плавких предохранителей. 1 . Использовать небольшую монетку для откручивания патрона предохранителя Руководство для термоциклера 1000 | Техническое обслуживание и устранение неисправностей Патрон плавкого предохранителя 2 . Вытащить патрон плавкого предохранителя и удалить плавкие предохранители 3 . Если плавкий предохранитель поврежден, заменить его исправным плавким предохранителем, и закрыть патрон. В неисправном плавком предохранителе видны обрывы и место пережога на металле. Исправный плавкий предохранитель имеет неповрежденный металл Устранение неполадок при появлении сообщений об ошибках термоциклера В целом, если 1000 отображает сообщения об ошибках или предупреждениях, инструкции относительно устранения проблемы содержатся в сообщении. Например, сообщение о предупреждении, которое отображается в случае, если внешнее питание отключается во время эксплуатации (стр. 97). В данном сообщении об ошибке указывается, какой протокол был запущен, когда протокол остановился в результате отключения питания, и температуру блока, когда термоциклер возобновил работу. 94 --- стр. 98 --- Устранение неполадок при появлении сообщений об ошибках термоциклера В настоящий раздел включены пояснения относительно следующих сообщений об ошибке и предупреждении • Повторный запуск после отключения питания (далее) • Сообщения об ошибке термоциклера 1000 (стр. 97) Повторный запуск после отключения питания Если внешнее питание отключается, в то время как термоциклер запускает протокол, 1000 возобновляет работу протокола, как только питание восстанавливается. В этом случае следующее сообщение об ошибке предупредит вас о том, что протокол был прерван: Имя протокола 1 0 0 0 Series T h e m M i C y c ftig P la t t o n m .E V 0 0 0 H2 R u n n in g o n A A / C P o w e r F A I L E D . P o w e r o u ta g e d u r in g : C y c le 1 S te p 3 R e s ta rte d a t 9 7 .2 1 0 / И / 2 0 0 7 lOtHiig О P r e s s a n y k e y to d e a r t h is in e s s a g e Ш .N ew ^ 'Ptotocfl Отключение питания также записывается в Run Logs (Синхронных протоколах). ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Отключение питания может изменить итог работы ПЦР. Время выдержки для этапа, который был запущен в то время, когда питание отключилось, увеличивается, являясь причиной того, что проба отличается от заданной температуры до тех пор, пока питание не будет восстановлено. Сообщения об ошибках и предупреждения 1000 отслеживает ошибки, которые происходят во время эксплуатации. После эксплуатации отображаются все сообщения. Например, если работа остановлена, отображается следующий экран PROTOCOL CANCELLED (ПРОТОКОЛ ОСТАНОВЛЕН): Экран отмены работы протокола : 1 ; % .■ ) ■ ; г i 3 i 4 ' 1 g ,,, I 1 ___ R U N WAS CAN CELLED 1 1 0:07 1 0 / 1 1 / 2 0 0 7 ^ i : f ^ S ir r ^ « !5 7 .9 * C U d : 1 0 2 * C ^ : 5 0 T I d le . 95 --- стр. 103 --- Меню настроек администратора • Run Logs (Синхронные протоколы) : Обзор синхронного протокола каждый раз, когда запускается протокол. Протокол также может быть скопирован на USB флеш-память (для использования при обслуживании датчика цикла) • System Usage Log (Протокол использования системы): Обзор протокола, который содержит перечень всех событий, которые произошли во время каждого запуска • System Messages Log (Протокол сообщений системы): Обзор сообщений, которые появлялись во время всех запусков • Adm inistrator Settings (Настройки администратора): Открытие функций администратора (стр. 102) ПРИМЕЧАНИЕ: Только зарегистрированный Администратор имеет доступ к настройкам Администратора. • Service Menu (Сервисное меню): Функции, ограниченные для обслуживающего персонала из Bio-Rad Laboratories • Та C alculator (Калькулятор): Обзор И использование калькулятора Tg Д Л Я расчета температуры таяния для пары праймеров • Gradient C alculator (Калькулятор градиента): Расчет градиента температуры по всему блоку Функция калькулятора градиента На Gradient C alcu lator (калькуляторе градиента) отображается температурный градиент по всему блоку. Использовать данный калькулятор для обзора температуры в особой лунке или батареи. Для того чтобы рассчитать и изучить температурный градиент на блоке, необходимо выполнить следующее: 1 . Открыть меню Utilities (утилиты) 2. Выбрать Gradient Calculator (Калькулятор градиента) 3 . Ввести нижнюю temperature (температуру) и Gradient Range (Диапазон градиента): т G radient T e m p e ra tu re G r a d ie n t R a n g e1 0 ,0 О U s * K « y p > d t o n a v lg jt * b e t w * « n t h * r o w s . A В С D E F G H 6 0 .0 5 9 .4 5 8 .3 5 6 .3 5 3 .9 5 2 .0 5 0 .7 5 0 .0 Меню настроек администратора ПРИ1\/1ЕЧАНИЕ: Только зарегистрированный Администратор может иметь доступ к меню Adm inistrator Settings (Настройки администратора). Меню Adm inistrator Settings (Настройки администратора) содержит все функции, необходимые для настройки уровней доступа и значений, устанавливаемых системой по умолчанию для термоциклера 1000. Открыть данный перечень 103 --- стр. 104 --- Меню настроек администратора выберите Настройки меню администратора в списке СВОЙСТВ и нажмите кнопку ВВОД. Изображение ниже показывает варианты настроек меню администратора: !fe?ttnqT?4Siu ■ 2 ; S e t A c c e s s L e v e l 3 ; L o g F ile s M y ia o e m e n t 4 ; S y s te m B a c k u p a n d R e s to re 5 ; U s e r M a n a g e m e n t 6 ; I n c u b a te S e ttin g s 7 i H C 1 2 U p d a te r 8 : Р Х Д 2 7 0 U p d a te r 9 : F X 2 U p d a te T 0 : D ia q n o s b c T e s t U s « k tv p id t o i t « m t h * n p n s s E n i* r Ф Меню настроек администратора включает следующие опции: • Set Date/Time (Настроить дату/время) : Выбрать данную опцию для настройки даты и времени на термоциклере • Set Access Level (Установить уровень доступа): Выбрать данную опцию для настройки уровней доступа пользователя как open (Открыто) или Secured (Закрыто) • Log F ile s Management(Управление журналами регистрации): Выбрать данную опцию для очистки или настройки журналов регистрации • System Backup and Restore (Восстановление и резервное копирование системы): Выбрать данную опцию для восстановления и резервной записи настроек системы из флэш-памяти • User Management (Управление пользователя): Выбрать данную ОПЦИЮ для добавления или удаления пользователей и сброса паролей • System Settings (Настройки системы): Выбрать данную ОПЦИЮ для установки параметров инкубации по умолчанию для температуры крышки, отсекания крышки и температуры инкубации • НС12 Updater(Корректор НС12), РХА27 0 Updater (Корректор РХА270), FX2 Updater (Корректор FX2): Выбрать данные опции для обновления встроенного программного обеспечения на термоциклере • Diagnostic Test (Диагностический т е с т ) : Выбрать данную опцию ДЛЯ выполнения ряда или подмножества диагностических внутренних тестов на термоциклере (для использования при обслуживании термоциклера) 104 --- стр. 105 --- Меню настроек администратора Ф у н к ц и и с и с т е м н о й п а п к и Системная папка обеспечивает доступ к планшетам и данным в масштабе всей системы. Ниже на рисунке представлено содержимое Системной папки: \ S Y S T E M а ^ E V 0 0 0 0 0 1 S 4^ U S B D R I V E f fl P R E V I O U S R U N S i El R U N _ L O G S t£ R T _ D A T A ! Ш iS L T E M P L A T E S U S E R S О U s * ( h e a r r o w s o n t h e k e y p a d № M x lg a ie ih r o u g h ( h e f i l e t r e e . P r e s s " E N T E R " t o e x p a n d a n d c o lla p s e f o ld e r s , Каталоги в Системной папке обеспечивают доступ к следующим функциям: • RT DATA (Данные реального времени); Просмотр данных в реальном времени, которые были собраны посредством приборов обнаружения в реальном времени CFX96 или CFX384 . RUN LOGS (Журналы учета эксплуатации): Просмотр или загрузка журналов из запуска • TEMPLATE (Планшет): Редактирование ИЛИ создание файла протокола, используемого по умолчанию, для термоциклера И с п о л ь з о в а н и е п о р т а д а н н ы х Ф Термоциклер 1000 имеет несколько портов данных, которые могут быть использованы для передачи данных на термоциклер и от него: • USB порт А ниже панели управления: Использовать данный порт для передачи данных на флэш-память и из нее или для подключения клавиатуры или мыши USB. • USB порт В на задней панели: Использовать данный порт для подключения компьютера для запуска термоциклера С1000 и любого подсоединенного термоциклера S1000. • Четыре USB порта А, расположенных на задней панели: Использовать данные порты для подключения до четырех термоциклеров S1000, флэш-памяти, мыши или клавиатуры. • Контрольный порт на задней панели П о д к л ю ч е н и е у с т р о й с т в U S B В Использовать USB порты В для подключения термоциклера 1000 к компьютеру. П о д к л ю ч е н и е у с т р о й с т в U S B А Через USB порт А может быть подключено любое из следующих устройств USB: Подключить клавиатуру Подключить флэш-память 105 --- стр. 108 --- Контроль S1000 посредством С1000 Э к с п л у а т а ц и я S 1 00 0 п о д к о н т р о л е м С 1000 Если S1000 находится под контролем СЮОО, он находится в «режиме полублокировки». В режиме полублокировки S1000 не будет реагировать при нажатии клавиш панели управления. Однако на панели управления работают следующие клавиши: • Клавиша SCREEN (Экран): Нажать данную клавишу для перехода к экрану работы, графическому экрану и экрану оставшегося времени. • Клавиша PAUSE (Пауза): Нажать данную клавишу для временной остановки протокола, который запущен на S1000 • Клавиша ENTER (Ввод): Нажать данную клавишу для начала запуска, команда о котором была дистанционно отправлена с СЮОО • Клавиша ENTER (Ввод): Нажать данную клавишу для пропуска этапа • Клавиша CANCEL (Отмена): Нажать данную клавишу для отмены протокола, который в текущее время запущен на S1000 А в т о м а т и ч е с к и й к о н т р о л ь д л я р о б о т о т е х н и ч е с к и х с и с т е м Серия 1000 способна реагировать на команды роботизированного контроля в мощном потоке работ. Для подключения СЮОО к робототехнической системе используйте USB порт. После подключения роботизированные команды автоматизируют основные операции СЮОО. Для получения информации о данных командах необходимо загрузить Руководство по автоматизации из Шлюза экспрессии генов (www.bio- rad.com/genomics). Данное руководство включает инструкции и команды для запуска СЮОО под контролем робототехнической системы. Ю8 --- стр. 109 --- Руководство по термоциклеру 1000 П р и л о ж е н и е А : П р е д в а р и т е л ь н о у с т а н а в л и в а е м ы е п р о т о к о л ы Термоциклер 1000 поступает с предварительно устанавливаемым протоколом, который предоставляет планшет для запуска новых экспериментов ПЦР. Используйте данные протоколы в качестве шаблонов. В следующих разделах описаны предварительно устанавливаемые протоколы, и включены советы относительно того, когда их следует использовать: • Стандартные 2- и 3-этапные протоколы (ниже). • Протокол контакта (touchdown) ПЦР во избежание неспецифического связанного праймера (стр. 110). • Протоколы iTaq оптимизированы для запуска с полимеразой запуска iTaq ^ '^ из горячего состояния (стр. 110). • Протоколы iProof оптимизированы для запуска с полимеразой iProof^'^ высококачественного воспроизведения (стр. 111). • Протоколы обратной транскрипции для расширения ДНК из планшета РНК (стр. 112) • Протоколы вложенного праймера (nested primer) для расширения особой последовательности ДНК из большого комплексного планшета ДНК (стр. 112). С т а н д а р т н ы е п р о т о к о л ы Два стандартных протокола, которые запускают двух- и трехэтапный ПЦР со стандартной полимеразой ДНК. Выбрать данные протоколы для начала запуска GWH с новыми праймерами и шаблоном ДНК или скопировать их для начала записи нового протокола. В таблице 14 перечислены параметры в каждом протоколе. Таблица 14. Стандартный протокол* STD2 STD3 Запуск стандартного двухэтапного протокола Запуск стандартного трехэтапного протокола Этап Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин:сек) или повторы Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин:сек) или повторы 1 95 3:00 95 3:00 2 9 5 * 0:30 9 5 * 0:30 3 65 0:30 55 0:30 4 GOTO 2 29х 72 0:30 5 72 7:00 GOTO 2 29х 109 --- стр. 110 --- Руководство по термоциклеру 1000 Таблица 14. Стандартный протокол* 6 Бесконечная выдержка 72 1:00 ОКОНЧАНИЕ Бесконечная выдержка °° ОКОНЧАНИЕ П р о т о к о л к о н т а к т а ( to u c h d o w n ) Испытания протокола контакта (touchdown) на наилучшую температуру гибридизации для особой пары планшета праймера. Выбрать данный протокол для испытания нового комплекта праймеров и шаблона ДНК на оптимальную температуру гибридизации. В Таблице 15 перечислены параметры в каждом протоколе Таблица 15. Протокол контакта (touchdown)* TCHDOWN Для запуска протокола с этапом температуры приращения, который автоматически обнаруживает наиболее жесткие требования для связывания праймера Этап Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин;сек) или повторы 1 95 3:00 2 9 5 * 0:30 3 60 (приращение при -0,5°С/ цикл) 0:30 4 72 0:30 5 GOTO 2 29х 6 95 0:30 7 45 0:30 8 72 0:30 9 GOTO 6 29х 1 0 72 7:00 1 1 4 Бесконечная выдержка 12 ОКОНЧАНИЕ П р о т о к о л ы п о л и м е р а з ы iT a q Полимераза ДНК iTaq - антителозависимая полимераза горячего пуска, которая подходит как для ПЦР, так и для реального времени. Протоколы iTaq запускают П 1 Д Р посредством оптимальных параметров 110 --- стр. 111 --- Протоколы полимеразы iProof для данной полимеразы и связанных буферов. Полимераза iTaq разработана для активации во время первого этапа при 98°С и увеличения небольших шаблонов до среднего размера. Таблица 16. Протокол iTaq* Этап iTAQ-FST Запуск быстрого HL Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) 98 9 2 * 70 GOTO 2 72 ОКОНЧАНИЕ Время (мин:сек) или повторы 0:30 0:01 0:10 29х 0:30 П р о т о к о л ы п о л и м е р а з ы iP r o o f Полимераза ДНК iProof - полимераза высококачественного воспроизведения, которая разработана для быстрой и точной амплификации длинных клеток-мишеней посредством проверочного считывания фермента, скомбинированного со связывающим белком ДНК. Данные протоколы iProof включают оптимальные параметры для данного фермента и соответствующих буферов, включая первоначальный этап при 95°С для активизирования фермента и заключительный этап длительного вытяжения. Каждый из этих протоколов настроен на отдельный диапазон заданных размеров. В Таблице 17 перечислены параметры в каждом протоколе. Таблица 17. Протокол iProof* IPRF1KB IPRF8KB IPRF15KB Амплификация до 1 кб или меньших значений Амплификация до 8 кб или меньших значений Амплификация до 15 кб или меньших значений Этап Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин:сек) или повторы Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин:сек) или повторы Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин:сек) или повторы 1 98 0:30 98 0:30 98 0:30 2 9 8 * 0:05 9 8 * 0:05 9 8 * 0:05 3 60 0:10 60 0:10 60 0:10 4 72 0:30 72 4:00 72 7:30 5 GOTO 2 29х GOTO 2 29х GOTO 2 29х 6 72 5:00 72 5:00 72 5:00 4 Бесконечная выдержка ^ 4 Бесконечная выдержка ^ 4 Бесконечная выдержка 00 111 --- стр. 112 --- Термоциклер серии С1000 Touch™. Руководство по эксплуатации, Таблица 17. Протокол iProof* ОКОНЧАНИЕ 1 ОКОНЧАНИЕ 1 ОКОНЧАНИЕ П р о т о к о л п о л и м е р а з ы IS c r ip t Таблица 18. Протокол IScript Этап Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (минхек) или повторы 1 25 5:00 2 42 30:00 3 85 5:00 4 4 Бесконечная выдержка 5 ОКОНЧАНИЕ П р о т о к о л ы в л о ж е н н о г о п р а й м е р а Вложенные праймеры усиливают особую последовательность ДНК из большого комплексного планшета ДНК, такого как геномная ДНК. В Таблице 19 перечислены параметры в каждом протоколе. Таблица 19. Протокол вложенного праймера* NESTPR2 NESTPR3 Для запуска двухэтапного протокола посредством вложенных праймеров Для запуска трехэтапного протокола посредством вложенных праймеров Этап Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин;сек) или повторы Расчетная температура (°С) или этап GOTO (перехода) Время (мин:сек) или повторы 1 95 4:00 95 0:30 2 9 5 * 0:30 9 5 * 0:30 3 65 0:30 55 0:30 4 GOTO 2 39х 72 0:30 5 72 7:00 GOTO 2 39х 6 4 Бесконечная выдержка 72 7:00 7 9 5 * 0:30 4 Бесконечная выдержка 8 65 0:30 95 0:30 9 GOTO 7 39х 55 0:30 10 72 7:00 72 0:30 C X II --- стр. 113 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. Таблица 19. Протокол вложенного праймера* 1 1 4 Бесконечная выдержка ^ GOTO 8 39х 12 ОКОНЧАНИЕ 72 7:00 13 4 Бесконечная выдержка оо 14 ОКОНЧАНИЕ cxiii --- стр. 124 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации Для редактирования существующего протокола: 1 . Нажмите кнопку Saved Files (Сохранённые файлы) в главном меню для открытия окна сохранённых файлов. 2 . Выберите файл для редактирования (стр. 1 3 ). 3 . . 1 1 -,г ;г Л| MN S a v e d F ile s Ш / V ' 11фH a w F o t t r М Л т О р Ч к ю * F i e O p d o n * Рисунок 13. Выбранный файл для редактирования. Нажмите кнопку Edit (Редактировать) для открытия окна редактирования протокола. Протокол будет отображен в графическом формате. 4 . Выберите требуемый пункт путём нажатия в любом месте этого пункта. 5 . Измените время или температуру путём нажатия на требуемую кнопку и ввода значения с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 6. Измените объём реакционной смеси или температуру крышки путём нажатия на требуемую кнопку и ввода значения с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 7 . Измените имя протокола путём нажатия кнопки Name (Имя) и ввода имени протокола с помощью всплывающей буквенно-цифровой клавиатуры. 8 . Нажмите кнопку Run (Выполнить) для выполнения протокола без его сохранения. В качестве альтернативы нажмите кнопку Save (Сохранить) для выбора имени файла, положения и папки, в которой будет сохранён протокол. 12 --- стр. 125 --- Термоциклер серии С1000 Touch™. Руководство по эксплуатации. Параметры протокола в таблице 7 представлен перечень параметров температуры и этапы перепада температуры с предельными значениями этих параметров. Таблица 7. Этапы и параметры протокола термоциклера серии СЮОО Touch. Название этапа Температура Диапазон перепада температуры Шаг Скорость изменения Увеличение времени Звуковой сигнал Параметры и диапазоны Температура в "С: целевая температура от 0,0 до 100,0°С в десятых долях градуса Время выдержки: Время выдержки от 1 секунды до 18 часов в формате чч:мин:сек. Для ввода бесконечного времени выдержки нажмите кнопку « > (бесконечность). Небольшой: небольшой перепад температуры. Введите значение от 30,0 до 99,0°С в десятых долях градуса Максимум: большой перепад температуры. Максимальная температура составляет 100°С. Введите значение 24,0“С нижнего предела температуры Время: Время выдержки от 1 секунды до 18 часов в формате чч:мин:сек. Для ввода бесконечного времени выдержки нажмите кнопку « (бесконечность). Температура от-10,0 до 10,0°С в цикпе в десятых долях градуса Число от 0,1 до 5°С в секунду Время от -60 до 60 сек в цикле (Нет параметров) Описание Подаёт команду на термоциклер о повышении температуры до целевого уровня и поддержании этой температуры в течение указанного времени Подаёт команду на термоциклер о повышении температуры до целевого уровня всего блока и поддержании этой температуры в течение указанного времени Применяется только к шагу температуры. Подаёт команду на термоциклер о приращении (изменении) целевой температуры этапа в каждом цикле, при котором положительное число повышает температуру, а отрицательное число снижает температуру. Применяется только к этапу изменения температуры. Подаёт команду на термоциклер о повышении температуры до целевого уровня с указанной скоростью изменения в этом этапе Применяется, как к этапам изменения температуры, так и этапам перепада температуры. Подаёт команду на термоциклер об увеличении времени выдержки с каждым цикпом. Положительное число увеличивает время выдержки, отрицательное число уменьшает время выдержки. Применяется только к этапу изменения температуры. Подаёт команду на термоциклер о подаче звукового сигнала о том, что термоциклер достиг целевой температуры для этого этапа. 13 --- стр. 126 --- Изменение значения целевой температуры и времени выдержки Для изменения целевой температуры и времени выдержки на этапе изменения температуры выполните следующие действия: 1 . Нажмите требуемую кнопку времени или температуры редактируемого этапа. 2. С помощью цифровой клавиатуры введите новое значение целевой температуры и времени выдержки. Вставка этапа выполнения протокола Вставьте этап выполнения протокола, если требуется новое значение температуры, параметра GOTO или этапа перепада температуры. Выполните следующие действия для вставки этапа в правой части существующего этапа выполнения протокола: 1 . Поставьте курсор слева от этапа, перед которым необходимо вставить новый этап. 2. Нажмите кнопку Insert (Вставить). 3. Выберите тип вставляемого этапа. Нажмите кнопку Temperature (Температура) для вставки этапа изменения температуры, кнопку Gradient (Перепад температуры) для вставки этапа перепада температуры или кнопку GOTO (Перейти к) для вставки этапа GOTO. 4. Новый этап изменения температуры имеет целевую температуру по умолчанию 50°С и время по умолчанию 30 сек (0:30). Нажмите кнопки времени или температуры для редактирования этих параметров в новом этапе. Удаление этапа выполнения протокола Для безвозвратного удаления любого этапа из протокола: 1 . Выберите удаляемый этап. 2. Нажмите кнопку Delete (Удалить) для удаления выбранного этапа. Добавление или удаление значения перепада температуры Для добавления перепада температуры в этап изменения температуры: 1 . Выберите этап в протоколе и нажмите кнопку Options (Опции). Термоциклер серии СЮОО Touch , Руководство по эксплуатации. 14 --- стр. 127 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации 2. В меню Step Options (Опции этапа) поставьте флажок в пункте Gradient. Флажок появится в пункте перепада температуры и появится диапазон значений перепада температуры (рис. 14). Рисунок 14. В меню Step Options отображается значение перепада температуры. 3. Нажмите любое значение перепада температуры для изменения значения с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. ПРИМЕЧАНИЕ: значение перепада температуры должно находиться в пределах от 1 до 24°С. ПРИМЕЧАНИЕ: этап перепада температуры может также включать параметр Extend (Увеличить), но не может включать такие параметры, как Increment (Приращение), Веер (Звуковой сигнал) или Ramp Rate (Скорость изменения). 4. Нажмите кнопку ОК для продолжения. 5. После того, как вы ввели значение перепада температуры в этапе, можно отредактировать максимальную и минимальную температуру, либо нажатием кнопок, либо с помощью меню Gradient Editor (Редактор перепада температуры) (рис. 15). Рисунок 15. Окно Gradient Editor. Для удаления значения перепада температуры: 1 . Выберите шаг перепада температуры, а затем нажмите кнопку Options. Появится меню Step Options. 2. Нажмите пункт Gradient для снятия флажка. 15 --- стр. 128 --- Термоциклер серии СЮ ОО Touch™. Руководство по эксплуатации. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Редактирование скорости изменения Для имитации термоцикпера, который работает с меньшей скоростью изменения по сравнению с термоциклером серии СЮ О О Touch, отредактируйте значение скорости изменения соответствующего этапа протокола. Для редактирования скорости изменения: 1 . Выберите этап в протоколе и нажмите кнопку Options. 2. Нажмите кнопку Ramp Rate. 3. Введите значение с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 4. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. 5. Для удаления скорости измерения выберите этап в протоколе, а затем нажмите кнопку Options. Появится меню Step Options. Нажмите кнопку Ramp Rate и используйте кнопку удаления символов на всплывающей цифровой клавиатуре для удаления символов. 6. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Добавление или удаления значения шага изменения температуры Приращение увеличивает или уменьшает целевую температуру на один шаг в каждом цикле. Для добавления или удаления шага изменения температуры: 1 . Выберите этап в протоколе и нажмите кнопку Options. 2. Нажмите кнопку Increment. 3. Введите значение с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 4. Нажмите кнопку ОК. 5. Для удаления шага изменения температуры выберите этап в протоколе, а затем нажмите кнопку Options. Появится меню Step Options. Нажмите кнопку Increment и используйте кнопку удаления символов на всплывающей цифровой клавиатуре для удаления символов. 6. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Добавление или удаление значения увеличения времени Для увеличения или уменьшения времени выдержки в каждом цикле используйте функцию увеличения времени: 1 . Выберите этап в протоколе и нажмите кнопку Options. 2. Нажмите кнопку Extend. 3. Введите значение с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 4. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. 5. Для удаления значения увеличения времени выберите этап в протоколе, а затем нажмите кнопку Options. Появится меню Step Options. Нажмите кнопку Extend и используйте кнопку удаления символов на всплывающей цифровой клавиатуре для удаления символов. 6. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. 16 --- стр. 129 --- Термоциклер серии СЮ ОО Touch™. Руководство по эксплуатации Добавление или удаление значения звукового сигнала Звуковой сигнал является звуком, подаваемым термоциклером при достижении им целевой температуры этапа протокола. Для добавления или удаления звукового сигнала: 1 . Выберите этап в протоколе и нажмите кнопку Options. Нажмите пункт Веер. В пункте Веер поставьте флажок. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. 2. 3. 4. Для удаления звукового сигнала выберите этап в протоколе, а затем нажмите кнопку Options. Появится меню Step Options. Удалите звуковой сигнал, нажав на пункт Веер для снятия флажка. 5. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Изменение параметров в этапе GOTO Этап GOTO подаёт команду на термоциклер о повторе набора шагов в цикле. Этот этап создает цикп в эксперименте PCR. На рисунке 16 показан пример, когда параметры этап включают шаг 1 GOTO и 34 дополнительных повтора. New Protocol — « о й и * Рисунок 16. Протокол, включающий этап 1 GOTO и 34 дополнительных повтора. Для изменения параметров в шаге GOTO выполните следующие действия: 1 . Для изменения номера шага GOTO нажмите кнопку Step Number (Номер шага). 2. Введите значение с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 3. Нажмите кнопку Repeat Times (Число повторов) для изменения числа повторяемых наборов шагов в цикле GOTO. 4. Введите значение с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 5. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Объём образца и температура крышки Объём образца — определяет режим контроля температуры 17 --- стр. 130 --- Температура крышки - определяет температуру нагреваемой крышки. Если температура слишком высокая, температура образца может подняться выше целевого уровня. Термоциклер серии СЮ ОО Touch обеспечивает два способа управления и ввода настроек объёма образца и температуры крышки: Измените настройку при создании и редактировании протокола (стр. 18). Измените настройку при выполнении операции (стр. 21). Режимы контроля температуры Термоциклер серии СЮ О О Touch использует один из двух режимов контроля температуры для определения времени достижения образцом целевой температуры: Режим вычислений - если введено значение объёма образца больше О , термоциклер рассчитывает температуру образца на основании объёма образца. Рекомендуется использовать режим вычислений, так как он более точно отображает фактическую температуру образца. Режим блока - при вводе значения объёма образца (0) мкл, термоциклер считает, что температура образца равна измеренной температуре блока. Выбор температуры крышки Регулируемая нагреваемая крышка термоциклера серии СЮ О О Touch позволяет пользователю контролировать температуру и усилие крышки. Нагревание крышки позволяет предотвратить образование конденсата внутри ячеек для проведения реакций. Во время работы термоциклера серии СЮ О О Touch нагреваемая крышка поддерживает температуру, указанную для выполняемого протокола. Без нагреваемой крышки вода из реагентов может перейти в состояние конденсата, создавая концентрацию реактивов в трубке или плашке. Температура крышки термоциклера серии СЮ О О Touch по умолчанию составляет Ю5°С для блоков для проведения реакций с 96 ячейками или двойных блоков с 48 ячейками и 95°С для блоков с 384 ячейками. ПРИМЕЧАНИЕ: если блок работает в течение неопределённого времени выдержки при температуре менее 30,0°С, температура нагревателя крышки составляет 31,0°С. Изменение объёма образца Для изменения объёма образца в меню нового протокола или в меню Protocol Editor: 1 . Нажмите кнопку Volume. 2. Введите значение с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 3. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. ПРИМЕЧАНИЕ: при вводе значения больше нуля в кнопке Volume (Объём) происходит выбор режима вычислений температуры, который является стандартным режимом. При вводе значения ноль (0) в кнопке Volume происходит выбор режима блока. Рекомендуется использовать режим вычислений, так как он более точно отображает фактическую температуру образца. Изменение температуры крышки При использовании блока для проведения реакций с 96 ячейками или двойного блока с 48 ячейками рекомендованная температура крышки составляет Ю5°С. При использовании блока с 384 ячейками рекомендованная температура крышки составляет 95°С. Для изменения температуры крышки в меню нового протокола или в меню Protocol Editor: 1 . Нажмите кнопку Lid (Крышка). Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. 18 --- стр. 132 --- Термоциклер серии С1000 Touch™. Руководство по эксплуатации. 3 Выполнение протоколов _________ Прочитайте этот раздел для получения информации о выполнении протоколов. Подготовка к выполнению протокола (стр. 21) Контроль выполнения (стр. 23) Приостановка и возобновление выполнения (стр. 24) Пропуск этапов в протоколе (стр. 25) Отмена выполнения (стр. 25) Инкубирование образцов (стр. 25) Подготовка к выполнению протокола Для запуска протокола используйте один из следующих способов; Выберите протокол из директории Saved Files (Сохранённые файлы), затем нажмите кнопку Run (Выполнить). Отредактируйте протокол в директории , затем нажмите кнопку Run. Создайте новый протокол, затем нажмите кнопку Run. 1 . Если к термоциклеру серии СЮ О О Touch™ подключено несколько блоков, откроется окно выбора блоков. 2. Выберите блоки модуля для проведения реакций, в которых необходимо выполнить протокол путём установки флажка в пункте Next to the desired blocks (Перейти к требуемому блоку). В качестве альтернативы нажмите кнопку Select All (Выбрать всё) для выбора всех имеющихся блоков. В пункте появится флажок, указывая на то, что блок выбран. 3. При выполнении протокола на нескольких блоках определите порядок запуска блоков; по отдельности или одновременно. Поставьте флажок в пункте Confirm all blocks individually (Подтвердить все блоки индивидуально) при запуске блоков в разное время. 4. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. 21 --- стр. 133 --- 6. Термоциклер серии СЮ ОО Touch™. Руководство по эксплуатации. На рисунке 18 выполнение протокола на обоих блоках начнётся одновременно. 5 . Рисунок 18. Несколько блоков выполняют один и тот же протокол одновременно. Подтвердите или измените параметры выполнения перед началом выполнения. СОВЕТ; значение, введённое в поле Sample Volume, определяет режим контроля температуры. Если введено значение образца больше О (ноля), прибор использует режим вычислений для расчёта целевой температуры. Если в поле Sample Volume введено значение О (ноль), используется режим блока, и в этом случае термоциклер предполагает, что температура образца совпадает с температурой блока. На рисунке 19 параметры выполнения включают объём образца 10 мкл и температуру крышки 105“С. (Нажмите кнопку ОК для отключения этих полей и выполнения протокола без ввода дополнительных параметров). Рисунок 19. Параметры выполнения протокола. Для добавления опциональных дополнительных настроек нажмите кнопку Additional Settings (Дополнительные настройки) для ввода имя пользователя, адреса электронной почты (для отправки уведомления по электронной почте о завершении выполнения протокола), идентификатор образца или для настройки скорости изменения для всех этапов протокола (рис. 20). Также выполните протокол в термоциклере серии СЮ О О Touch с той же скоростью изменения, что и скорость изменения термоциклера DNA Engine® путём установки флажка в пункте DNA Engine Ramp. 22 --- стр. 134 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. 7 . 8. Рисунок 20. Включите дополнительные настройки в ваш протокол, включая выполнение протокола в режиме DNA Engine Ramp и отправку уведомления по электронной почте по завершению выполнения протокола. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Начните выполнение протокола нажатием кнопки ОК в окне подтверждения выполнения протокола. Контроль выполнения протокола Во время выполнения протокола кнопки статуса в главном меню (кнопки отображают иконку устройства и оставшееся время) обеспечивают возможность контроля всех блоков. Для просмотра детального статуса выполнения протокола конкретного термоциклера нажмите кнопку Status (Статус) интересующего термоциклера. ПРИМЕЧАНИЕ: если термоцикпер имеет двойной модуль для проведения реакций с 48/48 ячейками, вы можете выбрать отдельные блоки для проведения реакций с маркировкой А и В для просмотра детального статуса выполнения операции каждого блока. Находясь в меню статуса, выберите для просмотра другие блоки для проведения реакций, выбрав их в ниспадающем списке. 9, Для постоянно работающего блока нажмите кнопку View Clock (Отобразить часы) для переключения меню, отображающих статус в графическом виде (рис. 21) и статус по оставшемуся времени (рис. 22). 23 --- стр. 135 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации Нажмите кнопку View Status (Отобразить статус) для возврата в меню статуса. UNSAVED W C Э б Х Нет V b w C t o c f c St«p2 teC0050ie-A 72 " С G 72 " С Lid Pr«h«efine St*p 1 o f 7 Sam ple 25.9 С 3:00 1 0:30: l 0:30 j / 1:00 i 34X 6:00 ► I XР ш м S l4 > S t o p С т Ы Рисунок 21. Меню Status. S tatus UNSAVED SC005016-A 1 : 4 5 : 0 4 Remaining Й Q hHon» V b w 9 t o l u K Рисунок 22. Меню с отображением статуса по оставшемуся времени. Приостановка и возобновление выполнения протокола Выполняемый протокол может быть временно приостановлен в меню статуса протокола. Во время паузы термоциклер продолжает нагревание или охлаждение до целевой температуры, при этом температура крышки поддерживается на одном уровне. СОВЕТ: после аварийного отключения питания термоциклер серии СЮ О О Touch автоматически возобновляет выполнение протокола, но также и отображает предупредительное сообщение. Для приостановки и последую1цего возобновления выполнения протокола: 1 . Нажмите кнопку Pause (Пауза) в меню Status. ВНИМАНИЕ! Приостановка выполнения этапа может отрицательно повлиять на итоговые результаты реакции PCR. Если выполнение протокола приостанавливается на этапе изменения температуры, целевая температура реакции PCR будет поддерживаться в течение более продолжительного времени выдержки, чем это требуется этапом протокола. 24 --- стр. 137 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™, Руководство по эксплуатации Открывается меню Incubate (рис. 23). t In c u b a t e , Рисунок 23. Меню Incubate. ПРИМЕЧАНИЕ; Температура блока по умолчанию, время выдержки и температура крышки будут такими же, как и во время последней выполняемой операции инкубирования. ПРИМЕЧАНИЕ: при выполнении инкубирования при температуре ниже 30°С температура крышки будет находиться на уровне 31 °С для предотвращения излишнего образования конденсата. 2. Введите температуру блока, время выдержки и температуру крышки путём нажатия соответствующих кнопок и ввода значений с помощью всплывающей цифровой клавиатуры. 3. Нажмите кнопку Run для запуска процесса инкубирования. ПРИМЕЧАНИЕ: если подключено несколько блоков, пользователь может выбрать соответствующие блоки для выполнения процесса инкубирования. 4. Для завершения процесса инкубирования и просмотра окончательного меню статуса нажмите кнопку Cancel. 26 --- стр. 138 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™, Руководство по эксплуатации 4 Программа Protocol AutoWriter Прочитайте данный раздел для получения информации об использовании программы Protocol AutoWriter. Создание протокола с помощью программы Protocol AutoWriter (стр. 27) Обзор программы Protocol AutoWriter (стр. 29) Калькулятор Т а (стр. 30) Создание протокола с помощью программы Protocol AutoWriter Выполните следующие действия, чтобы использовать программу Protocol AutoWriter для создания нового протокола: 1 . Нажмите кнопку Protocol AutoWriter в главном меню. 2. Выберите энзим, который будет использоваться для проведения реакции. Выбором по умолчанию для полимеразы является ДНК-полимераза типа iTaq^” . Если используется ДНК-полимераза типа iProof™, нажмите кнопку с зависимой фиксацией iProof для выбора полимеразы типа iProof. ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрана полимераза типа iProof, протокол автоматически прибавляет 3°С к значению Т д . Если нажата кнопка с зависимой фиксацией Other (Другое), появляются дополнительные опции, такие как Hot Start Activation (Включение режима пуска из горячего состояния) (рис. 24). , Protocol AutoW riter ______ __ J . 'S n 7 Estimated Time 0 iT « q , A m p lic o n 1 L o n g t l)1 0 0 b p J ; л п п я л п п д 1 lim p u r A tu r a60 " C 1 о IP ro o f G r a d lo r > tН л п д я ] H u t S u tt1 0 ;0 0 J 6 :0 0 ]• other A c t lv d t lu n U n tilh x lH n id t in Standvd О Fait О Ultrifut Рисунок 24. Если для энзима выбран пункт Other, появляются дополнительные опции. 3. Нажмите кнопку Amplicon Length (Длина ампликона) и введите длину ампликона в парах оснований (и.о.). 27 --- стр. 139 --- ш 4. Нажмите кнопку Annealing Temperature (Температура нагревания) и введите значение Т а в °С. 5. Нажмите кнопку с зависимой фиксацией, соответствующую требуемой скорости реакции. Температура нагревания и общее расчётное время выполнения протокола изменится в случае изменения скорости. Температура нагревания, используемая в программе, будет на 4°С ниже средней температуры Тт праймера для стандартной скорости и на 2°С ниже средней температуры Тт праймера для высокой скорости. Не отрегулированная средняя температура Т щ праймера будет использоваться для сверхвысокой скорости. 6. Нажмите кнопку Next для просмотра нового протокола в меню Edit Protocol (Редактирование протокола). Порядок редактирования протокола смотри в разделе “Создание, редактирование, присвоение имени и сохранение протоколов” на странице 11, 7. Нажмите кнопку Back для возврата в меню Protocol Autowriter. 8. Нажмите кнопку Save для сохранения протокола или кнопку Run для выполнения протокола. Создание протокола при неизвестном значении Та Если значение Т а неизвестно, выполните следующие действия для создания протокола с помощью программы Protocol AutoWriter. 1 . Нажмите кнопку Protocol AutoWriter в главном меню. 2. Нажмите кнопку Т, Calculator (Калькулятор Т а). 3. Нажмите кнопку Forward Primer (Вводимый праймер) и введите последовательность праймера с помощью кнопок А, Т, G, С. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. 4. Нажмите кнопку Reverse Primer (Итоговый праймер) и введите последовательность праймера с помощью кнопок А, Т, G, С. Нажмите кнопку ОК для подтверждения выполняемого действия. Для исправления неверного основного ввода в сплывающем окне ввода последовательности нажмите кнопку BACK (Назад) и удалите ранее добавленное значение. Для удаления всей последовательности праймера во всплывающем окне Т а Calculator (Калькулятор Та) нажмите соответствующую кнопку удаления. Программа Protocol AutoWriter рассчитывает и отображает на дисплее значение Т щ каждого праймера, а также средние значения Тт и Т а (рис. 25). Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации, Рисунок 25. Рассчитывается значение Тт каждого праймера и средние значения Т„ и Т ». 28 --- стр. 140 --- ПРИМЕЧАНИЕ: если значения Т^ праймера больше 4°С, программа Protocol AutoWriter использует меньшее значение Т щ праймера + 2°С в качестве основы для расчета значения Т а, которое впоследствии может быть изменено путём выбора энзима и скорости реакции. ПРИМЕЧАНИЕ: калькулятор Т а рассчитывает температуру нагревания для стандартной скорости с ДНК-полимеразой типа iTaq. При использовании другого энзима настройки скорости автоматически изменяют значение Т а . 5. Нажмите кнопку ОК для возврата в меню Protocol Autowriter. Обзор программы Protocol AutoWriter Программа Protocol AutoWriter использует стандартные инструкции PCR, которые автоматически создают циклические протоколы с начальной денатурацией образца и активацией энзима с последующими циклами денатурации, нагревания, элонгации и этапами конечной элонгации. Протоколы основаны на таких параметрах, вводимых пользователем, как целевая длина ампликона, тип энзима и температура нагревания или последовательности праймера. Л Протоколы, созданные программой Protocol AutoWriter при различных настройках скорости ^ (стандартная, высокая и сверхвысокая), могут привести к получению различных продуктов, так как программа может регулировать температуру нагревания, уменьшать общее число этапов протокола или повторений GOTO, сокращать время выдержки или уменьшать перепады температур между этапами для создания этих протоколов. В программе Protocol AutoWriter используются установленные стандарты PCR, которые содержат таблицы данных для создания конечных предполагаемых протоколов: Это либо стандартный двухэтапный протокол, либо трехэтапный протокол с этапом конечной элонгации. Ниже представлены этапы и диапазон значений, создаваемые программой Protocol AutoWriter: 1 . Этап включения режима пуска из горячего состояния/денатурации - этот этап выполняется при температуре 95-98°С в течение 30 или 180 секунд в зависимости от типа энзима и используемой настройки скорости. 2. Этап денатурации - этот этап выполняется при температуре либо 95, либо 98°С в течение 5-30 секунд в зависимости от типа энзима и используемой настройки скорости. 3. Этап нагревания - на данном этапе программа Protocol AutoWriter использует либо температуру нагревания (Та) праймера на стандартной скорости, которая рассчитывается калькулятором Т а, либо значение, введённое пользователем. • Продолжительность времени нагревания - диапазон от 10 до 30 секунд в зависимости от настройки скорости. Двухэтапный протокол, вкпючающий этапы нагревания и удлинения • Температура нагревания (Та) - эта температура рассчитывается на основе характеристик праймера и выбранной скорости реакции. Если выбран энзим типа iProof, к значению Т а прибавляется 3°С 4. Этап удлинения (только для трехэтапных протоколов) - все этапы удлинения выполняются при температуре 72°С с продолжительностью, основанной на расчёте времени из заданного времени на т.п.н. (например, 60 сек/т.п.н.) самого большого ампликона в ёмкости, часто с некоторыми изменения при меньших размерах ампликона. 5. Число повторов - этапы повторяются 25-40 раз в зависимости от выбранной скорости. 6. Конечный этап удлинения - этот этап выполняется при температуре 72°С в течение 1-5 минут в зависимости от выбранной скорости. Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. 29 --- стр. 141 --- Программа Protocol AutoWriter использует информацию о реакции для автоматической записи протокола. Эта функция позволяет пользователю вводить следующую информацию об эксперименте с PCR: Праймеры - введите значение Т а реакции для используемых праймеров. Если значение Т а неизвестно, введите последовательность праймеров в калькуляторе Т а для того, чтобы программа Protocol AutoWriter рассчитал это значение ПРИМЕЧАНИЕ: Значение Т а получено из информации о температуре плавления праймера (Т щ ), которая основана на выбранном энзиме и выбранной скорости протокола. Длина ампликона - введите предполагаемую длину продукта PCR Тип энзима - введите энзим ДНК-полимеразы (типа ITaq, iProof или иной) Если должен использоваться энзим ДНК-полимеразы, не являющийся энзимом типа iTaq или IProof, введите дополнительную информацию, включая время включения режима пуска из горячего состояния и время конечного удлинения Требуемая скорость проведения реакции - выберите скорость проведения реакции (стандартная, высокая или сверхвысокая). Программа Protocol AutoWriter оптимизирует протокол в зависимости от выбранной настройки скорости. Общее время проведения реакции определяется количеством этапов и циклов, временем инкубирования в каждом этапе и временем, необходимым для достижения однородности при целевой температуре. Для уменьшения общего времени проведения реакции программа Protocol AutoWriter уменьшает одно или несколько следующих значений: Общее число этапов протокола (для праймеров с большими значениями Т щ этапы нагревания и удлинения могут быть объединены в один этап) Число циклов Число выдержки в каждом этапе изменения температуры Время изменения между этапами (путём уменьшения изменения температуры при переходе от одного этапа к другому) Например, программа Protocol AutoWriter может уменьшить протокол путём: Изменения исходной денатурации образца и этапа активации энзима с 95°С в течение времени выдержки 3 минут до 98°С в течение времени выдержки 30 секунд в каждом этапе изменения температуры Изменения этапа денатурации в каждом цикле с 95°С в течение 30 секунд до 92°С в течение 1 секунды Объединения этапов нагревания и удлинения в один этап при 70°С в течение 20 секунд Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. Калькулятор Т а Калькулятор Т а рассчитывает значение Тт для каждого праймера, а также значение Т а для протокола на стандартной скорости. Значение Т а для протокола основано на средних значениях Т^ праймера с учётом следующих положений: • Если разница между значениями Тт праймера > 4°С, значение Т а = (меньше двух значений Тт праймера + 2) - 4°С • Если разница между значениями Тт праймера < или = 4°С, значение Т а = (среднее значение значений Тт праймера) - 4°С Для каждого праймера калькулятор Т а использует метод расчёта пары оснований для последовательностей из 14 или менее пар. • Тт = ((w*A + х*Т) * 2) + ((y*G + z*C) * 4) где W , X , у и Z являются номером оснований А, Т, G и С в последовательности, соответственно. Для последовательностей более 14 п.о. используется метод ближайших соседей: 30 --- стр. 142 --- ф В методе ближайших соседей расчёты температуры плавления основаны на термодинамическом соотношении между энтропией (порядок или единица измерения неупорядоченности олигонуклеотида), энтальпией (тепло, выделяемое или поглощаемое олигонуклеотидом), свободной энергией и температурой, где: ДН = Л0 + Т*ЛЗ, где ДН = величина энтальпии, Кал/моль*К Т = температура, градусы Кельвина. ДН = величина энтропии, Кал/моль*К ДС = свободная энергия Гиббса в Кал/мол ь*К Изменение энтропии и энтальпии напрямую рассчитывается путём сложения значений для пар нуклеотидов, показанных на рисунке 26 (Бреслауер и др. 1986 г.). Соотношение между свободной энергией и концентрацией реактивов и продуктов при равновесии определяется по формуле: ДС = R*T*ln ((ДНК * праймер)/(ДНК + праймер)) где R - газовая постоянная (1.986 кал/моль*К) Замена значения G в двух уравнениях и вычисление значения Т даёт Т = ДН/(Д8 + К*1п((ДНК * праймер)/(ДНК + праймер))) Предполагается, что концентрация ДНК и концентрация комплекса ДНК-праймер равны. Опытным путём было установлено, что происходит обмен свободной энергией 5 ккал (3,4 ккал (Сугимото и др., 1986 г.)) при переходе от однонитиевой ДНК к ДНК В-формы. Предположительно это энергия образования спирали. В конечном счёте, добавление поправки к солям даёт уравнение, которое использует калькулятор Т а : Т = (ДН - 5(ккал/К*моль))/(Д8 + (R * 1п(1/(праймер)))) + 16,6 1одю(молярность соли) Постоянная поправки для концентрации соли не требуется, так как различные параметры были определены при 1 М NaCI, а 1од ю 1 равно нулю. Термодинамические расчёты предполагают, что нагревание происходит при величине pH 7,0. Расчёты значения Тт предполагают, что последовательности не симметричны и содержат как минимум один G или С . Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. 31 --- стр. 143 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации Последовательность олигонуклеотидов должна иметь длину как минимум 14 оснований для предоставления обоснованных значений Т^. При наличии менее 14 оснований используется метод расчета пары оснований (рис. 26). ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Д е л ь та ( Н )Д е л ь т а ( S ) Д е л ь та ( G ) А А Г Г 9 .1 2 4 1 .9 А Т Т А 8 .6 2 3 .9 1.5 А С T G 6 .5 1 7 .3 1.3 A G Т С 7 .8 2 0 .8 1.6 Т А А Т 6 1 6 .9 0 .9 Т Т А А 9 .1 2 4 1 .9 Т С A G 5 .6 13 .5 1 .6 T G А С 5 .8 1 2 .9 1 .9 С А G T 5.8 1 2 .9 1 .9 С Т G A 7 .8 2 0 .8 1 .6 С С G G 11 2 6 .6 3 .1 C G G C 1 1 .9 2 7 .8 3 .6 G A С Т 5 .6 13 .5 1 .6 G T С А 6 .5 1 7 .3 1.3 G C C G 1 1 .1 2 6 .7 3 .1 G G С С 11 2 6 .6 3 .1 Рисунок 26. Константы взаимодействия Бреслауера. 32 --- стр. 155 --- Очищайте внешнюю поверхность крышки модуля для проведения реакций. Используйте влажную ткань или тонкую бумагу для удаления разливов с внешней поверхности корпуса. При необходимости используйте нейтральный мыльный раствор и очищайте поверхность влажной тканью. Чистка крышки предотвращает появление коррозии. Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. Обеспечение достаточного потока воздуха Для термоциклера серии СЮ О О Touch требуется достаточный поток воздуха для нагревания и охлаждения в строгом соответствии с заданной целевой температурой. Если поток воздуха заблокирован, термоциклер не может достичь требуемой температуры в заданное время. В этом разделе содержатся инструкции для проверки потока воздуха и даются рекомендации о поддержании низкого или теплого потока воздуха. Проверка на предмет достаточного потока воздуха Поток воздуха достаточен, если термоциклер быстро нагревается и охлаждается до требуемой целевой температуры. При установке термоциклера серии СЮ О О Touch в новом месте выполните следующие действия для определения наличия достаточного потока воздуха: 1 . Установите устройство в месте его предполагаемого использования, затем включите питание. 2. Создайте типовые условия окружающей среды. Включите расположенное рядом оборудование, например, вентиляторы. Также откройте любые оконные шторы для создания типовых условий во время работы. Если в одном помещении установлено несколько термоциклеров, выполните протокол на всех термоциклерах одновременно. 3. Выполните типовой протокол PCR в течение 30 минут. Для выполнения протокола образцы не требуются; однако должны быть установлена пустая микроплашка или трубки. Крышка не нагревается соответствующим образом, если она касается горячего блока модуля для проведения реакций. 4. Измерьте температуру воздуха в воздухоприбмных отверстиях всех термоциклеров. Если температура воздуха на входе превышает ЗГС, смотри раздел “Решение проблемы недостаточного потока воздуха” для обеспечения достаточного потока воздуха. Решение проблемы недостаточного потока воздуха Если температура воздуха рядом с термоциклером превышает ЗГС, выполните одно или несколько следующих изменений для увеличения потока охлаждающего воздуха вокруг термоциклера. Внесите изменения в условия окружающей среды для снижения температуры окружающего воздуха. Переставьте термоциклер в другое место. Обеспечьте больше места вокруг термоциклера серии СЮ О О Touch и между соседними приборами. Установите приборы таким образом, чтобы теплый воздух, выходящий из одного прибора, не поступал в воздухоприёмные отверстия другого прибора. Отгородите термоциклер от других источников тепла, таких как радиаторы, тепловыделяющие приборы и яркий солнечный свет. 45 --- стр. 156 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации Замена предохранителей Предохранители, установленные в термоциклере серии СЮ О О Touch, предназначены для сгорания в случае резких скачков напряжения или возникновения других причин короткого замыкания. Этот процесс защищает, как пользователя, так и устройства от избыточного электрического разряда. Предохранители, установленные в термоциклере серии С Ю О О Touch, практически не требуют замены. Однако в некоторых учреждениях предпочитают регулярно заменять предохранители для обеспечения бесперебойной работы. Если термоцикпер не вкпючается, сначала следует проверить, что сетевой шнур подключен к работающему источнику питания. Также необходимо проверить, что сетевой шнур и источник питания отвечают техническим характеристикам, указанным для данного устройства. Для замены сетевого шнура обратитесь в службу технической поддержки компании Bio-Rad (для получения подробной информации смотри раздел “Источники информации компании Bio-Rad” на странице ii). В конце проверьте, что предохранители исправны. В термоциклере серии СЮ О О Touch установлено два предохранителя (рис. 33). Для извлечения и проверки предохранителей выполните следующие действия: ВНИМАНИЕ! Для предотвращения удара электрическим током всегда отключайте и выкпючайте прибор из сетевой розетки перед проверкой предохранителей. 1 . Используйте небольшую монету для отворачивания винтов отсека для плавких предохранителей. Отсек для плавких предохранителей Рисунок 33. Отсек для плавких предохранителей на задней панели термоциклера серии СЮ О О Touch. 2. Откройте отсек для плавких предохранителей и извлеките каждый предохранитель. 3. Если предохранитель поврежден, замените его новым предохранителем и закройте отсек. Перегоревший предохранитель имеет разрыв или прогар в металле. Исправный предохранитель имеет целостную металлическую поверхность. 46 --- стр. 157 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации. Приложение А: Список литературы 1 . Бреслауер К.Дж. и др. (1986 г.) Определение устойчивости двухцепочечной ДНК по последовательности оснований, издательство Ргос Nat Acad Sci 83, 3746-3750. 2. Сугимото Н . и др. (1996 г.). Улучшенные термодинамические параметры и фактор образования спирали для определения устойчивости двухцепочной ДНК, издательство Nucleic Acids Res 24, 4501-4505. 47 --- стр. 158 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации А Добавление Звуковой сигнал, 17 Увеличенное время, 16 Перепад температуры, 14 Шаг изменения температуры, 16 Расширенные функции, 39 Поток воздуха проверка, 45 Воздухоприемные отверстия, 1 Вентиляционные отверстия, 1 Вкладываемые папки, 34 В Звуковой сигнал, 13,17 Компания Bio-Rad Laboratories Контактная информация, ii Источники информации, ii Техническая поддержка, II Интернет-сайт, ii Бреслауер, 31, 32, 47 константы взаимодействия, 32 Управляющее ПО термоциклера серии СЮ О О , 42 Термоциклер серии СЮ ОО Поток воздуха, 45 Подключение к термоциклерам серии S1000, 42 Управление термоциклерами серии S1000, 39, 42 Недостаточный поток воздуха, 45 Вход в систему, 40 Выход из системы, 40 Эксплуатация термоциклеров серии S1000, 42 подключение, 4 Параметры протокола, 13 Изменение имени устройства, 7 автоматическая самодиагностика, 4 включение, 4 гарантия, ii Термоциклер серии СЮ ОО Touch, i Прекращение выполнения протокола, 25 Панель управления, 42 охлаждающие пластины, 2 копирование всех файлов из папки, 35 папки, 35 протокола, 36 Создание новой папки, 34 Создание протокола, 1 1 Программа Protocol AutoWriter, 27 значение Та не известно, 28 Удаление папки, 36 протокола, 37 редактирование протокола, 14 Добавление времени удлинения, 16 В этапе GOTO, 17 Удаление звукового сигнала, 17 Удаление значения скорости изменения,16 Удаление значения перепада температуры, 16 Удаление значения времени удлинения, 16 Настройка уведомления по электронной почте в автономном режиме работы, 1 , 7 Сообщения об ошибках, 46 увеличить Время выдержки, 13, 16 Удаление значения времени, 16 Директория файлов Вкладываемые папки, 34 Открытие файлов, 33 Папка PREVIOUS RUNS, 34 Папка протоколов, 33 Папка SYSTEM, 34 Папка USERS, 34 папка Копирование всех файлов, 35 Копирование или перемещение, 35 Создание новой, 34 удаление, 36 переименование, 36 предохранители, 46 Перепад добавление,14 определение,13 диапазон, 13 удаление, 15 49 --- стр. 159 --- B I O - R A D Термоцикле(Р^^^^^(Ш?^<^Ш| Л а б о р а т о р и и f l ----------------------- Время выдержки изменение, 14 ™ Руководство по ЭК§£)ДШЗУм£св, а о м я сшМБ L o fl-к в а р т а л "Д а н и л о в с к а я м а н у ф а к т у р а 1 8 6 7 " Т е л .: 0 0 7 -4 9 5 -7 2 1 1 4 0 4 Ф а к с : 0 0 7 -4 9 5 -7 2 1 1 4 1 2 Уменьшение общего вромоии------------------------ выполнения протокола, 30 Этапы протокола, 29 Калькулятор Та, 30 Значение Та не известно, 28 I приращение добавление, 16 определение, 13 Инкубирование образцов, 25 Завершение инкубирования, 26 Рукоятка крышки, 2 Температура крышки изменение, 18 Роль в выходе PCR, 18 Вход в систему, 40 Выход из системы, 40 м Техническое обслуживание Модули для проведения реакций, 44 Управление папками протоколов, 34 перемещение папки, 35 протокола, 36 Приостановка выполнения, 24 Папка PREVIOUS RUNS, 34 протокол Копирование или перемещение, 36 папка, 33 управление папками, 34 контроль выполнения, 23 Присвоение имени, 19 Приостановка выполнения, 24 переименование, 37 Работа нескольких блоков, 21 Сохранение, 19 Пропуск этапов, 25 Программа Protocol AutoWriter Создание протокола, 27, 28 Краткий обзор, 27 Настройки скорости протокола, 29 R Скорость изменения, 13 изменение, 16 определение, 13 удаление, 16 Блок для проведения реакций Загрузка образцов в, 6 резервуары для проведения химической реакции, 2 Отсек модуля для проведения реакций, 1 модули для проведения реакций чистка, 44 охлаждающие пластины, 2 Крышка, 2 Рукоятка для регулировки усилия крышки, 3 Рукоятка крышки, 2 Загрузка резервуаров с образцами, 6 Загрузка образцов, 6 Техническое обслуживание, 44 Число блоков, 2 Блок для проведения реакций, 2 Рекомендованные объёмы образца, 2 Блок для образцов, 2 Индикатор статуса, 3 Список литературы, 47 удаление Перепад температуры, 14 Шаг изменения температуры, 16 переименование папки, 36 протокола, 37 термоциклера, 7 Замена предохранителей, 46 возобновление выполнения, 25 выполнение отмена, 25 методы, 21 контроль, 23 Несколько блоков, 21 Приостановка, 24 Возобновление протокола, 24 Рабочие журналы, 34 Выполнение протокола, 21 50 --- стр. 160 --- Термоциклер серии СЮОО Touch™. Руководство по эксплуатации Термоциклер серии S1000 Подключение к термоциклеру серии СЮ О О , 42 Работа с термоциклером СЮ ОО, 42 Соблюдение правил техники безопасности, iv Предупреждающие этикетки, iii Изменение объёма образца, 18 Роль в выходе PCR, 17 Сохранение протокола,19 Контрольная проверка, 2 Пропуск этапов протокола, 25 спецификации Для безопасного использования, iv Соблюдение установленных норм, iv Сугимото, 31, 47 Папка SYSTEM, 34 функции, 41 Предупреждающие сообщения, 46 гарантия, ii Интернет-сайт, ii Письменные условные обозначения, используемые в руководстве, ii Калькулятор Та Краткий обзор, 30 Техническая поддержка Контактная информация, ii температура Изменение времени выдержки, 14 Изменение температуры крышки, 18 Изменение параметра, 14 Время выдержки, 13 этап, 13 Режимы контроля температуры Режим блока, 18 Режим вычислений, 18 Контрольный порт, 2, 41 и USB-порт А, 1 , 2, 41 USB-порт В , 2, 41 Папка USERS, 34, 39 W предупреждение Сообщения об ошибках, 46 этикетки, iii Этикетки на устройстве, iv 51 --- стр. 161 --- СПИСОК ПРИНАДЛЕЖНОСТЕЙ с описанием /. Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000, исполнения СЮ О О , S1000 и С1000 Touch в комплекте: 1 . Шасси для термоциклера СЮ ОО/ S1000/01 О О О Touch (Thermal Cycler Chassis СЮ О О , ЗЮ О О, СЮ ОО Touch) - программируемый термостат, необходим для проведения полимеразной цепной реакции - позволяет задавать и выполнять нужное количество циклов с определенными временными и температурными параметрами для каждой процедуры цикла. 2. Сетевой кабель 3. Инструкция II. Принадлежности: 1 . Модуль реакционный быстрый двойной 48/48 (Fast Reaction Module Dual 48/48) - . реакционный блок в виде двух отдельных блоков на 48-лунок (для пробирок по 0.2мл), предназначен для размещения образцов в термоциклере, позволяет одновременно запускать два разных протокола реакции. 2. Модуль реакционный быстрый 96-луночный (96-Well Fast Reaction Module) - реакционный блок в виде планшета на 96-лунок (для 96 пробирок по 0.2мл), предназначен для размещения образцов в термоцикпере. 3. Модуль реакционный 384-луночный (384-Well Reaction Module) - реакционный блок в виде планшета на 384-лунки (для 384-луночного планшета), предназначен для размещения образцов в термоцикпере. 4. Модуль реакционный 96-луночный глубокие ячейки (96-Deep Well Reaction Module) - реакционный блок в виде планшета на 96-лунок (для 96 пробирок по 0.2мл или 48 пробирок по 0,5мл), предназначен для размещения образцов в термоцикпере. 5. Модуль реакционный оптический CFX96 (Optical Reaction Module CFX96) - оптическая система, позволяющая детектировать испускание флуоресценции в образцах (96-луночный формат реакционного блока). 6. Модуль реакционный оптический CFX384 (Optical Reaction Module CFX384) - оптическая система, позволяющая детектировать испускание флуоресценции в образцах (384-луночный формат реакционного блока). 7. Программа CFX менеджер (CFX Manager Software) - программное обеспечение, позволяет получать результаты в удобном для пользователя виде и проводить необходимый анализ. 8. Комплект для проведения плавления с высоким разрешением - программное обеспечение и калибровочный набор, позволяет проводить плавление нуклеиновых кислот с высоким разрешением. 9. Кабель USB (USB Cable) - кабель, который необходим для установки программного обеспечения. Ю.Рамка для пробирок (Tube Frame) - пластиковая рамка, позволяет в зависимости от высоты пробирки плотно закрывать крышку реакционного блока, не повреждая пробирки. III. Стартовый набор: - пробирки стрипованные по 8 шт, 0,2 мл, с крышками -1 упаковка (120 шт.); - плашки ПЦР на 96 лунок, с герметизирующей пленкой - 1 упаковка (25 шт.); - плашки ПЦР на 384 лунки, с герметизирующей пленкой - 1 упаковка (50 шт.); 52 Руководство для термоциклера 1000 --- стр. 162 --- Руководство для термоциклера 1000 - реагенты для тестовой постановки ПЦР - 1 комплект С Е Э Bio-Rad Laboratories, Inc. Life Science Group 1 0 0 2 1 3 7 7 R e v A U S /E G W e b s ite v m w .b io -r a d .c o m U S A 8 0 0 4 2 4 6 7 2 3 A u s tr a lia 6 1 2 9 9 1 4 2 S 0 0 A u s tr ia 0 1 8 7 7 8 9 0 1 B e lg iu m 0 9 3 8 5 5 5 1 1 B r a z il 5 5 3 1 3689 6 6 0 0C a n a d a 9 0 5 3 6 4 3 4 3 5 C h in a 8 6 2 1 6 1 6 9 8 5 0 0 C z e c h R e p u b lic 4 2 0 2 4 1 4 3 0 5 3 2 D e n m a r k 4 4 5 2 1 0 0 0 F in la n d 09 8 0 4 2 2 0 0F r a n c e 0 1 4 7 9 5 69 6 5 G e r m a n y 0 8 9 3 1 8 8 4 0 G r e e c e 3 0 2 1 0 7 7 7 4 3 9 6 H o n g K o n g 8 5 2 2 7 8 9 3 3 0 0 H u n g a r y 3 6 1 4 5 9 6 1 0 0 I n d ia 9 1 1 2 4 4 0 2 9 3 0 0Is r a e l 0 3 9 6 3 6 0 5 0 I ta ly 3 9 0 2 2 1 6 0 9 1 J a p a n 0 3 6 3 6 1 7 0 0 0 K o r e a 82 2 3 4 7 3 4 4 6 0 M a la y s ia 6 0 3 2 1 1 7 5 2 6 0 M e x ic o 5 2 5 5 5 4 8 8 7 6 7 0T h e N e th e r la n d s 0 3 1 8 5 4 0 6 6 6 N e w Z e a la n d 6 4 9 4 1 5 2 2 8 0 N o r w a y 2 3 3 8 4 1 3 0 P o la n d 4 8 2 2 3 3 1 9 9 9 9 P o r tu g a l 3 5 1 2 1 4 7 2 7 7 0 0R u s s ia 7 495 7 2 1 1 4 0 4 S in g a p o r e 6 5 6 4 1 5 3 1 7 0 S o u th A fn c a 2 7 8 6 1 2 4 6 7 2 3 S p a in 3 4 9 1 5 9 0 5 2 0 0 S w e d e n 0 8 5 5 5 1 2 7 0 0S w itz e r la n d 0 6 1 7 1 7 9 5 5 5 T a iw a n 886 2 2578 7 1 8 9 T h a ila n d 6 6 2 6 5 1 8 3 1 1 U n ite d K in g d o m 0 2 0 8 3 2 8 2 0 0 0 V ie tn a m 8 4 8 3 8 1 3 1 1 4 0 1 0 - 1 8 5 4 0 1 1 1 S ig lllO 53