Набор реагентов для выявления ДНК вируса герпеса человека 6 типа методом полимеразной цепной реакции (HHV6) по ТУ 9398-022-46482062-2009 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2010/06932 от 01.03.2010 · класс риска 2а

Производитель: ООО "НПО ДНК-Технология" (Россия)

Вид изделия: Герпесвирус человека 6 тип нуклеиновая кислота ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 21 контракт, медианная цена за единицу 10 410 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
Приказом Росздравнадзора Генеральный директор
о т____________200 г № _________ ЗАО «НЩ|у1ГНК-Технология»
[..Ю-Трофимов 
2009 г.
УТВЕРЖДЕНА УТВЕРЖДАЮ
ИНСТРУКЦИИ 
по применению набора реагентов для выявления ДНК  
вируса герпеса человека 6 типа  
методом полимеразной цепной реакции  
( HHV6)
1  НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов HHV6 предназначен для выявления ДНК вируса 
герпеса человека 6 типа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 
биологическом материале человека (лимфоциты периферической крови, лнкворе, 
слюне, моче и др.).
1.2. Набор может быть использован в клинико-диагностических 
лабораториях медицинских учреждений и научно-исследовательской практике.
2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1 ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
Набор реагентов HHV6 основан на использовании амплификации ДНК 
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Процесс ам 1и(ификации


--- стр. 2 ---
заключается в повторяющихся циклах: температурной денатурации ДНК, отжига 
праймеров (затравок) с комплементарными последовательностями и последующей 
достройке Полинуклеотидных цепей ДНК-полимеразой.
В наборе HHV6 в смесь для амплификации добавлен внутренний 
контроль[ 1ый образец (ВК), предназначенный для оценки эффективности 
протекания полимеразной цепной реакции.
В наборах в формате «с флуоресцентной детекцией по конечной точке» и «в 
режиме реального времени» в смесь для амплификации введены ДНК-зондь[, 
каждый из которых содержит флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В  
случае образования специфичного продукта ДНК-зонд разрушаемся, что ведет к 
возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными 
приборами.
ДНК-зоиды, использующиеся для дс[екпии продуктов амплификации 
искомого фрагмента генома вируса герпеса человека 6 типа и вЕ5утреннею 
контрольного образца (ВК), мечены флуоресцентными метками FAM и HEX 
соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты 
амплификации фрагмента генома вируса герпеса человека 6 типа и внутреннею 
контрольного образца. Для анализа продуктов ПЦР можно использовать 
детектирующие амплификаторы, специализированные детекторы флуоресценции 
(ПЦР-детекторы) или метод ^электрофореза в агарозном геле.
Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено 
применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления 
реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных пpocJЮЙкoй из 
парафина. Смешение слоев и превращение их в амплификационную смесь


--- стр. 5 ---
г) комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК вируса герпеса 
человека 6-го типа с флуоресцентной детекцией по конечной точке 
включает:
- смесь для амплификации, запечатанную парафином -  100 пробирок 
(по 20 мкл);
- раствор Тац-иолимеразы -  2 пробирки (по 500 мкл);
- ПЦР-буфер -  1  пробирка (200 мкл);
- минеральное масло -  2 пробирки (по 1,0 мл);
- положительный контрольный образец «К+» -  1  пробирка (150 
мкл);
д) комплект реагентов для ПЦР - амплификации ДНК вируса 
герпеса человека 6 типа в режиме реального времени, включающий:
- смесь для амплификации, запечатанную парафином -  100
пробирок (по 20 мкл)/12 стрипов по 8 пробирок (20 мкл);
- раствор Тад-полимеразы -  2 пробирки (по 500 мкл);
- минеральное масло -  2 пробирки ( 1Ю  1,0 мл);
- положительный контрольный образец «К+» - 1  пробирка (150 мкл);
е) комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК вируса герпеса 
человека 6 типа с детекцией методом электрофореза, включаюгций:
- смесь для амплификации, запечатанную парафином -  100
пробирок (но 20 мкл);
- раствор Taq-полимеразы -  2 пробирки (по 500 мкл);
- минералыюе масло -  2 пробирки (по 1,0 мл);
- положительный контрольный образец «К+» - 1  пробирка (150 мкл);


--- стр. 6 ---
в  состав смеси для амплификации входят: ПЦР-буфер,
дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, внутренний контрольный образец. 
В наборах форматов «с флуоресцентной детекцией по конечной точке» и «в 
режиме реального времени» в состав смеси для амплификации входят 
флуоресцентные ДНК-зонды.
ПЦР-буфер включен только в комплекты для набора формата «с 
флуоресцентной детекцией по конечной точке».
Комплект является специфичным для каждого формата («с 
флуоресцентной детекцией по конечной точке», «в режиме реального времени», < ^ < с  
детекцией методом электрофореза»).
ж) комплект реагентов для детекции ДНК методом ^:>лекгрофореза 
включае!:
• смесь для электрофореза - 1  пакет (16,9 г);
• агарозный гель - 5 пластшЕ.
Комплект используется в наборе формата «с детекцией методом 
электрофореза».
Время проведения анализа - 4 ч.
Набор рассчитан на проведение 100 определений, включая анализ 
неизвестных образцов, положительных контрольных образцов и  
отрицательных контрольных образцов.
3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНАЛИЗА
В образцах биологического материала человека, содержащих ДНК вируса 
герпеса человека 6 типа, ПЦР-детектор (формат «с флуоресцентной детекцией но


--- стр. 7 ---
конечной точке») или детектирующий амплификатор (формат «в режиме реального 
времени») должны регистрировать положительный результат. При использовании 
метола гель-электрофореза (формат «с детекцией методом электрофореза»), 
должна б ы т ь видна полоса оранжево-красного цвета, соответствующая фрагменту 
генома вируса герпеса человека 6 типа размером 277 п.н. (пар нуклео 1 Идов).
В образцах биологического материала, не содержащих ДНК вируса герпеса 
человека 6 типа, детектирующий амплификатор или ПЦР-детектор должны 
регистрировать отрицательный результат. При использовании метода 
электрофореза полоса оранжево-красного цвета, соответствующая фрагменту 
генома вируса герпеса человека 6 типа размером 277 пл 1., отсутсгвует, а полоса, 
соответствующая внутреннему контрольному образцу размером 560 п.н., должна 
быть отчетливо видна.
3.2 ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ АНАЛИЗА: 1000 геном-эквивалеЕПОв ДНК 
вируса 1'ерпеса человека 6 типа на 1  мл образца.
4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
4Л Меры предосторожности - соблюдение «Правил устройства, техники 
безопас1Юсти, производственной санитарии, противоэпидемического режима и 
личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно- 
эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» 
(Москва, 1981 г.).
4.2 Потенциальный риск нрименения набора -  класс 2а (ГОСТ Р 51609-
2000 ),


--- стр. 9 ---
4.11 Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП
1.2.731-99. Все поверхности в лаборатории (рабочие столы, штативы, оборудование 
и др.) ежедневно подвергают влажной уборке с нримепеннем 
де:^ инфицирующих/моющих средств, регламентированных санитарными 
правилами.
4.12 Поверхности рабочих столов, а также помещений, в которых 
проводтся ПЦР, следует обрабатывать бактерицидными облучателями до и после 
проведения работ в течение 1  часа.
4.13 Запрещается снимать крышку с электрофоретической камеры, если 
она подключена к источнику питания.
4.14 При работе с включенным трансиллюминатором необходимо 
пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской.
5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
Организация работы ПЦР-лаборатории, оборудование и материалы должны 
соответствовать Методическим указаниям МУ 1.3.1888-04.
При работе с набором реагентов HHV6 требуются следующие оборудование 
и материалы:
• амплификатор (для форматов «с детекцией методом электрофореза» и 
«с флуоресцент 1юй детекцией по конечной точке») или детектирующий 
амплификатор (для формата «в режиме реального времени»);
• центрифу]'а со скоростью вращения ротора 13000 об/мин;
• термостат твердотельный на 50 " " С ]
• микроцентрифу[ аУвортекс со скоростью враи^ения 1000-3000 об/мин;


--- стр. 10 ---
w
• холодильник бытовой;
• пробирки одноразовые пластиковые объемом 1,5 мл;
• пипетки автоматические одноканальные с переменным объёмом 0,5-
10 мкл, 2,0-20 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл;
• одноразовые наконечники с фильтром для автоматических пипеток с 
маркировкой “RNAase-free, DNAase-free” объемом 1-20 мкл; 1-200 мкл; 100-1000 
мкл;
• одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для
авюмагических пипеток объёмом 1-20 мкл;
• одноразовые перчатки медицинские;
• физиологический раствор (0,9% NaCl) стерильный.
При работе с набором в формате «с флуоресцентной детекцией по конечной 
точке» для детекции результатов требуется:
• ПЦР-детектор.
При детекции методом электрофореза (формат «с детекцией меюдом 
электрофореза») требуются:
источник постоянного тока; 
камера для электрофореза; 
трансиллюминатор; 
колба мерная вместимостью 1,0 л; 
дистиллированная вода; 
стальная проволока диаметром 1,0 мм.
10


--- стр. 11 ---
6.1 Взятие периферической крови проводится в пластиковые пробирки  
объемом 2,5 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью  
этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2 мг/мл. В качестве  
антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия. Для  
перемешивания содерж имого пробирку переворачивают 2-3 раза после взятия  
материала.
ВНИМ АНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве  
антикоагулянта,
6.2 Слюну (примерно 500 мкл) перенести в стерильную посуду и плотно  
закрыть крышкой.
6.3 Порцию (примерно 50 мл) утренней мочи следует собрать в счерильную  
посуду и плотно закрыть крышкой.
6.4 Ликвор (0,5-1,0 мл ) перенести в стерильную посуду и плотно закрыть  
крышкой.
Допускается хранение образцов при температуре 2-8 °С не более 24 ч.
Примечание: перед взятием соскоба из цервикального канала необходимо  
удалить слизь стерильным ватным тампоном.
6  А Н А Л И З И Р У Е М Ы Е  О Б Р А З Ц Ы
1 1


--- стр. 22 ---
Продукты амплификации можно хранить при температуре 2-8 °С в течение
5 суток.
Примечание: При работе с наборами в формате «с флуоресцентной  
детекцией по конечной точке» готовые нормировочные пробирки («ФОН»)  
допускается использовать многократно при каждой детекции результатов ПЦР с  
реакционными пробирками из той же серии комплекта реагентов для ПЦР-  
амплификации Д Н К . Нормировочные пробирки хранить при 2-8 °С в течение 1  
месяца в темном месте. При проведении детекции пробирки должны имечъ  
комнатную температуру (18-25 °С), для чего за 1  ч до проведения детекции их  
необходим о достать из холодильника.
8 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
8.1 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМ ПЛИФ ИКАЦИИ С  
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ  ПЦР-ДЕТЕКТОРА
После прохождения реакции амплификации пробирки поместить в ПЦР-  
детектор, оформить протокол и провести регистрацию результатов в соответствии  
с и][струкцией к прибору (пороговые значения для специфического продукта  
составляют 1,75-2,10, для внутретш го контроля -  2,50).
8.2 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМ ПЛИФИКАЦИИ С  
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ  ДЕТЕКТИРУЮ Щ ИХ АМ ПЛИФ ИКАТОРОВ ДТ-322, ДТ-%
Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во  
время амплификации. Оформление npoTOKOJia (тип анализа «Качественный») и  
анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору (см.
22


--- стр. 23 ---
«Руководство по эксплуатации» для ДТ-322, Д Т-96). ДН К-зонды , использующиеся  
для детекции продуктов амплификации фрагмента вируса герпеса человека 6 гипа  
и внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками FAM и  
HEX соответственно.
8.3 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМ ПЛИФ ИКАЦИИ С  
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ  ДЕТЕКТИРУЮ Щ ЕГО АМ ПЛИФ ИКАТОРА ICYCLER IQ,  
IQ5 (BIO -RAD LABORATORIES)
Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во  
время амплификации. Оформление протокола и анализ результатов проводился в  
соответствии с инструкцией к  прибору (см. «Руководство пользователя» для  
iCycler iQ, iQ5). ДИК-зонды, использую 1циеся ajem  детекции продуктов  
амплификации фрагмента вируса герпеса человека 6 типа и внутреннего  
контрольного образца, мечены ф л уор ссн етн ы м и  метками РАМ и  HEX  
соотвегс 1венно.
8.4 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМ ПЛИФИКАЦИИ С  
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ  ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
8.4Л Открыть крышки пробирок с продуктами амплификации и проколоть в  
парафине отверстие диаметром примерно 2-3 мм с помощ ью стальной проволоки.  
После прокалывания каждой пробирки проволоку промыть в емкости с  
водопроводной водой.
8.4.2 Для приготовления буфера для электрофореза содерж им ое пакета со  
смесью для электрофореза перенести в мерную колбу объёмом 1 л, добавить
23


--- стр. 24 ---
приблизительно 700 мл дистиллированной воды, перемешать до полпого  
растворения и довести дистиллированной водой до метки.
Примечание. Буферный раствор для электрофореза можно хранить при  
комнатной температуре (18-25 °С) в течение 1  недели или при температуре 2-8 X" в  
течение 1 мес.
8.4.3 Заполнить камеру для электрофореза буферным раствором для  
электрофореза и поместить пластину с агарозным гелем в камеру для  
электрофореза.
Примечание. Буферный раствор для электрофореза должен покрывать  
пластину с гелем слоем приблизительно 3-5 мм. При работе с агарозным 1елем  
следует обязательно надевать резиновые перчатки!
8.4.4 О сторожно внести 7,0 мкл продуктов амплификации из каждой  
амплификационной пробирки в соответствуюпгую лунку агарозною  геля под  
буферный раствор.
8.4.5 Установить крышку камеры для электрофореза и подключить  
источник постоянного тока. Электрофорез проводить при напряжении 20 вольт/см  
в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, устанавливаемое в  
источнике постоянного тока, должно быть приблизительно равно 200 В).
8.4.6 После окончания электрофореза отключить источник ностояенюго 
тока, снять крышку с камеры.
8.4.7 Вынуть пластину с агарозным гелем из камеры для электрофореза,  
снять гель с пластины, подц ош в его с края, и поместить на экраЕ!  
трансиллюминатора.
24


--- стр. 25 ---
lir
8.4.8 Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить  
трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты. Продукт  
амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм или 310 нм) в  
виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.
9 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
9.1 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ С ПОМОЩ ЬЮ  ПЦР-ДЕТЕКТОРА  
ИЛИ ДЕТЕКТИРУЮ Щ ЕГО АМ ПЛИФИКАТОРА
7.2.2.1 Учет и интерпретация результатов реакции осу[цествляется  
автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с ПЦР-  
детектором или детектирующим амплификатором.
7.2.2.1 В биологических образцах, содержащ их ДНК вируса герпеса  
человека 6 типа {специфический продукт):
• программа ПЦР-детектора фиксирует положительный результат.  
Результат амплификации внутреннего контрольного образца в этом случае в учет  
не принимается;
• детектирующ ий амилификатор регистрирует экспоненциальный рост  
уровня флуоресценции для специфического продукта.
7.2.2.1 В биологических образцах, не содержащ их ДНК вируса герпеса  
человека 6 типа:
• программа ПЦР-детектора при положительном резулы аге  
амплификации внутреннего ко]ггрольного образца фиксирует отрицательный  
результат;
25


--- стр. 26 ---
• детектирующ ий амплификатор регистрирует экспоненциальный рост  
уровня флуоресценции внутреннего контрольного образца и отсутствие  
'зкспоненциального роста кривой для специфического продукта.
7.2.2.1 Результат оценивается как недостоверный в случае:
• отрицательного результата на наличие ДНК вируса герпеса человека 6 
типа и отрицательного результата амплификации внутреннего контрольного  
образца (ПЦР-детектор);
• отсутствия экспоненциального роста уровня флуоресценции для  
специфического продукта и для внутреннего контрольного образца  
(детектирующий амплификатор).
Недостоверный резульгаг может быть вызван присутствием ингибиторов в  
препарате ДНК, полученном из клинического материала; неверным выполнением  
протокола анализа; иесоблюдегщем температурного режима амплификации и др. В  
этом случае требуется либо повторная постановка амплификации препарата ДНК,  
либо 1Ювторное выделение препарата ДНК, либо повторное взятие клиническою  
материала.
7.2.2.1 Программа ПЦР-детектора фиксирует сомнительный результат  
в  случае, если значение для специфического продукга попадает в зону  
неопределенности результатов (результат амплификации внутреннею  
кош рольного образца в учет не принимается). В этом случае необходимо  
повторить исследование данного образца (см .п .9.1.4).
7.2.2.1 При получении положительного результата (ПЦР-детектор) или  
экС1ЮненциальЕЮ1'о роста флуоресценции (детектирующ ий амплификатор) для  
специфического продукта в отрицательном контрольном образце «К-» результать[
26