Набор реагентов для выявления ДНК вируса Эпштейна-Барр методом полимеразной цепной реакции (EBV) по ТУ 9398-021-46482062-2009 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2010/06934 от 02.03.2010 · класс риска 2а

Производитель: ООО "НПО ДНК-Технология" (Россия)

Вид изделия: Вирус Эпштейна-Барр нуклеиновая кислота ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 45 контрактов, медианная цена за единицу 11 381 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
Приказом Росздравнадзора Генеральный директор
о т_________ 200__г №_________.<!^?$5 ^ В8 ФЛЗНК-Технология>>
J^ -Ю.Трофимов 
2009 г.
У Т В Е Р Ж Д Е Н А  У Т В Е Р Ж Д А Ю
ИНСТРУКЦИЯ  
по применению набора реагентов для выявления ДНК  
вируса Эпштейна-Барр  
методом полимеразной цепной реакции
(ЕВУ )
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов EBV предназначен для выявления ДНК вируса 
Энштейна-Барр методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в биологическом 
материале человека (лимфоциты периферической крови, слюна, моча, соскоб из 
уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища).
1.2. Набор может быть использован в клинико-диагностических 
лабораториях медицинских учреждений и научно-исследовательской практике.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1 ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
Набор реагентов EBV основан на использовании амплификации ДНК 
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Процесс амплификации


--- стр. 2 ---
w
заключается в повторяющихся циклах: температурной денатурации ДНК, 01жига 
праймеров (затравок) с комплементарными последовательностями и последующей 
достройке нолинуклеотидных цепей ДНК-полимеразой.
В наборе EBV в смесь для амплификации добавлен внутренний контрольный 
образец (ВК), предназначенный для оценки эффективности протекания 
полимеразной цепной реакции.
В наборах в формате «с флуоресцентной детекцией но конечной точке» и  «в 
режиме реального времени» в смесь для амплификации введены ДНК-зонды, 
каждый из которых содержит флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В  
случае образования специфичного продукта ДНК-зонд разрушаемся, что ведет к 
возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными 
приборами.
ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации 
искомого фрагмента генома вируса Эпштейна-Барр и внутреннего контрольного 
образца (ВК), мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соогвегственно, что 
позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации фрагмеггта генома 
вируса Эпштейна-Барр и внутреннего контрольного образца. Для анализа 
продуктов ПЦР можно использовать детектирующие амилификаторы, 
специализированные детекторы флуоресценции (ПЦР-детекторы) или метод 
электрофореза в агарозном геле.
Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено 
применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления 
реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных прослойкой из 
парафина. Смешение слоев и превращение их в амплификапионную смесь


--- стр. 6 ---
• положительный контрольный образец «К+» - 1  пробирка (150 мкл);
В состав смеси для амплификации входят: ПЦР-буфср,
дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, внутренний контрольный 
образец.
В наборах форматов «с флуоресцентной детекцией по конечной точке» 
и «в режиме реального времени» в состав смеси для амплификации входят 
флуоресцентные ДНК-зонды.
ПЦР-буфер включен только в комплекты для набора формата «с 
флуоресцентной детекцией по конечной точке».
Комплект является специфичным для каждого формата («с флуоресцемгной 
детекцией по конечной точке», «в режиме реального времени», «с детекцией 
ме годом электрофореза»).
з) комплект реагентов для детекции ДНК методом электрофореза включае т :
• смесь для электрофореза - 1  пакет (16,9 г);
• агарозный гель - 5 пластин.
Комплект используется в наборе формата «с детекцией методом 
электрофореза»,
2.3 Время проведения анализа - 4 ч.
2.4 Набор рассчитан на проведение 100 определений, включая анализ 
неизвестных образцов, положительных контрольных образцов и отрицательных 
контрольных образцов.


--- стр. 7 ---
w
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНАЛИЗА
В образцах биологического материала человека, содержащих ДНК вируса 
Эпштейна-Барр, ПЦР-детектор (формат «с флуоресцентной детекцией по 
конечной точке») или детектирующий амплификатор (формат «в режиме реального 
времени») должны регистрировать полонсительный результат. При использовании 
метода гель-электрофореза (формат «с детекцией методом электрофореза»), 
должна быть видна полоса оранжево-красного цвета, соответствующая фрагмеггту 
генома вируса Эпштейна-Барр размером 185 п.н. (пар нуклеотидов).
В  образцах биологического материала, не содержащих ДНК вируса 
Эпштейна-Барр, детектирующий амплификатор или ПЦР-детек 1ор должны 
регистрировать отрицательный результат. При использовании метода 
электрофореза полоса оранжево-красного цвета, соответствующая фра 1менту 
генома вируса Эпштейна-Барр размером 185 п.н., отсутствует, а полоса, 
соответствующая внутреннему контрольному образцу размером 560 п.п., должна 
бьп ь отчетливо видна.
3.2 ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ АНАЛИЗА: 600 геном-эквивалентов ДНК 
вируса Эпштейна-Барр на 1  мл образца.
4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
4.1 Меры предосторожности - соблюдение «Правил устройства, техники 
безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и 
личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) саничарно-


--- стр. 8 ---
w
эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» 
(Москва, 1981 г.).
4.2 Потенциальный риск применения набора -  класс 2а (ГОСТ Р 51609-
2000).
4.3 Все компоненты набора в используемых концентрациях являротся 
нетоксичными.
4.4 При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые 
перчатки без талька.
4.5 При работе с набором следует использовать только новые 
наконечники и пробирки.
4.6 Не допускается использование одних и тех же наконечников fipn 
обработке различных образцов биологического материала.
4.7 Выделение ДНК следует проводить в ПЦР-боксах или в ламинарных 
шкафах с выключенным ламинарным потоком. Приготовление реакционной смеси 
следует проводить в ПЦР-боксах.
4.8 При использовании набора формата «с детекцией мегодом 
электрофореза» для предотвращения контаминации, этапы выделения ДНК, 
проведения ПЦР и электрофорез следует проводить в раздельных помещениях или 
тщательно изолированных зонах, снабженных комплектами полуавтоматических 
пипеток, халатами и прочими принадлежностями.
4.9 Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, 
лабораторная посуда, халаты, головные уборы и пр., а также растворы реагентов 
должны быть строго стациопарпыми. Запрещается их перемещение из одного 
помещения в другое.


--- стр. 9 ---
4Л0 Химическая посуда и оборудование, которые используются при работе 
с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться 
отдельно.
4.11 Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 
1.2.731-99. Все поверхности в лаборатории (рабочие столы, штативы, оборудование 
и др.) ежедневно подвергают влажной уборке с примеЕ 1еиием 
дезинфицирующих/моющих средств, регламентированных санитарными 
правилами.
4.12 Поверхности рабочих столов, а также помещений, в которых 
проводится ПЦР, следует обрабатывать бактерицидными облучателями до и после 
проведения работ в течение 1 часа.
4.13 Запрещается снимать крыщку с электрофоретической камеры, если 
она подключена к источнику питания.
4.14 При работе с включенным трансиллюминатором необходимо 
пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской,
5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
0 рга1тзация работы ПЦР-лаборатории, оборудование и материалы должны 
соответствовать Методическим указаниям МУ 1.3.1888-04.
При работе с набором реагентов EBV требуются следующие оборудование и 
материалы:
• амплификатор (для форматов «с детекцией методом электрофореза» и 
«с флуоресцентной детекцией по конечЕЮ Й точке») или детектирующий 
амплификатор (для формата «в режиме реального времени»);


--- стр. 10 ---
w
• центрифуга со скоростью вращения ротора 13000 об/мин; 
термостат твердотельный на 50 °С;
микроцентрифуга/вортекс со скоростью врап^ения 1000-3000 об/мин; 
холодильник бытовой;
пробирки одноразовые пластиковые объемом 1,5 мл; 
пипетки автоматические одноканальные с переменным объёмом 0,5-
10 мкл, 2,0-20 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл;
• одноразовые наконечники с фильтром для автоматических пипеток с 
маркировкой “RNAase-free, DNAase-free” объемом 1-20 мкл; 1-200 мкл; 100-1000 
мкл;
• одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для
автоматических пипеток объёмом 1-20 мкл;
• одноразовые перчатки медицинские;
• физиологический раствор (0,9% NaCl) стерильный.
При работе с набором в формате «с флуоресцентной детекцией по конечной 
точке» для детекции результатов требуется:
• ПЦР -детектор.
При детекции методом электрофореза (формат «с детек[шей методом 
электрофореза») требуются:
• источник постоянного тока;
• камера для электрофореза;
• трансиллюминатор;
• колба мерная вместимостью 1,0 л;
10


--- стр. 11 ---
• дистиллированная вода;
• стальная проволока диаметром 1,0 мм.
6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
6.1 Взятие периферической крови проводится в пластиковые пробирки 
объемом 2,5 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой соли 
этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2 мг/мл. В качестве 
антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия. Для 
перемешивания содержимого пробирку переворачивают 2-3 раза после взятия 
материала.
ВНИМАНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве 
антикоагулянта.
6.2 Слюну (примерно 500 мкл) перенести в стерильную посуду и шкпко 
закрыть крышкой.
6.3 Порцию (примерно 50 мл) утренней мочи следует собрать в стерильную 
посуду и плотно закрыть крышкой.
6.4 Взятие урогенитальных соскобов (из уретры, цервикального канала, 
заднего свода влагалища) проводится стерильным одноразовым зондом в 
пластиковые пробирки объемом 1,5 мл с 300 мкл физиологического расгиора 
стерильного или в пробирки с реагентом «Проба-Рапид». Зопд извлечь, прижимая 
его к стенке пробирки и отжимая избыток жидкости. Плотно закрыть крышку 
пробирки.
Допускается хранение образцов при температуре 2-8 “С не более 24 ч.
11


--- стр. 12 ---
Примечание: перед взятием соскоба из цервикального канала необходимо 
удалить слизь стерильным ватным тампоном.
7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
7.1 ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА К 
ВЫДЕЛЕНИЮ ДНК
7Л.1 Подготовка периферической крови ('выделение лимфоцитов). 
Внимание! Одновременно с вь[делением лимфоцитов из биологического материала 
необходимо провести пробоподготовку отрицательного контрольного образца «К-»,
7.Г1.1 Промаркировать для каждого образца (в том числе для 
отрицательного контрольного образца) по две пробирки пластиковые объемом
1,5 мл («А» и «В») и по одной пробирке с раствором для выделения лимфоцитов 
(фиколл-урографин).
7. Г 1.2 Внести:
- в пробирки, промаркированные «А» - 500 мкл физиологического раствора 
стрерильного,
- в пробирки, промаркированные «В» - 1,0 мл физиологическою раствора 
стерильного.
7.1 Л.3 Добавить в пробирки, промаркированньЕе «А», 500 мкл
предварительно перемешанной пипетированием периферической крови. В  
пробирку «А» для отрицательного контрольного образца, добавить 500 мкл 
физиологического раствора стерильного. Переметать содержимое каждой 
пробирки пипетированием.
12


--- стр. 25 ---
амплификации ДНК. Нормировочные пробирки хранить при 2-8 °С в течение 1  
месяца в темном месте. При проведении детекции пробирки должны иметь 
комнатную температуру (18-25 °С), для чего за 1  ч до проведения детекции их 
необходимо достать из холодильника.
8 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
8.1 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С 
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР-ДЕТЕКТОРА
После прохождения реакции амплификации пробирки поместить в ПЦР- 
детектор, оформить протокол и провести регистрацию результатов в соответствии 
с инструкцией к прибору (пороговые значения для специфического продукта 
составляют 1,75-2,10, для внутреннего контроля -  2,50).
8.2 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С 
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕТЕКТИРУЮЩИХ АМПЛИФИКАТОРОВ ДТ-322, ДТ-%
Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во 
время амплификации. Оформление протокола (тип анализа «Качественный») и
а][ализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору (см. 
«Руководство по эксплуатации» для ДТ-322, ДТ-96). ДНК-зонды, использующиеся 
для детекции продуктов амплификации фрагмента вируса Эпштейна-Барр и 
внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками ЕАМ и  
HEX соответственно.
25


--- стр. 26 ---
8.3 РЕГИСТРАЦИИ! РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕТЕКТИРУЮЩЕГО АМПЛИФИКАТОРА ICYCLER IQ 
(BIO-RAD LABORATORIES)
Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во 
время амплификации. Оформление протокола и анализ результатов проводится в 
соответствии с инструкцией к прибору (см. «Руководство пользователя» для 
iCycler iQ, iQ5). ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов 
амплификации фрагмента вируса Эпштейна-Барр и внутреннего контрольного 
образца, мечены флуоресцентными метками РАМ и HEX соответственно.
8.4 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
8.4.1 Открыть крышки пробирок с продуктами амплификации и проколе 1ь в 
парафине отверстие диаметром примерно 2-3 мм с помоп 1ью стальной проволоки. 
После прокалывания каждой пробирки проволоку промыть в емкоои с 
водопроводной водой.
8.4.2 Для приготовления буфера для электрофореза содержимое пакета со 
смесью для электрофореза перенести в мерную колбу объёмом 1 л, добавить 
приблизительно 700 мл дистиллированной воды, перемешать до полного 
растворения и довести дистиллированной водой до метки.
Примечание. Буферный раствор для электрофореза можно храпигь при 
комнатной температуре (18-25 X ) в течение 1  недели или при температуре 2-8 "С в 
течение 1 мес.
26


--- стр. 27 ---
8.4.3 Заполнить камеру для электрофореза буферным раствором для 
электрофореза и поместить пластину с агарозным гелем в камеру для 
электрофореза.
Примечание. Буферный раствор для электрофореза должен покрывать 
пластину с гелем слоем приблизительно 3-5 мм. При работе с агарозным гелем 
следует обязательно надевать резиновые перчатки!
8.4.4 Осторожно внести 7,0 мкл продуктов амплификации из каждой 
амплификационной пробирки в соответствующую лунку агарозного геля под 
буферный раствор.
8.4.5 Установить крышку камеры для электрофореза и подключить 
источник постоянного тока. Электрофорез проводить при напряжении 20 вольт/см 
в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, устанавливаемое в 
источнике постоянного тока, должно быть приблизительно равно 200 В),
8.4.6 После окончания электрофореза отключить источник постоянного 
тока, снять крышку с камеры.
8.4.7 Вынуть пластину с агарозным гелем из камеры для электрофореза, 
снять гель с пластины, подцепив его с края, и поместить на экран 
трансиллюминатора.
8.4.8 Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить 
трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты. Продукт 
амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм или 310 нм) в 
виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.
27


--- стр. 28 ---
9 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
9.1 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ С ПОМОЩЬЮ ПЦР-ДЕТЕК70РА 
ИЛИ ДЕТЕКТИРУЮЩЕГО АМПЛИФИКАТОРА
9.1 Л Учет и интерпретация результатов реакции осуществляется 
автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с ПЦР- 
детектором или детектирующим амплификатором.
9Л.2 В биологических образцах, содержащих ДНК вируса Эпштейна-Барр 
(специфический продукт):
• программа ПЦР-детектора фиксирует положительный результат. 
Результат амплификации внутреннего контрольного образца в этом случае в учет 
не принимается;
• детектирующий амплификатор регистрирует экспоненциальный рост 
уровня флуоресценции для специфического продукта.
9.1.3 В биологических образцах, не содержащих ДНК вируса Эпштейна-
Барр:
• программа ПЦР-детектора при положительном результате 
амплификации внутреппего контрольного образца фиксирует отрицательный 
результат;
• детектирующий амплификатор регистрирует экспоненциальный рост 
уровня флуоресценции внутреннего контрольного образца и отсутствие 
экспоненциального роста кривой для специфического продукта.
9.1.4 Результат оценивается как недостоверный в случае:
28