Набор реагентов для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом полимеразной цепной реакции в реальном времени «Амплитуб-РВ» по ТУ 9398-001-46395995-2008 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2010/07635 от 06.05.2010 · класс риска 2а

Производитель: ООО "Синтол" (Россия)

Вид изделия: Mycobacterium tuberculosis нуклеиновая кислота ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 153 контракта, медианная цена за единицу 26 084 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 3 ---
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «АмплиТуб-РВ» предназначен для выделения, 
обнаружения и количественного определения ДЬЖ микобактерий 
туберкулезного комплекса в культуре микобактерий и клиническом материале 
методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). 
Описание используемого метода ПЦР-РВ и реакций, используемых в данном 
наборе, см. приложение 1 .
1.2. Область применения набора - клиническая медицина (лабораторная 
диагностика). Набор реагентов «АмплиТуб-РВ» может быть использован в 
клинической диагностике, а также для оценки эффективности терапии.
2. СОСТАВ
Набор состоит из комплекта реагентов для выделения ДЬЖ (комплект № 
1) и комплекта реагентов для проведения количественного ПЦР-РВ анализа 
(комплект № 2).
С
2.1. Комплект для выделения ДНК (комплект № 1)
Комплект рассчитан на 50 определений.
№ Состав комплекта Описание Объем Кол-во
1. Внутренний положительный  
контроль ВП К-В Туб
прозрачная бесцветная  
жидкость
0,5 мл 2 пробирки
2. Лизирующ ий раствор 1, G1 Туб прозрачная бесцветная  
жидкость
30 мл 1  флакон
3. Сорбирующий раствор, С Р-ФС 
Туб
суспензия с осадком  
темно-коричневого цвета
0,06 мл 50 пробирок
4 Осаждающий раствор. О ? Туб прозрачная бесцветная  
жидкость
30 мл 1  флакон
5 Лизирующ ий раствор 3, G3 Туб прозрачная бесцветная  
жидкость
30 мл 1  флакон
6. Промывочный раствор А , ПР-А прозрачная бесцветная  
жидкость
30 мл 1  флакон
7. Промывочный раствор В , ПР-В прозрачная бесцветная  
жидкость
30 мл 1  флакон
8. Промывочный раствор С, ПР-С прозрачная бесцветная  
жидкость
30 мл 1  флакон


--- стр. 4 ---
2.2. Комплект для проведения количественного ПЦР-РВ анализа (ком­
плект № 2)
Комплект рассчитан на проведение 100 реакций.
№ Состав комплекта Описание Объем Кол-во
1. Реакционная смесь,
PC  О М  АмплиТуб-РВ
прозрачная бесцветная  
жидкость
0,025 мл 100
пробирок
2 . Положительный контрольный  
образец, ПКО-Туб ________________
прозрачная бесцветная  
жидкость
0,2 мл 1  пробирка
3. Калибровочный образец, КОЗ-Туб прозрачная бесцветная  
жидкость
0,2 мл 1  пробирка
Калибровочный образец, К05-Туб прозрачная бесцветная  
жидкость
0,2 мл 1  пробирка
Калибровочный образец, К07-Туб прозрачная бесцветная  
жидкость
0,2 мл 1  пробирка
6. Отрицательный  
образец, О КО
контрольный прозрачная бесцветная  
жидкость
0,2 мл 1  пробирка
С
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.
3.1 Специфичность анализа - 100%. Набор реагентов выявляет только 
Д Ж  Mycobacterium tuberculosis complex (М БТ ). В  образцах, содержащих ДНК 
М. tuberculosis complex, определяется количество клеток М БТ в образце. В  
образцах, не содержащих ДЬЖ М  tuberculosis complex^ результат исследования 
должен быть отрицательным.
3.2. Чувствительность —  не более 5x10 клеток/мл.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
4.1. Потенциальный риск применения набора - класс 2а. Исследования 
материала на наличие микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР- 
Р В  проводят в учреждениях, имеющих разрешение на работу с возбудителями 
III- IV  группы патогенности.
4.2. Меры предосторожности - соблюдение «Правил устройства, техники 
безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и 
личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно­


--- стр. 5 ---
с
личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно- 
эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения 
СССР» (Москва, 1981 г.)
4.3. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются 
нетоксичными.
4.4. Анализ с помощью набора должен производиться в ПЦР- 
лаборатории, организованной согласно Методическим указаниям (М У  1.3.1888- 
04) «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, 
инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV  групп 
патогенности».
4.5. Работу с набором реагентов и анализируемыми образцами следует 
проводить в одноразовых медицинских перчатках без талька. При каждой опе­
рации использовать и менять одноразовые наконечники для автоматических 
пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду необхо­
димо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 
раствор (например, 0,2% ДП-2Т).
4.6. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, ла­
бораторная посуда, халаты и пр., а также рабочие растворы реагентов должны 
быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения 
в другое.
4.7. Поверхности рабочих столов, а также помещения, в которых прово­
дится постановка ПЦР-РВ, до начала и после завершения работ необходимо об­
рабатывать бактерицидными облучателями.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. Для выделения ДНК из культуры и клинического материала  
требуется:
—  настольный бокс с бактерицидной лампой или стерильный ламинарный
шкаф;
—  твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25-100 °С ;


--- стр. 8 ---
гомогенизируют при перемешивании с помощью шейкера (ротамикс) в зави­
симости от консистенции образца в течение 5-20 мин. Затем гомогенизирован­
ные образцы центрифугируют при 3000 об/мин (2800 - 3000 g) в течение 15 
мин. Супернатант сливают в дезинфицируюгций раствор. Полученный осадок 
ресуспендируют и переносят в микропробирки объемом 1,5 мл. Центрифуги­
руют 5-10 мин. при 12 О О О  об/мин. Супернатант удаляют. Полученный осадок 
используют в качестве образца для выделения ДЬЖ.
Биоптат
Биоптат гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых сту­
пок и пестиков, затем готовят 50% суспензию на стерильном 0,9% растворе на­
трия хлорида или фосфатном буфере (P B S , Sigma, С Ш А ). Переносят 200 мкл в 
микропробирку на 1,5 мл. Полученную аликвоту используют в качестве образ­
ца для выделения ДНК.
Промывные воды бронхов, спинномозговая жидкость, экссудат,  
пунктат, моча, отделяемое половых путей.
€* промывные воды бронхов, спинномозговую жидкость, экссудат, пунктат,
или отделяемое половых путей переносят в микропробирки объемом 1,5 мл. 
Центрифугируют 5 мин. при 12 О О О  об/мин. Супернатант удаляют. Мочу цен­
трифугируют, используя метод накопления осадка. Полученный осадок исполь­
зуют в качестве образца для выделения ДНК.
Культура клеток


--- стр. 9 ---
Исследуемую суспензию клеток переносят в микропробирки объемом 1,5 
мл. Центрифугируют 5 мин. при 12 О О О  об/мин. Супернатант удаляют. Полу­
ченный осадок используют в качестве образца для выделения ДНК.
7,1.2. Протокол выделения ДНК из образцов комплектом №1.
В  каждую партию выделения наряду с исследуемым материалом необхо­
димо включать отрицательный контроль выделения (ОКО-В), который потом 
обязательно анализируется в ПЦР-РВ. Это позволит контролировать возмож­
ную контаминацию на этапе выделения ДНК.
1. В  пробирки с исследуемым материалом и ОКО-В вносят 500 мкл 
лизирующего раствора 1, G1 Туб (в качестве отрицательного контроля 
можно использовать 200 мкл воды или Т Е буфера).
2. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на микроцентрифуге- 
вортексе и инкубируют при 65 °С  в течение 10 мин.
3. Отбирают необходимое количество пробирок с сорбирующим раствором, 
СР-ФС Туб, и маркируют их.
4. Перемешивают содержимое пробирки с ВПК-В Туб на микроцентрифуге- 
вортексе и центрифугируют 15 с при 4000 об/мин.
5. Переносят 500 мкл лизированной смеси в пробирки с сорбирующим
€* раствором, СР-ФС Туб, в соответствии с маркировкой. Вносят в каждую
пробирку 20 мкл раствора ВПК-В Туб, затем 500 мкл осаждающего 
раствора, ОР Туб.
6. Тщательно перемешивают содержимое пробирок до равномерного 
распределения сорбента, выдерживают 5 мин. при комнатной температуре, 
переодически перемешивая на микроцентрифуге-вортексе. Центрифугируют 
в течение 5 мин. при 13000 об/мин.
7. Помещают пробирки в магнитный штатив на 1  мин. и удаляют 
надосадочную жидкость.
8


--- стр. 10 ---
с
ф
8. Вносят в пробирки с осадком по 500 мкл лизирующего раствора 3, G3 Туб,
перемешивают содержимое пробирок на микроцентрифуге-вортексе до
равномерного распределения сорбента и центрифугируют пробирки в 
течение 1  мин. при 7000 об/мин. Устанавливают пробирки в магнитный 
штатив на 1 мин, и удаляют надосадочную жидкость.
9. Вносят в пробирки 500 мкл промывочного раствора А, ПР-А, перемешивают 
содержимое пробирки на микроцентрифуге-вортексе до равномерного 
распределения сорбента, центрифугируют пробирки в течение 1 мин. при 
7000 об/мин. Устанавливают пробирки в магнитный штатив на 1  мин. и 
удаляют надосадочную жидкость.
10. Вносят в пробирки 500 мкл промывочного раствора В, ПР-В ,
перемешивают содержимое пробирок на микроцентрифуге-вортексе до
равномерного распределения сорбента, центрифугируют пробирки в течение 
1  мин. при 7000 об/мин. Устанавливают пробирки в магнитный штатив на 1  
мин. и удаляют надосадочную жидкость.
11. Вносят в пробирки 500 мкл промывочного раствора С, ПР-С,
перемешивают содержимое пробирок на микроцентрифуге-вортексе до
равномерного распределения сорбента, центрифугируют пробирки в течение 
1  мин. при 7000 об/мин. Устанавливают пробирки в магнитный штатив на 1  
мин. и удаляют надосадочную жидкость.
12. Выдерживают пробирки с открытыми крышками в течение 5 мин. при 
температуре 65 для удаления остатков промывочного раствора С, ПР-С.
13. Добавляют в пробирки по 100 мкл элюирующего раствора, ЭР,
перемешивают содержимое пробирок на микроцентрифуге-вортексе до
равномерного распределения сорбента.
14. Выдерживают пробирки в течение 10 мин. при температуре 65 °С, 
периодически перемешивая на микроцентрифуге-вортексе. Центрифугируют 
пробирки в течение 1  мин. при 13000 об/мин и устанавливают в магнитный 
штатив на 1 мин.


--- стр. 11 ---
с
15. Переносят из пробирок водную фазу, содержащую ДНК, в чистые, 
предварительно промаркированные, 1,5 мл пробирки.
Водная фаза содержит ДНК. Раствор Д НК до проведения анализа в тече­
ние суток рекомендуется хранить при температуре 4°С, при более длительных 
сроках - при минус 20°С.
7.2. Постановка ПЦР-РВ комплектом № 2.
В  каждую постановку обязательно включают положительный (ПКО- 
Туб), отрицательный (ОКО) контрольные образцы и отрицательный контроль­
ный образец выделения (ОКО-В). Для проведения количественного анализа 
дополнительно используют калибровочные контрольные образцы КОЗ-Туб, 
К05-Туб, К07-Туб.
Все контроли (исключая ПКО-Туб и ОКО, которые анализируют в одном 
повторе) и исследуемые образцы анализируют в двух повторах.
Для проведения количественного анализа при использовании набора реа­
гентов «АмплиТуб-РВ» возможны 2 варианта работы:
L  В а р и а н т ра б о ты  «Калибровка»
Применяется при первом использовании прибора или набора реагентов 
новой серии.
Исследование проводится с включением трех КО  (К 0 7 , К05, КО З) в по- 
®  вторе с количеством фрагментов IS6110 и regX 10^, 10^ 10^ копий на 10 мкл.
Количество М БТ в образцах определяется по полученной калибровочной пря­
мой.
2. В а р и а н т р а б о ты  «Тест»
Применяется, когда уже есть построенная калибровочная прямая для на­
бора реагентов текущей серии.
Исследование проводится с включением только КО  (К О З) с количеством 
10^ копий на 10 мкл. В  этом случае для определения количества М БТ исполь­
зуются результаты (уравнение калибровочной прямой) первой постановки, а
10


--- стр. 12 ---
результат по КО З служит критерием достоверности количественного определе­
ния неизвестных образцов.
7.2.1. Подготовка к проведению реакции П Ц Р-РВ.
1. Взять необходимое количество пробирок с реакционной смесью комплекта
для амплификации (P C  О М  Ам плиТуб-РВ) из расчета где N -
количество исследуемых образцов, а К  - количество контрольных образцов 
в данной постановке. Не допускать размораживания и повторного 
замораживания неиспользованных пробирок со смесью.
2. После размораживания реакционной смеси, центрифугировать пробирки 30- 
60 с (скорость вращения ротора более 4000 об/мин. или 2500g). Для этого 
воспользоваться либо ротором для пробирок 0,2 мл, либо адаптерами к 
стандартному ротору для пробирок 2,0 мл.
3. Поместить пробирки с реакционной смесью в штатив. Маркировать 
пробирки в соответствии с протоколом анализа в верхней части стенки 
пробирки.
Примечание. Запрещается наносить маркировку на крышку пробирок.
4. Положительный, калибровочные, отрицательные контрольные образцы 
ПЦР и исследуемые образцы разморозить, перемешать на встряхивателе 
(вортексе) и центрифугировать.
Примечание. Если образец ДЬЖ  содержит незначительное количество магнит­
ного сорбента, рекомендуется поставить пробирки на 1 мин. в магнитный шта­
тив.
5. Внести в пробирки по 10 мкл отрицательных контрольных образцов (О КО  и 
ОКО-В), исследуемых образцов и, в последнюю очередь, положительных 
контрольных образцов ДЬЖ  М БТ в соответствии с маркировкой, используя 
наконечники с аэрозольным барьером, перемешать на встряхивателе и 
центрифугировать.
6. Поместить пробирки в прибор в соответствии с протоколом анализа.
Для корректной работы шаблона для автоматической обработки результатов 
необходимо использовать следующий порядок образцов.
11


--- стр. 13 ---
В а р и а н т р а б о ты  «Калибровка»:
Л о  я ч е й к и О б р а з е ц
1 КО 7
2 КО 7
3 КО 5
4 КО 5
5 КОЗ
6 КОЗ
7 ПКО
8 ОКО
9 ОКО-В
10 ОКО-В
11 исследуемый образец 1
12 исследуемый образец 1
13 и с с л е д у е м ы й  о б р а з е ц  2
14 и с с л е д у е м ы й  о б р а з е ц  2
15 исследуемый образец 3
16 исследуемый образец 3
В а р и а н т р а б о ты  «Т ест»:
С
№  я ч е й к и О б р а з е ц
1 КОЗ
2 к о з
3 ПКО
4 о к о
5 ОКО-В
6 ОКО-В
7 исследуемый образец 1
8 исследуемый образец 1
9 и с с л е д у е м ы й  о б р а з е ц  2
10 и с с л е д у е м ы й  о б р а з е ц  2
И исследуемый образец 3
12 исследуемый образец 3
7.2. 2. Проведение реакции П Ц Р-РВ
Реакцию ПЦР-РВ проводят согласно инструкции по эксплуатации 
прибора для ПЦР-РВ. Порядок работы на приборе АНК-32 (или 16) (Россия) 
изложен в приложении 2. Порядок работы на приборе Rotor Gene 6000 
изложен в приложении 3. Порядок работы на приборе iCycler iQ5 Bio-Rad 
(США) изложен в приложении 4.
12


--- стр. 14 ---
1. Устанавливают параметры температурно-временного режима 
амплификации согласно таблице 1  и вводят красители (F A M , R O X  и 
R 6G ).
Таблица 1  - Температурно-временной режим амплификации
№  п/п Температурно-временной режим Число циклов
1 95 °С - 1 2 0 с 1
2 61 ^ С -5 0 с 453 95 °С -  15 с
2. Вводят сведения об образцах по соответствующему красителю. Начинают 
работу прибора и фиксируют в рабочем журнале название файла.
3. В  соответствии с инструкцией к прибору активируют окно приема сигна­
ла флуоресценции по первому (F A M ) и третьему (R O X ) измерительным 
каналам (наличие положительной динамики в какой либо лунке свиде­
тельствует о наличии в реакционной смеси специфических фрагментов 
Д НК возбудителя и позволяет дать предварительное положительное за­
ключение о наличии Д Н К микроорганизма в соответствующем образце).
4. Отработанные пробирки утилизируют в соответствии с рекомендациями 
по организации ПЦР лаборатории.
7.2.3. Обработка результатов работы прибора
После завершения программы проводят расчет и сохранение значений 
порогового цикла для канала 1  (F A M  -  для выявления фрагментов ДЬЖ гена 
1S6770 М БТ), 3 (ROX -  для выявления фрагментов Д Н К гена regX3 М БТ) и 2 
(R6G -  для выявления ВПК-В Туб) согласно инструкции к прибору. По рассчи­
танным значениям пороговых циклов для калибровочных образцов КОЗ-Туб, 
К05-Туб, К07-Туб проводят построение калибровочной прямой и количест­
венный анализ исследуемых образцов. Обработка результатов работы прибо­
ров (АНК-32, Rotor Gene 6000, iCycler iQ5 Bio-Rad), используемых для проведе­
ния анализа, приведена в соответствующих приложениях 2, 3, 4.
13


--- стр. 15 ---
8. У Ч Е Т  Р Е З У Л Ь Т А Т О В  А Н А Л И ЗА
Результаты анализа не подлежат учету:
—  в случае регистрации прибором О К О  по каналам Г А М  и R O X ;
—  в случае отсутствия регистрации прибором О К О  и О КО -В по каналу 
R 6G  -  В П К - В  Туб;
—  в случае отсутствия регистрации прибором КОЗ-Туб, К05-Туб, К07-Туб 
и ПКО -Туб по каналам Г А М  и R O X .
Результаты анализа подлежат учету:
—  в случае отсутствия регистрации прибором О К О  по каналам ГА М  и 
R O X ;
—  в случае регистрации прибором О К О  и О КО -В по каналу R6G;
—  в случае регистрации прибором КОЗ-Туб, К05-Туб, К07-Туб и ПКО- 
Туб по каналам Г А М  и R O X  .
Регистрация КОЗ-Туб, К05-Туб, К07-Туб и ПКО -Туб свидетельствует о 
наличии в образце специфических фрагментов Д Н К гена 1^6110 и regXS МБТ.
Регистрация О К О  и О КО -В по каналу R6G  свидетельствует о выделе­
нии Д НК в процессе пробоподготовки и отсутствии ингибиторов ПЦР.
9. И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я  Р Е З У Л Ь Т А Т О В  А Н А Л И ЗА
Образец считается положительным на присутствие специфического 
фрагмента IS67/0, если зарегистрирован рост флуоресценции по каналу ГА М  
(зонда, специфичного для гена \S61W\ а значение порогового цикла меньше 
45, и отрицательным, если автоматическое определение значения порогового 
невозможно.
Образец считается положительным на присутствие специфического 
фрагмента regX, если зарегистрирован рост флуоресценции по каналу R O X  
(зонда, специфичного для гена regX3\ а значение порогового цикла меньше 45, 
и отрицательным, если автоматическое определение значения порогового не­
возможно.
14


--- стр. 16 ---
т
По каналу R6G -  ВП К-В Туб -  контролируют выделение ДЦК в процессе 
пробоподготовки и наличие в образце ингибиторов реакции амплификации. 
Образец считается положительным на присутствие В П К , если значение порого­
вого цикла меньше 45 и отрицательным, если автоматическое определение зна­
чения порогового невозможно.
Результат анализа отрицательного контрольного образца (ОКО) дол­
жен быть отрицательным для реакций на 
IS6110 и regX (каналы FA M  и R O X ) и 
положительным для В П К  (канал R6G). В  случае получения положительных ре­
зультатов для О КО  по реакции на IS6I10 и regX результаты определения всех 
положительных образцов считаются недействительными. В  этом случае необ­
ходимо повторить постановку и, если это необходимо, провести специальные 
мероприятия по выявлению и устранению источника контаминации (реактивы 
для ПЦР и комната для подготовки к проведению реакции).
Результат анализа отрицательного контрольного образца выделения  
ОКО-В должен быть отрицательным для реакций на IS6110 и regX и положи­
тельным для В П К . Допускается получение положительного результата по кана­
лу 
\S6IJ0 с пороговым циклом более 35 при отсутствии какого-либо роста 
флуоресценции по каналу regX. В  случае получения положительных результа­
тов для ОКО-В и по реакции на IS61I0 и по реакции regXрезультаты определе­
ния всех положительных образцов считаются недействительными. Требуется 
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации (реак­
тивы и помещение для выделения Д Н К) и провести повторное выделение и 
анализ всех положительных проб.
Для оценки количества выявленной Д Н К микобактерий туберкулезного 
комплекса используются контрольные калибровочные образцы с известной 
концентрацией, позволяющей определить число копий фрагмента IS6110 и 
regXS Д Н К микобактерий туберкулезного комплекса. По окончании реакции в 
программе прибора для ПЦР-РВ по флуоресценции калибровочных образцов в 
соответствующих каналах строятся калибровочные прямые для оценки копий 
фрагментов IS67 7  
О и regX3.
15


--- стр. 17 ---
ф
Для калибровочной прямой должны выполняться ВСЕ ниже перечис­
ленные условия:
коэффициент корреляции не ниже 0,99;
коэффициент А калибровочной прямой лежит в диапазоне от -  0,25 до -
0.35.
эффективность ПЦР составляет не менее 90%.
Получение иных значений этих параметров для калибровочной прямой свиде­
тельствует об ухудшении работы реактивов или неправильной подготовке к 
проведению реакции.
Число копий для неизвестных образцов рассчитывается автоматически по 
построенной калибровочной прямой.
Результаты анализа исследуемых образцов принимаются только при  
выполнении ВСЕХ вышеперечисленных условий для контрольных образ­
цов!
Результат анализа на обнаружение Д НК микобактерий туберкулезного 
комплекса считается :
1. Положительным, если реакция на IS6770 и 
regX или каждая отдельно 
оценены как положительные.
2. Отрицательным, если реакция на IS 6 II0 и regX оценены как 
отрицательные, реакция на В П К  оценена как положительная, разница 
пороговых циклов между реакцией на В П К  для О КО  и В П К  
исследуемого образца более двух.
3. Недостоверным, если реакция на 
IS 6 II0 и regX оценены как 
отрицательные, реакция на В П К  оценена как отрицательная. 
Следовательно, образец заингибирован, и необходимо либо его 
предварительное разведение перед реакцией амплификации, либо 
перевыделение ДНК.
4. Недостоверным, если реакция на IS6I10 и regX оценены как 
отрицательные, реакция на В П К  оценена как положительная, разница
16


--- стр. 18 ---
ф
пороговых циклов между реакцией на В П К  для ОКО  и В П К  
исследуемого образца менее двух.
Для положительных образцов проводится автоматическое определение 
количества микобактерий туберкулезного комплекса. Результат исследова­
ния на определение количества микобактерий туберкулезного комплекса в 
пробе считается:
1. Точным, если количество лежит в пределах расчета по калибровочной 
прямой.
2. Приблизительным и лежащим вне диапазона количественного 
определения, если количество лежит вне пределов расчета по 
калибровочной прямой.
Интерпретация результатов для исследуемых образцов при автоматиче­
ском анализе с использованием шаблона для автоматической обработки ре­
зультатов анализа приводится в Приложении 5.
10. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ
Транспортирование набора «Амплитуб-РВ» должно производиться в со­
ответствии с СП 3.3.2.1248-03 всеми видами крытого транспорта при темпера­
туре от 2 до 8 °С  не более трех суток.
11. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
11.1. После получения набор «АмплиТуб-РВ» необходимо разукомплек­
товать на составляющие комплекты № 1 и № 2 для дальнейшего хранения и ис­
пользования.
11.2. Комплект реагентов для выделения Д Н К (комплект № 1) следует 
хранить в сухом, защищенном от света месте, при температуре от 2 до 8 °С  в 
течение всего срока годности набора.
11.3. Комплект реагентов для постановки ПЦР-РВ (комплект № 2) 
следует хранить в сухом, защищенном от света месте, при температуре от 
минус 18 до минус 20 X  в течение всего срока годности набора.
17


--- стр. 23 ---
Красители
25
EL
26
ш.
27
а.
17
Ш
18]
m Ш 2\
а
10
Ш
(28 29
ш.
30
а . IT 1  м ш .
n J K . O , (21
ш
2 2]
м ш 
[11Мр12]
ш
1 3
ш
14
E L
m и з
I S  к
^ И 1  И з
а. ш. ш. ж. I L J B  и
8
1 з 1  И
Су5
О К  Отм»
5. Н аж ать клавиш у « С в е д е н и я  о б  о б р а з ц а х . . . » , в появивш емся окне выбрать краситель FA M 
и, пользуясь инструкцией к прибору, ввести следуюшие сведения об образцах:
Лунки №  1-2: К 0 7 
Лунки №  3-4: К 0 5 
Лунки №  5-6: КО З 
Лунка №  7: П К О 
Лунка №  8: О КО 
Лунки №  9-10: ОКО-В
Сведения об о6раз1лах по красителям
FAM R6G 1  ROX 1
Номер Тип Название или номер ^ ИО
лунки ОКО
5
6
7
8
9
1 0
11 ИО
12
КО 7
КО 7
КО 5
К05
КОЗ
КОЗ
ИО
ИО
И02
И02
ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
10е+7
10е+7
Юе+5
10е+5
Юе+З
Юе+З
ПКО
ОКО
ОКО-В
ОКО-В
ВПК
КВПК
К О ?
РР
Зааать
гКраггносгь
Копировать Вставить Очистить
ОК Отмена
Нажать клавиш у «О К ».
6. Н аж ать клавиш у 
« С о х р а н и т ь » . В  появивш емся окне «Сохранить метод Циклический»  
нажать клавиш у «Создать пользователя», ввести название папки «Анализ М БТ », и нажать  
«О К »:
23


--- стр. 24 ---
Сохранить метод Циклический S 3
Всего пользователей: | 2 |  В сего данных у пользователя: |  [
I Общий
Ввод названия
Длина не меньше 5 символов
[Анализ МБТ I
О К Отмена
Т екуший:
Создать пользователя | Удалоть Сохранить Закрыть
Если указанная папка уж е сущ ествует, выбрать ее щелчком мыщи.
Нажать клавиш у «Сохранить», ввести название протокола « М Б Т  К а л и б р о вк а» и нажать 
«О К »:
Сох^^угь мёго^^|^1чеосий _________________________ I ^  I
Всего пользователей: |  2 | Всего данных у пользователя:
{Общий
Анализ МБТ
Ввод названия
Длина не меньше 5 символов
|МБТ Калибровка]
ОК Отмена
Т екуший:
Создать пользователя Удалить Сохранить I  Закрыть
7. При дальнейшей работе использовать созданный метод.
Создание протокола «МБТ Тест»
1. О ткры ть программу «ПЦР» для прибора АНК-32
2. Вы брать Режим работы Циклический
24


--- стр. 25 ---
. П рограм м а д л я  ПЦР (3 2 ) SN 1 0 0 6 10[Э муляция]
Файл Вид Режимы работы Настройки Окно Справка
Прием 9t* о
^ Т р осм отр^ ^ Д аН Н Ы К^ ^ И ^ ^
л  НочнойАктивация Плавление режим
3. в  появивш емся окне в соответствии с инструкцией к прибору з а д а т ь  п р о г р а м м у ампли- 
фикатора со следующими параметрами:
Номер
ступени
Температура Время Кол-во
циклов
Метки
циклов
1 95 120 1
2 61 50 45 Начало
3 95 15 45 Конец
'Vp Циклический 1  о  1 !  (D S3
Номер 1  
ступени '
Т емпература 
(градусы]
Время
(секунды)
Количество
циклов
Метки
циклов
1  95.0 120 1
2 61.0 50 45 Начало
3 95.0 15 45 Коне
Т емперэтураг Время
15 л ►
Установить параметры циклов
Редактировать таблицу
Добавить I Заменить I Удалить I Вставить
Сохранить Загрузить
Красители... Старт
Сведения об образцах.. Закрыть
4. Нажать клавиш у « К р а с и т е л и » ^ выбрать в появивш емся окне красители FAM , R6G и R O X 
и нажать «О К ».
25


--- стр. 26 ---
5. Н аж ать клавиш у « С в е д е н и я  о б  о б р а з ц а х...в  появивш емся окне выбрать краситель FAM
и, пользуясь инструкцией к прибору, ввести следующие сведения об образцах:
Лунки №  1-2: КО З 
Лунка №  3: П К О
Лунка №  4: О КО
Лунки №  5-6: О КО -В
Сведения об образцах по красителям
FAM IRGG I ROX 1
Номер
лунки
Тип Название или номер
И02
И02
ИО
ИО
И02
И02
5
6
7 1  ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
ИО
1000
1000
ПКО
ОКО
ОКО-В
ОКО-В
око
ПКО
ВПК
квпк
к о ?
рр
Задать
-Кратность
-----------
1  С  2 Г  3 Г  4
Копировать Вставить | Очистить
ОК Отмена
Нажать клавиш у «О К ».
6. Нажать клавиш у « С о х р а н и т ь » . В  появивш емся окне «Сохранить метод Циклический»  
нажать клавиш у «Создать пользователя», ввести название папки «Анализ М БТ », и нажать  
«О К »:
Сохранить метод Циклический 1  ^  I
Всего пользователей:[ I T D Всего данных у пользовагтеля:
Ввод названия | 1 1 еУ
Длина не меньше 5 символов
[Анализ МБТ |
ОК 1  Отмена
Т екуший:
Создэть пользователя Удапкть Сохранить Закрьпгь
26


--- стр. 27 ---
Если указанная папка уже сущ ествует, выбрать ее щ елчком мыши.
Нажать клавиш у «Сохранить», ввести название протокола « М Б Т  Т е ст» и нажать «О К »:
Сохранить
Всего пользователей: [ 2 |  Всего данных у пользователя | 1  |
Общий
Ввод названия Ш Ш
Длина не меньше 5 символов
|МБТ
ОК 1  Отмена
Т екуший:
2008 04 14 00 17 56,mtd
Создать пользователя Удалить Сохранить"! Закрыть
7. П р и  д а л ь н е й ш е й  р а б о т е использовать созданный метод.
Н а с т р о й к а  п а р а м е т р о в  р а с ч е т а
В  программе «П Ц Р » для АНК-32 выбрать опцию «Настройки» и затем «Расчет». Привести  
окно «Расчет» к следующ ему виду:
Расчет n o g
Канал 1 Канал 2 Канал 3 Канал 4
Отношение максимум/минимум больше, чем :|1.400 1.400 |1.400 1 |1.300
Отношение между соседними точками меньше2.100 2.100 |2.100 12.100
Абсолютный рост по амплигуае больше, чем ; 100 |юо |100 100|
Порог : 10.000
Расчет по последним точкам
Отношение максимум/минимум больше, чем1.100 1.100 |1.100 |1.100
Уровень 0 000 
порогового цикла; Г” Включить в расчет
Число точек на полке;
npHMeHPfrb и Выйти ОК Отмена
Нажать клавиш у «О К ».
О р г а н и з а ц и я  о т ч е т н ы х  ф а й л о в  о п и с а н а  в  п р и .’ю ж е н и и  5.
27


--- стр. 28 ---
Порядок работы, учета и интерпретации результатов анализа на приборе
АНК-32 (Россия)
Подготовка к работе
В  случае первого использования прибора АНК-32 или переустановки программы необходи­
мо создать 2 новых протокола - «М Б Т  Калибровка» и «М Б Т  Тест».
Создание протокола «МБТ Калибровка»
1. О ткры ть программу «ПЦР» для прибора АНК-32
2. Вы брать Режим работы Циклический
Приложение 2.
П р о г р а м м а  д л я  ПЦР ( 3 2 )  SN 1 0 0 6 1 0 [Э м у л я ц и я ]
Файл Вид Режимы работы Настройки Окно Справка
Sj Прием  § t*  ^  О
Просмотр Данных Иэотерм ичеа^  ^у/ичкпинеский
. Ночной
Плаалеиие режим
3. в  появивш емся окне в соответствии с инструкцией к прибору задать программу ампли- 
фикатора со следующими параметрами:
Номер
ступени
Температура Время Кол-во
циклов
Метки
циклов
1 95 120 1
2 61 50 45 Начало
3 95 15 45 Конец
Циклический В  II g
Номер Т емпература Время Количество Метки
ступени (градусы) (секунды) циклов циклов
1 95,0 120 1
2 81.0 50 45 Начало
3 95.0 15 45 Конец 1
Температура ■
|95.0 i И
Время
|15 i ►
УсганоБРГгь параметры циклов
Редактировать таблицу
Добавить I Заменить j Удалить I Вставить
Сохранить
Красители...
Сведения об образцах
Загрузить
Старт
Закрьгть
4. Нажать клавиш у «Красители»^ выбрать в появивш емся окне красители FAM , R6G и R O X 
и нажать «О К ».
22


--- стр. 29 ---
П р о в е д е н и е  а н а л и з а .  В а р и а н т  « М Б Т  К а л и б р о в к а » .
Порядок следования образцов при варианте анализа « М Б Т  К а л и б р о в к а » и подготовка  
к проведению П Ц Р-РВ описан в основной инструкции.
1. Вклю чи ть прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
2. Запустить программу «П Ц Р » для прибора А Н К - 16/32.
3. Вы брать режим работы « Ц и к л и ч е с к и й » ^ нажать клавиш у « З а г р у з и т ь »
Прпгрлммл ЛПЙ 1К(Р (37) S M  IППАI П[ 4пупяцхя]
Файп Вид Режты работы Настройки Окно Справке
' lAj Приен J T I O  4
Просмотр Д анных Изотермический ^/Циклический Плавлемие режим
1
Номер 1 ем1ервп)ра Время ! Количество
стапени (rpdftSCbl) |секу«ы) I циклов
Метки
циклов
2 95.0
3 60 0 
950
600
50
20
ГТемперап|рв-------- “ бремя
|500 Ы J J |б0 [ J J  j J
Добавить 1  Заменить Удалить 1  Вставить
Красителн
Начало
Конец
Установить параметры циклов | 
Редазд^рватьтабляин |
Сохранить I ^Загра»игь | 
Старт I
Закрыть
4. Вы брать папку «Анализ М Б Т »  и протокол « М Б Т  К а л и б р о вк а »  и нажать клавиш у «За­
грузить».
Загрузить метод Циклический 1 И У Ш 1
Всего пользователей; |  2 | Всегоданных а по/ьзовэтеля: | 2 |
МВТ Тест
I  екуший:
2008 04 14 00 17 SG.irrfd
Удалить пользователя Удалить Загрузить ^Закрытъ^
5. В  появивш емся окне «Красители» проверить установку красителей F A M , R 6 G  и R O X  и  
нажать «О К ».
6. Начать работу прибора нажатием кнопки «Старт».
28


--- стр. 30 ---
7. После загрузки и начала работы прибора в окне «Прием данных» нажать клавиш у «Об­
разцы». В  появивш емся окне выбрать краситель F A M , перейти на лунку №  11 и после­
довательно внести названия образцов.
Сведения об образцах по красителям [редакция]
FAM
Номер
лунки
R0G I ROX I
Тип Название или номер
1
К07
К07
К05
К05
КОЗ
10е+7
*10е+7
10е+5
10е+5
10е+3
ОКО
ПКО
ВПК
КВПК
КО ?
РР
Задать
КОЗ 10е+3 N
ш ш ИО ПКО Кратность
г г ио ОКО f? 1  Г  2 Г  3 Г  4
И02 ОКО-В
И02 око-в
ИО 1
Копировап-ь BcraBWb | Очистить
ОК Отмена
Нажать клавиш у «Копировать», перейти на краситель R 6 G , нажать клавиш у «Вставить», пе­
рейти на краситель R O X , нажать клавиш у «Встави ть» и «О К ».
8. Зафиксировать в рабочем журнале название файла.
Данные в Файле FILES\2008\04\07_08_22_52.pcr
9. Отработанные пробирки утилизировать в соответствии с рекомендациями по организа­
ции П Ц Р лаборатории.
Р а с ч е т  з н а ч е н и й  п о р о г о в о г о  ц и к л а
1. После завершения реакции, нажать клавиш у «Просмотр».
2. Вы брать файл, содержащий данные работы прибора, шелчком левой кнопки мыши.
29


--- стр. 31 ---
П росмстр данньос По у м о т м м ю '.П о  ум олчанию
Г  Тем ператд оа Г  О бразц ы  П Режим
3. в  меню «Как считать» выбрать «Автом ат».
4. Нажать клавиш у «Расчет». П оявится окно «Общ ий расчет» с рассчитанными пороговы­
ми циклами:
l2 j|
1 т
KbU ■ 1 0 0  0 0 0Ндэеание цжл ^ФФ
ГПУ 10е*7 3 4  4 56 1 еэ 90  0 0 0 ■ is -
' J7 10е*7 3430 6168 8 0  О О О f j .
■ 05 lOe.5 3102 6 4  5 8 11' 10в*5 Л 2 4 60 7 1 7 0  0 0 0 I I•  :з 10в*3 Э 0  9 9 66 3 6 6 0  О О О ' - l - l> 10е.З 3 1  3 0 5816 11
3 4  9 5 50 2 350  0 0 0 1  г
"•02 3417 46 7 4 4 0 0 0 0 1  liuf.oF 3 0  9 2 49 в4 1 1‘
0К02 3 1  2 445 2 4 3 0  0 0 0 - *•  I j......
■ • 'О !?ко5вьв2 3 1  2 $ 4 1  5 6 20  0 0 0 /1  j___
.‘Э2’ ио5»м>2 31’1 1 4 6  3 3 f t.0 2 ' ГКО И С Х 3 4  1 0 4 7  4 310000 iJ.^j 2' ГКО  иск 34^ 5355 0
И02 ■ пковыа1 3 0  8 46365 ' 4 0И02 пковьв! 31 0 1 69 4 9
В  этом окне нажать клавиш у «Сохранить», выбрать «Рабочий стол» ^  «М БТ » «Отче­
ты » — >  «Год» -> «Месяц», в поле «И м я файла» ввести название в форме «год.месяц.число- 
данные». Н аж ать «Сохранить»:
Па1ка О  (Л
2008-01-15-данные 
IT 2008-01-23-отчет
Имя ф айла; 
Тип ф айла:
1200801 - 1 5 *» « ы в |
и
Сокранмгь~] 
Отмеиа I
Нажать клавиш у «Закры ть» в окне «Общ ий расчет».
30


--- стр. 32 ---
5. Закрыть или свернуть программу «ПЦР».
О б р а б о т к а  р е з у л ь т а т о в  П Ц Р - Р В  с  п о м о щ ь ю  ш а б л о н а  в  п р о г р а м м е  E x c e l  о п и с а л а  в  п р ш о - 
ж е н и и  5.
П р о в е д е н и е  а н а л и з а .  В а р и а н т  « М Б Т  Т е с т »
Порядок следования образцов при варианте анализа « М Б Т  Т е с т » и подготовка к про­
ведению П Ц Р-РВ описан в основной инструкции.
1. Вклю чи ть прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
2. Запустить программу «П Ц Р » для прибора А П К - 16/32.
3. Вы брать режим работы « Ц и к л и ч е с к и й » , нажать клавиш у « З а г р у з и т ь »
ЛляПЦР(3?)<>Н 1ППЫ0(№1улацк-я]
Файл Вил Режипя работы Настройки Окно Справка
П рием вГ 2 ^ 0 4
Просмотр данных Изотермический ✓ИкжяичвсыЛ Плавление
--------------------------------------------------------------
Ночной
режим
1
Цим Я И Ч Р С М И Й п а п
Номер Tet^iepaTipa Время \ Количество i Метки
Ст1)пвнм (градасы) (секувы) 1 циклов j U i« C J1 0e
1 500 60 1 _______1
95.0
е а о
95.0
600
50
20
1500  Ы J И
-Время
|б 0  [ J J  J
Добавить 1  Заменить Удалить 1  Вставить
Начато
Конец
Установить параметры циклов
Редактировать таб.оицу
Красители
C sta eH V M ) об sdpanim..
Сохранить I ^^Загрйзнть 
/  Старт
2 Закрыть
4. Вы брать папку «Анализ М Т Б »  и протокол « М Б Т  Т ест» и нажать клавиш у «Загрузить».
Загрузить метод Циклический 1 а ш 1
Всего пользователей; 
I Общий
'.н-з'ш:-. МЕТ
Всего данных у пользователя; | 2
МБТ Тест
Т екуший;
2008 04 14 00 17 56.mtd
Удалить пользователя Удалить Загрузить Закрьп-ь
31


--- стр. 33 ---
5. В  появивш емся окне «Красители» проверить установку красителей FA M , R6G и R O X  и 
нажать «О К ».
6. Начать работу прибора нажатием кнопки «Старт».
7. После загрузки и начала работы прибора в окне «Прием данных» нажать клавиш у «О б­
разцы». В  появивш емся окне выбрать краситель FA M , перейти на лунку №  11 и последо­
вательно внести названия образцов.
Сведения об образцах по красителям а
FAM
Номер
лунки
R6G I ROX 1
Тип Название или номер
И02 1  000
И02 1  000
ИО ПКО
ИО ОКО
И02 ОКО-В 
И02 ОКО-В 
ИО 1
ОКО
ПКО
ВПК
квпк
КО ?
рр
Задать
1
-Кратность
-----------
1  Г  2 Г  3 Г  4
Копироваггь Вставить О'адстить
ОК Отмена
8. Зафиксировать в рабочем журнале название файла.
Данные в Ф ай ле FILES\2008\04\07_08_22_52.pcr
9. Отработанные пробирки утилизировать в соответствии с рекомендациями по организа­
ции П Ц Р лаборатории.
Р а с ч е т  з н а ч е н и й  п о р о г о в о г о  ц и к л а
1. После завершения реакции, нажать клавиш у «Просмотр».
2. Вы брать файл, содержащий данные работы прибора, щелчком левой кнопки мыши.
32


--- стр. 36 ---
П р и л о ж е н и е  3
Порядок работы, учета и интерпретации результатов анализа на приборе RotorGene
6000 (Corbett Research, Австралия)
П о д г о т о в к а  к  р а б о т е
В  случае первого использования прибора RotorGene 6000 или переустановки программы  
необходимо создать новый протокол - «М БТ».
1. О ткрыть п р о г р а м м у «П Ц Р» для прибора RotorGene 6000.
2. Вы брать в открывш емся окне «New Run» действие «Em pty Run» и нажать «New».
Quick Start Advanced I
Perform Last Run
hmpty Run
Intercalating Dyes 
Hydrolysis Probes 
Hybridisation Probes
H R M ’H
Other Runs
Instrument Maintenance 
a Infections, pro 
^  SNP-screen
TEST2 FAM_ROX.pro
An empty run allowing 
the user to start 
defining their profile 
from scratch.
New
Cancel
Help
P " Show TNs Screen When Software Opens
3. в  открывш емся окне выбрать необходимый тип ротора поставить галочку в окне  
«Locking Ring Attached», нажать «Next».
—  x j|New Run W izard
4. B  открывш емся окне при необходимости заполнить поля «Operator», «Notes», в окне  
«Reaction Volume» установить значение 25 и нажать «Next».
35


--- стр. 37 ---
N(>w Run W izard
Thi$ scteen dispiays miscelanecxjs optiom fa  the lua Complete the fields, 
cfcking Next when you «e rea<ii to move to the next page
Opetatof:  [
Notes:
Reaction 
Volume (pL); i j
г  IS u L o ll^v o lu m e
Sample Layout: | l 2,3 ~ 3
SkyWizaid | « B ack | tje x l»  |
This box displays 
help on elem ervts in 
the wizatd F cv help 
on an item, hove» 
yout mouse ovet the 
item fm help. You 
can also click on a 
combo box to dcspl^ 
help about its 
availeble settiigs.
5. В  открывш емся окне нажать кнопку « E d it Pro file».
New Run W izard
Temperatuie Profile.
Channel Setup:
Name I  Souce I  Detector I  Gain
Gieen 470nm 51 O ran
Yellow 530nm 555nm
Orange 585nm 610nm
Red 825nm 660nrt>
Crimson 680nm TIOhp
Gain Optimisation
Skip Wizard | « ja c k  | tje x t»  |
DeateNew..
£dk...
Edit gain..
Remove
Reset Eef auks
J < J
This boK displ^ 
help on elements in 
the mzard For help 
on an item , hover 
your mouse ove> the 
Item (or help. You 
can also click on a 
combo box to displ^ 
help aboU its 
available setlngs.
6. В  открывш емся окне нажать треугольник справа от кнопки «N ew » и выбрать «C yclin g  
(defau lt)».
я  1  |Ы P r u lllf
1 ^
New
. V W  1  d
Open Save As 1 Help
1 Cydng (ck-^^suk> lO «econd(s) to comptete. The graph bek>w represents the rum to be pefformed
Met
C yclngbM elt 
Cydng with PrehoWs
1
a ick  on a сзк:1е bekMW lo moctfy *
....... )■  Ins«l4#*ef... 1
pim ert be(cre 1 
Remove |
. _  . ___:_
7. В  появивш емся окне « E d it P ro file »  задать программу амплификации со следующими 
параметрами:
Шаг Температура,
"С
Время Детекция Кол-во по­
второв
Hold 95 2 mins No acquiring 1
Cycling 61 50 secs Acquiring 4595 15 secs No acquiring
36


--- стр. 38 ---
X I
New
V  u
Open Save As
< »
The tun w i 1Л е  appfoximateb> 104 ninjte(s) *o complete. The gtaph bdow tepcesenls the run to be petfonned
Clicli. on a cyde below to modity it;
C ycir^
Hold Tefnpetatuie:  95 j jgg
HoldTime: 2 | itiins 0 j sect
I Imett attet... | 
Iraert fadoie... | 
Remove |
Й , tJ U
New Open Save As Heip
The lun wd take appioximately 104 mnule(sj to compjeta The giaph bebw lepiesenls the run to be performed:
Ctck on a cycle below to modify к :
Hold
2  Remove |
The cycle repeats 45 | timeltt
Cfck on one of the steps below to modiy it, a  press + 01 •  to add and remove steps for this cycle
8. Для температуры 61"C в окне «A cq u isitio n » выбрать каналы красителей «G reen»,  
«O ran ge» и «Y e llo w ». Н аж ать кнопку « О К » .
A cquisitiun
Same as Previous; [(New Acquisi(ion)
-Acquisition Configuration: ■  
Available Channels:
Name
Crimson
Red J i i
id
Acquiring Chantiels:
Orange
Yellow
Tо acquire from  a channel, select it from  the Sst in the left and click > . To stop acquiring from  a 
channel, select it in the right-hand list and click < . To remove all acquisitions, click « .
Dye Chart»  \
Dye Channel Selection Chait
Q K ^ _ j Don't Acquire \ Це1р |
Channel Sauice Detectai Dyes
fireen 470nm 5 1 O nmFAM -', SYBR Green 1'^, Fluorescen, EvaGreen-', Alena Fluor 488^’
Yellow 530nm 555nm J0 E  4  V IC 4  HEX. ТЕТ Ч  CAL Fluor Gold 540^', Yakima Yellow-^'
Oratige 585nm 6 1 O nmROX-i>, CAL Fluor Red GlO -i-', Cy3,5^. Texas Red^^', Alexa Fluor 568^'
Crimson
625nm 660nm Quasar 670'*^, LightCycler RedG40-', Alexa Fluor 633-^'
680nm 710hp Quasar705i', LightCycler Red705^', Alexa Fluor 680-^'
37


--- стр. 44 ---
Обработка результатов ПЦР-РВ с помощью шаблона в программе Excel описана в прило­
жении 5.
43


--- стр. 45 ---
Пршожение 4
Порядок работы, учета и интерпретации результатов анализа на приборе iQ5 (Bio-Rad 
США)
Подготовка к работе
В  случае первого использования прибора iCycler iQ или переустановки программы необхо­
димо создать новый протокол - «МБТ».
1. Открыть программу для прибора iCycler iQ.
2. Выбрать окно Workshop, затем Setup— ► Run Set.
3. В  поле Setected Protocol выбрать опцию Create New:
4. В  появившемся окне задать название протокола и программу амплификации со 
следующими параметрами:
Cycle
(цикл)
Repeats
(повторы)
Step
(шаг)
Dwell
Time
(время)
Setpoint
(темпера­
тура)
PCR /Melt Data 
Acquision
1 1
1 02:00 95,0
2 45
1 00:15 95,0
2 00:50 61,0 Real time
СШ ЕЕШ В
Яг V to »« TmIi неЬ
э ш т я а г у
S a v g  а  E x t P r r t o o o l Ы Ш з
C a - ce t а £Ч1 Pro to co l &3«nq
s t e p  I
015
Cyd«245X
—T... asc» 2
61,0
050
Show O ptXM v
■ JX iW A U  ■jsiNwteHold
Gradenc
O p b O T tt
noerett^OungB
eChart^e
Cyd. HtfM i  Step ‘JJ J I : 5
27.112006 «1Э.49
5. Нажать Save&Exit Protocol Editing, затем ввести имя протокола MBT.tmo и нажать 
Сохранить.
6. В  поле Selected Plate Setup выбрать опцию Create New.
7. В  появившемся окне задать следующие параметры:
Sample Volume: 30 
Seal Type: Domed Cap 
Vessel Type: Tubes
8. Нажать кнопку Select/ Add Fluorophores. В  появившемся окне Fluor Selector выбрать 
следующий набор красителей: FAM, HEX, ROX.
44


--- стр. 46 ---
SYSfil
SYW2
SYBR3
SYBfi4
SV 1R5
HEX
JOE
JiC
--------3
„ ■ W > W ? g_I
9. Нажать OK.
10. В  зависимости от выбранного варианта исследования («Калибровка» или «Тест») и в 
соответствии с инструкцией к прибору задать расположение пробирок в 
амплификаторе (см. п. «Порядок следования Д Н К  образцов»). Выделить область - 
исключая крайние ячейки. Нажать Spreadsheet, задать названия образцов. Нажать 
Exit Plate Spreadsheet Editing.
11. Нажать Save & Exit Plate Editing. Сохранить.
12. При дальнейшей работе использовать созданный шаблон.
Организация отчетных файлов описана в приложении 5.
Проведение анализа. Вар иан ты  «М БТ  Калибровка»у «М Б Т  Тест».
Порядок следования образцов при варианте «М Б Т  Калибровка»
В каждую постановку включают три калибровочных образца (К О ) Д Н К (в повторе), 
один положительный контрольный образец П Ц Р (П К О ) и один отрицательный контрольный 
образец ПЦ Р (О КО ).
Отрицательный контрольный образец выделения (О КО -В) из каждой партии вьщелений 
Д Н К анализируют как исследуемый образец.
Для корректной работы шаблона для автоматической обработки результатов необходи­
мо использовать следуюший порядок образцов:
Ячейки В2-ВЗ: 
Ячейки В4-В5: 
Ячейки В6-В7: 
Ячейка В8: 
Ячейка В9: 
Ячейки ВЮ -ВП: 
Ячейки C2-N:
два КО 7 
два КО 5 
два КО 3 
один ПКО 
один ОКО 
два ОКО-В
исследуемые образцы с повтором каждого.
№  ячейки Образец
В2 КО 7
ВЗ КО 7
В4 КО 5
В5 КО 5
В6 К О З
В7 К О З
В8 ПКО
В9 ОКО
В10 ОКО-В
В11 ОКО-В
С2 исследуемый образец 1
СЗ исследуемый образец 1
С4 исследуемый образец 2
С5 исследуемый образец 2
45


--- стр. 50 ---
Setup
Н  ProtDcol 1  н  Plate |  ШШ Run Set | а  Data File |
j 1  i 1
I 1  j 1
E
1  1  
1  1
i r '  i
■  Наборы для Д Н К - д !^  - * • ! 
плавление 
п он и  
П риборы
j  1-Н^ BioRad _|
RG
Й SC
liH£j А Н К-32 .
П П ГГ Т П К 'n  ni^l
in.opd
2. в  меню Data Analysis выбрать P C R  Quant. Нажать кнопку Results и экспортировать 
данные в Excel.
Обработка результатов ПЦР-РВ с помощью шаблона в программе Excel описана в прило­
жении 5.
49


--- стр. 51 ---
Пртожение 5
Организация отчетных файлов
Рекомендуется следующая организация отчетных файлов на компьютере:
1. Создать на Рабочем столе (или другом удобном месте) папку «МБТ».
2. Внутри папки «М БТ» создать 2 папки с названиями «Ш аблоны» и «Отчеты».
3. В  папку «Ш аблон» скопировать шаблон для обработки результатов анализа с CD -  
диска, который прилагается к набору реагентов.
4. Внутри папки «Отчеты» создать папки по годам и, если требуется, по месяцам.
Н астройка параметров программы «Excel»
Для обработки результатов реакции необходимо, чтобы на компьютере была установлена 
программа Microsoft Excel из пакета Microsoft Office.
Для корректной работы шаблона для автоматической обработки результатов необходи­
мо, чтобы в программе Excel в качестве разделителя целой и дробной части была установ­
лена запятая. Данная операция выполняется один раз. Если Вы уже выполнячи эту опера­
цию для этой или других тест-систем, этот пункт следует пропустить.
Открыть программу Excel.
Нажать: Пуск — >  Программы — >  Microsoft Office Excel 
В  программе Excel выбрать вкладку «Сервис»,  затем «Параметры»:
фвйл QpeeKo 5СТ4ВК4 Форо«т
' □ и» в  <2#  «1 в  Ql г  X Чь
1*«*суГ -йо" .1 ж у
СОЖ.С а » »
у  Г - -I I*  ® 'f®? -I с з . 
ir г» _  - й  - Д . -
Выбрать закладку «Международные»  и в разделе «Числа» укажите:
Разделитель целой и дробной части « , »
Разделитель разрядов - пробел:
Г  В«д  I  Вы^слег« « 1 I П р авка | О б щ и е | П е р е х о д  
М вж д уш р од м ьж  I С о х р ан ен и е | П р о вер ка о и и бо к 
Ч и сп а
еаздвл1тв«>  ц ело й  н д р о б н о й  част1^|] J  Рд ад ел и т*!
(~ Цтользоватъ сжтеяные р азд елитв?Н  
Печать ■
С п и ски  I Д нагрлм о | Ц вет 
О р ф о гр а ф и я I Беэопаою сть
F  П реобоазоваж е A J/Lettet
Н а п р авл ен и е текста - 
-------
Н ап р авлен и е п о  уиоячаи ию  Г  сп р ава налево П ер еи вщ ен и в кур со р а ff яоо«еское
< •  слева н ап р аво  С ф »о и чесх о е
1~ П р ос{}атр иватъ текуищ й лиа сп р ава налево Г~ Стображ ать управляоиие знаки
50


--- стр. 52 ---
Обработка результатов в программе Excel 
Вариант «МВТ Калибровка»
1. Открыть шаблон «Количество МБТ -  Калибровка». Для этого выбрать Рабочий стол 
МБТ Шаблоны Количество МБТ -  Калибровка.хк. Нажать «Не отключать мак­
росы».
2. Ввести в соответствуюшие ячейки дату, имя оператора, название исходного файла (в про­
грамме «ПЦР»), серийный номер набора.
Нажать клавишу «О К».
В D
Т е с т - с и с т е м а : " А ы п л и т у б - Р В "
К а ч е с т в е н н о е  и к о л и ч е с т в е н н о е  
Т и п  а н а л и з а ;  о п р е д е л е н и е  Д Н К  м и к о б а1с т е р и й
т у б е р к у л е з н о г о  к о м п л е к с а
Дата^________ "170308_________
О п е р а т о р : А в р а м е н к о
Ф а й л :  0 ^ ^ 0 5 0 5 0 3 - 1 7 1 6 1 9 0 7
С е р и я / ^  Г  050503
3. Импортировать в шаблон рассчитанные значения пороговых циклов. Для этого нажать  
клавишу «Импорт данных», выбрать папку Рабочий стол ->  МБТ Отчеты ^  Год ^  
Месяц ->  «название_файла.данные». Нажать «Открыть» и «Готово».
в I
Тест-система;
Тип ан ал и за:
Д ата:
О ператор:
Ф а й л :
С ери я
"А ы плитуб-РВ"
К ачествен н о е и коли чествен но е
определение ДНК м икобактерий
туберкулезного ком плекса
*170308
А врам ен ко
050503-17161907
^  |[ 050503 I
Ж 1 Г J  к L
Импорт данных
4. Сохранить отчет. Для этого нажать «Файл», затем «Сохранить как...». Выбрать Рабочий 
стол ->  МБТ О тчеты  ^  Год ^  Месяц. В поле «Имя файла» ввести название в форме  
«год.месяц.число.отчет». Нажать «Сохранить».
5. Для того чтобы распечатать отчет, необходим о перейти на лист с названием «Отчет», на­
жать «Файл», затем «Печать» и «ОК». Для полного отчета можно распечатать и лист «Ре­
зультаты»
4U 1/
41 18
42 19
43 20
44 21
< ►  ► ! Результаты j  Отчёт /
На листе «Отчет»:
• в столбце «Название» отражены названия контрольных и исследуемых образцов ;
51


--- стр. 53 ---
в столбце «Н аличие М Б Т  в образце» отражены результаты по обнаружению микобак­
терий туберкулезного комплекса в контрольных и исследуемых образцах;  
в столбце «Число копий М Б Т  в образце» отражены результаты количественного опре­
деления микобактерий туберкулезного комплекса в исходны х образцах;  
в столбце «Вы во д ы » представлены результаты автоматического анализа контрольных и  
исследуемых образцов;
в столбце «Действие» представлены результаты автоматического анализа возможных  
действий.
Пример отчетного файла «Количество М Б Т  -  Калибровка».
Microsoft Excel - Количество МБТ - Калибровг^.
Файл Правка Вид Вставка Формат Сервис ^ н н ы е  Окно Справка
,.J,a  •  J i . - ■  ^ •  at 4? 1°°% •
C6 ^  =Резулыаты!С6_____________________________________________________________________
В D I H
1 Т ест-си сте1*а:
Тип а н а л и з а :
Д а та :
О п ер ато р :
Ф а й л :
С е р и я
"А м п л и Т у б - Р В "
О б н а р у ж е н и е  и о п р е д е л е н и е  к о л и ч е с т в а  
м и к о б ак тер и й  ту б е р к у л е зн о го  ко м п л е кс а  (М Б Т ) 
12 а п р е л я  2008 г.
[П е рв ы й
___________
те с т
С те с т
К а л и б р о в о ч н а я  п р я м а я  д л я  р а с ч ё т а
у  « - 0 .3 0 5 3 Х + 1 1 , 7 9 8  =  0 .9 9 9 0
•  6 0
а о л
З и а ч е м и е  а о р о г о в о г о  ц и к л а
1 0
1 1
1 2
Л
14
15
16 
Г 7 
18 
19
И
и
М
26
27
2 В
М
М
32
И
М
35
Ns Н а з в а н и еН а л и ч и е  М Т Б  
во б р ю ц е
Ч и с л о  к о п и и  
М Б Т  во б р ю ц еВ ы в о д Д е й с т в и е
3^
т
и л
ПК02
око
ОКО-в
ОКО-в
Выш е
В ы и е
7
8
9
1 0  
1 1  
1 2
13 +
14 ♦
15 В ы а е  +
16 Выне-»^
17 ниже
18 ниже 
О К О - в  
о к о - в
ниже -  
ниже - 
ниже ниже 
ниже ниже
19
2 0  
2 1  
2 2
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
--мало
--мало
--нет
--нет
Д а, м ал о
Н ет 
Н ет 
Н ет 
Д а , много 
Д а , много 
Д а 
Д а 
Д а 
Д а 
Д а. м ал о  
Д а, м ал о  
Д а, м ал о  
Н ет 
Д а ?  
Д а ?  
Д а, м ал о  
Д а, м ал о  
Н ет 
Н ет 
??? 
??? 
??? 
??? 
??? 
???
8,72Е+01
3,01
З^ЗЕ^  
3,17Е^04 
335Е+04 
9,81 Е>06 
1 ,0 1 Е^ 7  
8.72Е+02 
1,13Е*03 
1.23Е+01
1^3Е*01
7,99Е*00
Рмуяыаш посшжяш по ГШ) Д О С Я М Димваамрам
Рму>ьт1ты nocmtoem по ОКО достоверны
Рмулылыг I по О КО-В достоверны
Рмупыиы поспноаки по око-8 достоверны
« о г и « с т в о м > ш е д о я р т л м о п )1 р е я е г з  
«олкестмнного йэмерв«я 
w er о (> а р |я т « . с о п )« « !л г в о  яы м  ^ ж я у с п ш о п з  )« е а е л а  с о ш и е с т в е ж о г о  й а м е р м а  
иег ттаикгвовщ лаег»ят>ю я
йзм ерем ю
М БТ о о н я^ а в < > >  ш1м«стао В !«ешв1 isexixHa
Анммммр —II 
Днцц limp—II
А н а п а  аааер м н
А м г м а е е р к и е ч  д г а  д к т а е ц з н а г е  « в п к с с т в е « « г о  о п р е ш » ю  н е о О я о ш м в  р а э О а е в п ъ  о б р а з е цА - а п юдгш достоеерноге «алп кто
и е г о о » о 9 ) я д м >  «n u e s T s o tn p e s ie ra K ^ a v M M 
л а м с р е м »к е т  о О ш р у я в ш . ш п м к г г а о  в  > « (£ № »  A iio n o K M a  
изис(в«а
W T  o & o p p m ii ш г » м к т а о  н п с  Д ! я $ с т и 1 п г о  ^ ^ е д е г а  с о1м « с т в (н н а г о  * < « ia e p e « i М Б Т  о О к б в у ж е н ы  0п1м к т а о > < т а я у с п ш а г о  п р е д е л а  ■ в п м е с л к м н о г о  л « м е р е « в1  ц е т о о > а р а » ц  ю гвм естю м1а»дся?стимсго1тепега 
свпм кгтветого к(мерен1Ш
М Б Т  ч е  o c v a p '/ ie ’ b i 
Ш Т о & о (ц з » ы  е ы с о с и й р к х а к г а н и а ц я !
М Б Т  o o a ip / K f r t o i.  a m o o o r i р н я к к л а ш м а ц м
м е т о о о р л м  а о1« м к т в о » п е д о ц с т м м о л о а р е д е п а  « в г а и е с т м н ф г о  я » и е р » « 9  № Т  о Е > « р э в н ы  ю п м е р п о  нт д о п / с т м ю п з - с е д е л а  с о т ы е с т в е и н о г о  м м е р с и я
и е т н е о е н х г ( ! н » * > :
verntOBKaoixe^
недостаее|»«^ p e » f j < b T a n r  
н е о о с т о в е Е н ь й  p e a t / л ь т з г г  
-«зостоеврчшя p e ^ jb T S T  
педскпааеуньм рещп>т9гг 
неак;танрм 9й p e v f j b T T T -  
неоостоаесньа рев^льттг
c n p e c m w  м е о О к щ д т о  р а 9 0 а в л ъ 0 0 р в ж ц 1 ] и к  
А и ал « явериен
^ а п м »  s a o K t u e H
V a r M a » t e ;iL « H
М л и а е е р ш е н
А е г о н  a a e e p s j e n  е  > « с о с т а е е ( н о 0  ш » н е с т в » * а >  о ц » « о «
A H a iw a a e e p w  с  н е д р с т о и у н о й  н а л и м е  c T T is > o » O M W « o *
А н а р и *  т д р е в ь » »  с  н е а о с т о а с р н с й  ■ о п м е с т в е т а й  о ц м о *
A tm uaB efK i»
Р е ю м в ^ г т е т п  « в т о р и т т ь  « ю г с я о в а н я е
Pemt»Vjerx»>ttBTQ(>m,tvciPeiXB»vB
Л к а т } ja e e n je H  с  и е й о с т о м > о)1 ю г м с с т « » « н о «  о ц0« о «
А н а п и  к а а е е е д е н  с - е я о с т о в е г к я  « о л » ж г т » н »  о ц в а д *
* e rw 3  я в е р ш е м
> М л «  з а в ^ р ш » !
п а в т д а п ь л с с и о д о аан » « ь л е г е и л е н е а ф ф е г г л м
п о в т о р и т ь  JC c n e a o B » « e  е ь щ е л е » и е  н е  э ф ф е с т у в с
п с в т а р и т ь  * с а е г < а о 8 » м е  и м г м е и р о а » ^ »  г х у
n o B io p in k  » » с я О ) ф о в 8 Н 1 1 е  r » f)
п о е т р г м й о е г с д о п а  M t « м ш в и р е в а н к е  rip
П е в т о р ш ъ  ) с и у д о в а < 1 1 е .  « » г я е и р о » « » г ж р
52


--- стр. 54 ---
Вариант «МБТ Тест»
1. Открыть шаблон «Количество МБТ -  Тест». Для этого выбрать Рабочий стол ■  
Шаблоны ->  Количество МБТ -  TecT.xIt. Нажать «Не отключать макросы».
3.
МТБ
2. Ввести в соответствующие ячейки дату, имя оператора, название исходного файла (в про­
грамме «ПЦР»), серийный номер набора.
В D и
Т е с т - с и с т е и а : " А м п п и т у 6 - Р В "
К а ч е с т в е н н о е  и к о л и ч е с т в е н н о е  
Т и п  а н а л и з а :  о п р е д е л е н и е  Д Н К  м и к о б а к т е р и й
т у б е р к у л е з н о г о  к о м п л е к с а  
Д а т а : '^170308
О п е р а т о р : А в р а м е н к о  ________________________
Ф а й л :  0 5 0 5 0 3 -1 7 1 6 1 9 0 7
С е р и я ^ ^  j f  Г  050503
Импортировать в шаблон параметры калибровочных прямых из файла с калибровками  
для данной серии набора реагентов. Для этого открыть файл с калибровкой, скопировать  
содержимое голубого прямоугольника на листе Результаты и вставить, используя ре­
жим Специальная вставка, значения в голубой прямоугольник текущего файла.
4. Импортировать в шаблон рассчитанные значения пороговых циклов. Для этого нажать  
клавишу «Импорт данных», выбрать папку Рабочий стол МБТ Отчеты ^  Год ^  
Месяц — >  «название_файла.данные». Нажать «Открыть» и «Готово».
в D I
Тип ан ал и за:
Тест-система: 'А ш и н п уб - Р В ”
К аче ствен н о е и ко ли чествен н о е 
определение ДНК м икобактерий 
туберкулезного  ком плекса 
'170308 
А врам ен ко 
050503-17161907
Ж Е I J  К
Дата:
О ператор:
Ф а й л :
С ерия 050503
Импортданных
5. Сохранить отчет. Для этого нажать «Файл», затем «Сохранить как...». Выбрать Рабочий 
стол МБТ ->  Отчеты — >  Год - > •  Месяц. В поле «Имя файла» ввести название в форме  
«год.месяц.число. отчет». Нажать «Сохранить».
Для того чтобы распечатать отчет, необходим о перейти на лист с названием «Отчет», на­
жать «Файл», затем «Печать» и «ОК». Для полного отчета можно распечатать и лист «Ре­
зультаты»
4U 1/
41 18
42 19
43 20
44 21
А С г \г\
^  ►  ► ! 1 \  Hlgort \  Результаты 
j  р-тёт /
На листе «Отчет»:
в столбце «Название» отражены названия контрольных и исследуемых образцов ;  
в столбце «Наличие МБТ в образце» отражены результаты по обнаружению микобак­
терий туберкулезного комплекса в контрольных и исследуемых образцах;
53


--- стр. 55 ---
в столбце «Число копий М Б Т  в образце» отражены результаты количественного опре­
деления микобактерий туберкулезного комплекса в исходных образцах;  
в столбце «Вы во д ы » представлены результаты автоматического анализа контрольных и  
исследуемых образцов;
в столбце «Действие» представлены результаты автоматического анализа возможных  
действий.
Пример отчетного файла «Количество М Б Т  -  Тест»
M ic ro s o ft E x c e l -  К о л и ч е с т в о  М Б Т 1
^йл П р а в к а  В и д  В с т а в к а  Ф о р м а т  С е р в и с  ^нны е О к н о  С п р а в к а
Тест-система:
Тип анализа:
Дата:
Оператор:
Файл:
Обнаружение и определение количества  
микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ)
15 апреля 2008 г. Серия:
тест Калибровачный файл:
тест
тест
Комплект МБТ -К^ибровка 1
_6_
_7_
_8_
_9_
J 0
Л
J 2
J 3
Л
J 5
_ 1 б
_17
J 9
_ 2 0
Л
2А
_25
2S
Л .
Ж
Ж
J 0
Л
J 2
J 3
J 4
J 5
J 6
37
№ Н а з в а н и еН а л и ч и е  М Т Б  
в о б р а зц е
Ч и с л о  к о п и й  
М Б Т  в о б р а а ц еВ ы в о д Д е й с т в и е
J 8
осп
19
2 0  
2 1  
2 2
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
КОЗ
КОЗ
ПК02
око
ОКО-в
ОКО-В
1
2
3
ОКО-В
Выш е
В ы и е
1  
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0  
1 1  
1 2
13 +
14 +
15 В ы ш е *
16 Выш е +
17 ниже
18 ниже 
О К О - в  
О К О - в
ниже -  
ниже- 
ниже ниже 
ниже ниже
-•иало
--мало
--нет
--нет
Да
Да
Да
Нет 
Нет 
Нет 
Да, мало  
Нет 
Нет 
Нет 
Да, много  
Да, много  
Да 
Да 
Да 
Да 
Да, мало  
Да, мало  
Да, мало  
Нет 
Д а ? 
Д а ? 
Да, мало  
Да, мало  
Нет 
Нет 
???  
???  
???  
???  
???  
???
1 ,0 5 Е ^ З
8,97Е+02
9 ,93 Е^1
9,93Е*02
2,8бЕ+08 
3,07ЕЧ№  
3,43Е+04 
4,15 Е ^  
9.79Е+06 
1,01Е*07 
9 ,9 3 Е^ 2  
1^8Е^З  
1,4вЕ+01
1 ,4 8 Е^ 1
9,72Е+00
Р и )я ы ж1ы  1ю с ш м и ш  п о  к о з  д о е ю м р н ы  
Р м ] р1ы а г ы  п о с п и о ш м  п о  K O S  д о е ш м р и ы  
Г м у ^ ты п о с ш н о и а т о П К О а о с г о цт ы  
Р « в | л ь т1т ы  п о с п н о в т  п о  < Ж О а о с г о в » р1Ш1  
Р м у п ь ш ы  п о с т а м в к и  п о  О К О - В  д о с т о в е р н ы
Р м р т ь ш ы  п о с т а и о в ж м  п о  О К О - в  д о с т о в е р н ы
м етоО иарг*»*# «ол<мае!яю»«ждви^ г>«мгочаеаега 
«опиесш ннсго пэм ео»**
V C T  н е о О » « г ;« » ы
W 6 T  н е
иБТиео!> а(цж»Ъ1 
и ех с о ю р р я ы в. с а г т к т ж е м е в я а я ^ с т А т г е л р е я е г а
М Б Г в О в р у я п ы  ш г и « с л в о а ь ш е д о а у с л ш с г о ^ ф е а е л а  в п м е с л в е ж о г о  я а м е р » м
veT oO tepr/w iw  «агим еетвовэресею д апсаана 
nuMtw i i a
lu C T  о О н9я м ы . т п м е с т в о  е  ч р е д е т а !  в а ю з с »  к а м е р с н я е
МБТоаияари^  ttnM KTB08spejxraiA>aRO M H2 
•ц м акнп
W T  o & o p n o B H b L  с о п м е с л к  в  я р1Я е г а  д « а п о ж ^
М Б Т о № а р )я е «  w v « e c T B O i- w flo e № w o ro !p e « ra 
« о г и н е с т в е и н а г а  w w a a a »  ^ C T o < > ^ В Д 5 * н ы . m iw e C T W i- w c tfliyjc T M w tD a p e jH r a  ю г м и е с т в & м о г о  и э м с в с  w i м е т  о о > о р ) я » « >  ю г й « с т д о н к к д а г ^ с т м г о п » я 9 е а е г а  (o m u e c T K w o ro  У в м « д е н а  и с т и е о о в р ^ я е и ы
М В Т о а а р г .'ж м ь : а ы с о в м *  р к х  я х т а м м в ь ^
Ю Т  о О а р )я » « а1 в м с ю й  р и с х  « с н т а м х ж ц »
WSToovopiSRMv с № ш е с т э о 1 « а » д д я ;| с т у м о о я р е 1 ж г а  с о1» м е с т я е и н а г о  n * w e g e « e  № Т  о & о с у ж м . c o f M u e r r a o  И 1 ш е  д в в у с т м м п  c o n m e c iW M c r D  « э м е к и А  
VSX и (< Я т(> гял *>
м е т и е о б н а р у ж н !»
рв»?лт5гт
r ig i3 K it B e p 4 > r t  р е э у л ь т з т
- « а в с т в в е р н ы »  B W / JV T JT
н е я о с т о е в р « й Я  г ь т т т
► - а д о с т в в е » и в й  p e * f j* - W T
н е а о с т о в е м *  9 е г / № т 9 г т
А к та  а а в е р а е н  
Д н1л м  la e e p a t H  
Д м ш в в  м в е р а е н
заеер !»* с  •«аосгтоверндй о)птестд»*40« ou^Mcof 
А г в ш а а в е р с е н  
^ о г м  » в е р1ы » <
A w ju s saec(«u»<
а в е р о в ч  д г а  д о Е1ш е $ и ж о  ю г я с с т в е м о г о  o iD e a u « » M  > « о О д | ) ш м1«  в в з о а в и т »  о о о м с ы  Л ч а г е а я 1 а » « к д | я д о с т з в в и » р ш г м и о с т ;ж 1 о г о  v v e o u » w  « е о в щ о м ю  с а г в а в п ъ  o O o a s e u  JM C  
/ ^ а л м  » в е р и » «
л « п 1 » « х е р к » <
А « г м  t a e e p e j e i ^
> M a m s  1 9 с с $ а и е н
У а л г а » с > « д > г г о а е р н а >  с о г и м е с т п о ю *  с ц в  н о »
а ж е р №  с  н е я о с т е е о к й  ю п м е с т е о м #  с ц м о й
А и а г а ч з а в е с ь е » *  с  н е д о с т о в е р н о й  « о т е с т а е » « Я о ц е и в #
A « m » s s e p u » '
Р е в > и » « ? ^ е т с « я о е г т о р « п ы ю с л * я о в » « е
Р м о « « с / е т с1 « в т о р и т ь  я о с л е д о в м е
^ о г м  а ж е 9 1 : в и  с  и е д о с т о м р н о й  c o n m e c T ie * < o «  о ц е м о «
^ w v *  з ж е р ш »  с  м е а о с т о в е $ н о й  m n m e c T B » * o «  о ц » « а й
^ а л к а  ««№№»■
А в г м а а е е р ш »  
п о е т о р и т ь  « с с г « д о в » п е  ш д е г с м е  н е  » ф ф е к г л » «  
П о к о р и т ь  и о с р е я о в » « в  а и а е1» и е и е э ф ф е с п » о  
п с в т о р э т ь я о е г в д !» * » . i ) » f M e i^ e wi e  г х р  
П с е г т а р т . ж ж я е д е в » * *  * * ц е и т ю 8 а  н е  1Х р  
П с в т о р > г т ы е с 1 « а о с » « «  » п « и р я » « « п р
П о е г т о р и т ь  л ( Х 1 Ж С О В » < « ,  м и О ф о в » * *  rv p
54