Набор реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus - hMpv), вирусов парагриппа 1,2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus - 1-4 - hPiv), коронавирусов (human Coronavirus - hCov), риновирусов (human Rhinovirus - hRv), ДНК аденовирусов групп В, С и Е (human Adenovirus В, С, Е - hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL" по ТУ 9398-155-01897593-2010 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2011/11258 от 22.07.2011 · класс риска 3

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Вид изделия: Множественные вирусы связанные с респираторными заболеваниями нуклеиновые кислоты ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 87 контрактов, медианная цена за единицу 68 522 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
•  У Т В Е Р Ж Д Е Н А
П риказом  Р о сзд р а вн а д зо р а  
от №
У Т В Е Р Ж Д А Ю
Д иректор Ф е д ер ал ьн о го  госу­
д ар ствен н о го  учр еж д ен и я н ау­
ки « Ц е н тр а л ьн ы й  научно- 
и ссл е д о ва те л ьски й  институт 
эп и д ем и ологи и» Ф ед ер ал ьн о й  
.сл уж б ы  по над зору в сф е р е  
'^■защиты п р ав п отр еби телей  и 
б л a г 9 f ll9 л y ч и я J^ л o в e к a
П окровский 
2011 г.«
И Н С Т Р У К Ц И Я
п о  п р и м е н е н и ю  н а б о р а  р е а г е н т о в 
д л я  в ы я в л е н и я  в о з б у д и т е л е й  о с т р ы х  р е с п и р а т о р н ы х 
в и р у с н ы х  и н ф е к ц и й  ч е л о в е к а  (О Р В И ): Р Н К  р е с п и р а т о р н о ­
с и н ц и т и а л ь н о г о  в и р у с а  ( h u m a n  R e s p i r a t o r y  S y n c y t i a l  v i r u s  - 
h R S v ) , м е т а п н е в м о в и р у с а  ( h u m a n  M e t a p n e u m o v i r u s  -  h M p v ) , 
в и р у с о в  п а р а г р и п п а  1, 2 , 3  и 4  т и п о в  ( h u m a n  P a r a i n f l u e n z a  v i r u s - 
1 -4  -  h P i v ) , к о р о н а в и р у с о в  ( h u m a n  C o r o n a v i r u s  -  h C o v ) , 
р и н о в и р у с о в  ( h u m a n  R h i n o v i r u s  -  h R v ) , Д Н К  а д е н о в и р у с о в  гр у п п 
В, С  и E  ( h u m a n  A d e n o v i r u s В, С , Е  -  h A d v ) и б о к а в и р у с а  ( h u m a n 
B o c a v i r u s  -  h B o v ) в к л и н и ч е с к о м  м а т е р и а л е  м е т о д о м 
п о л и м е р а з н о й  ц е п н о й  р е а к ц и и  ( П Ц Р )  с г и б р и д и з а ц и о н н о -
ф л у о р е с ц е н т н о й  д е т е к ц и е й
« А м п л и С е н с ®  О Р В И - с к р и н - F L »


--- стр. 2 ---
Ф  СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................. 3
НАЗНАЧЕНИЕ................................................................................................................................. 3
ПРИНЦИП МЕТОДА...................................................................................................................... 3
ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
.................................................. 4
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ....................................................................................5
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.................................................................................................6
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ................................................... 7
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.... 8
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ ДНК/РНК...................10
ВАРИАНТ FR T..............................................................................................................................11
СОСТАВ..........................................................................................................................................11
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................................13
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК/РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ И ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ Р Н К ........................................................................................ 13
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ»....................................................................................................................................13
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................... 16
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.......................19
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК/РНК ИЗ ПРОБ.......................................................................................... 20
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 ......................................................................................................................... 26
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ................................................. 26
У


--- стр. 3 ---
с п и с о к  СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ОРВИ - Острые респираторные вирусные инфекции
ПЦР - Полимеразная цепная реакция
FRT - Флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
РНК - Рибонуклеиновая кислота
ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - Комплементарная ДНК получаемая в реакции обратной  
транскрипции на матрице РНК ____________________________
ПКО - Положительный контрольный образец
ВКО STI-rec - Внутренний контрольный образец для наборов  
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
ОКО - Отрицательный контрольный образец
ОК - Отрицательный контроль экстракции ДНК/РНК
К- - Отрицательный контроль ПЦР
К+ - Положительный контроль ПЦР
ВК+ - Положительный контроль амплификации образца ВКО STI-  
rec
ФГУН ЦНИИЭ Рос­
потребнадзора
- федеральное государственное учреждение науки «Цен­
тральный научно-исследовательский институт эпидемиоло­
гии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав  
потребителей и  благополучия человека___________________
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL» предназначен для выявления и  
идентификации специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей ост­
рых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ); РНК респираторно­
синцитиального вируса (h u m a n  R e s p ir a to r y  S y n c y tia l viru s -  h R S v ), метапневмовируса  
(h u m a n  M e ta p n e u m o v ir u s -  hM pv),  вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (h u m a n 
P a ra in flu en za  virus-^-Л -  h P iv), коронавирусов видов OC43, E229, NL63, HKUl (h u m a n 
C o ro n a viru s -  h C o v ), ри нов и русо в  (h u m a n  R h in o v iru s -  h R v ), ДНК аденовирусов групп  
В, С и Е (h u m a n  A d e n o v ir u s  -  h A d v ) и бокавируса (h u m a n  B o c a v ir u s  -  h B o v ) в  клини­
ческом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией  
продуктов амплификации.
Материалом для проведения ПЦР служат пробы кДНК, полученные из следующе­
го кпинического материала; мазков из полости носа и  ротоглотки, мокроты (либо ас-  
пиратов из трахеи), бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), промывных вод бронхов,  
секционного материала. Для экстракции ДНК/РНК и  получения кДНК используются  
наборы реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Полный анализ включает следующие этапы; экстракция (выделение) ДНК/РНК из  
образцов клинического материала, обратная транскрипция РНК, ПЦР-амплификация
3


--- стр. 4 ---
участков геномов микроорганизмов и гибридизационно-флуоресцентная детекция  
флуоресцентного сигнала, которая производится непосредственно в  ходе ПЦР. Экс­
тракция ДНК/РНК микроорганизмов из клинического материала проводится в  присут­
ствии внутреннего контрольного образца (ВКО STI-rec), использование которого по­
зволяет контролировать качество выполнения процедур исследования для каждого  
образца.
ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ  
Набор реагентов выпускается в 1  варианте.
Вариант FRT
Набор реагентов выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1  включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT (пробирки
0,2 мл в соответствии с типом амплификатора).
Форма 2 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F.
Формы комплектации 1  и  2 предназначены для проведения амплификации кДНК с гиб- 
ридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для про­
ведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов  
для выделения ДНК/РНК и получения кДНК, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Рос­
потребнадзора.


--- стр. 5 ---
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность
(при исследовании мазков из полости носа и ротоглотки)
Возбудитель Комплект для вы­
деления ДНК/РНК
Комплект для 
амплификации и 
детекции
Аналитическая чувст­
вительность, ГЭ/мл ^
Респираторно­
синцитиальный
вирус
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT 1x10^
Метапневмови­
рус человека
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT 1 x 1 0 -=
Вирусы пара­
гриппа тип 1-4
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT 1x10^
Коронавирусы
человека
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT 1x10'
Бокавирус чело­
века
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT 1x10^
Аденовирусы
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект» 
вариант FRT 5x10^
Риновирусы
РИБО-сорб,
РИБО-преп,
«NucliSENS
easyMAG»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT 1x10^
Аналитическая специфичность
Набор реагентов позволяет обнаружить фрагменты кДНК/ДНК заявленных возбу­
дителей ОРВИ. Специфическая активность набора реагентов доказана при исследо­
вании следующих референсных штаммов: респираторно-синцитиальный вирус че­
ловека «Лонг» тип А, риновирусы человека (типы 13, 15, 16, 17, 21, 26 и 29), а также  
при исследовании клинического материала с последующим подтверждением мето­
дом секвенирования фрагментов амплификации: респираторно-синцитиальных ви­
русов типы А и  В, вирусов парагриппа (типы 1-4), коронавирусов человека ОС43,  
Е229, NL63, HKUI, аденовирусов человека групп В, С и  Е; метапневмовирусов чело­
века (типы А и В), бокавируса человека. В реакции на наличие РНК риновирусов  
возможно выявление близкородственных вариантов знтеровирусов. Реакция по об-
^  Чувствительность выражается в геномных эквивалентах (ГЭ) возбудителя в 1  мл пробы.
5
У


--- стр. 6 ---
наружению аденовирусов не предназначена для типирования (возможно взаимодей­
ствие с близкородственными вариантами других типов аденовирусов).
Показано отсутствие неспецифических реакций компонентов набора в отношении  
кДНК/ДНК других вирусных (вирусы гриппа А и В, коронавирус вызывающий ТОРС  
(Frankfurt), коронавирусы вызывающие инфекционный перитонит кошек (F1, F2, F5) и  
гастроэнтерит свиней (ТГС1, ТГС8, ТГС 9), вирусы герпеса, цитомегаловирус,  
энтеровирусы (типы Echo9, Echo30) и  60 образцов спинномозговой жидкости  
больных менингитом, содержащих РНК энтеровирусов) и бактериальных  
возбудителей ОРЗ ( S tr e p to c o c c u s spp.. S ta p h y lo c o c c u s  a u r e u s, M y c o p la sm a 
p n e u m o n ia e , C h la m y d o p h lla  p n e u m o n ia , H a e m o p h ilu s  in flu e n z a e , M oraxella catarrhalis, 
L eg io n ella  p n e u m o p h ila ), нормальной микрофлоры полости носа и ротоглотки  
человека и  кДНК/ДНК человека.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-  
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудите­
лей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП  
1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III -  IV групп патогенности  
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728-99 «Правила  
сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и ме­
тодических указаний МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использую­
щих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содер­
жащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, ор­
ганизовывать работу и хранение в  соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопас­
ность работы с микроорганизмами III -  IV групп патогенности (опасности) и  воз­
будителями паразитарных болезней».
- Убирать и  дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя де­
зинфицирующие средства в  соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность ра­
боты с микроорганизмами III -  IV групп патогенности (опасности) и  возбудите­
лями паразитарных болезней».
- Удалять неиспользованные реактивы в  соответствии с требованиями СП  
2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно­
профилактических учреждений».
6


--- стр. 22 ---
Э К С Т Р А К Ц И Я  Д Н К/РН К
13 тыс об/мин.
7. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя ваку­
умный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.
8. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть  
крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно  
провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо на­
крыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и 
переворачивать штатив.
9. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифу­
ге.
10. Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя 
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
11. Добавить в  пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть  
крышки и  осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
12. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифу­
ге.
13.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя 
вакуумный отсасыватель и  отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
14. Поместить пробирки в термостат с температурой 65 на 5 мин для подсушива­
ния осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
15. Добавить в  пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Помес­
тить в  термостат с температурой 65 ® С  на 5 мин, периодически встряхивая на 
вортексе.
16. Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1  мин на микро­
центрифуге.
17.Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК и ДНК. Рекомендуется прово­
дить реакцию обратной транскрипции сразу по окончании экстракции.
Очищенные РНК можно хранить до 4 ч при температуре от 2 до 8 X , в  течение  
месяца -  при температуре не выше минус 16 °С, более длительно -  при темпера­
туре не выше минус 68 °С.
В. При использовании автоматической станции «NucliSENS easyMAG»
Вариант 1. Экстракция РНК с лизисом образца вне прибора
Данный метод экстракции позволяет снизить расход буфера для лизиса NucliSens и
предпочтительнее при работе с образцами клинического материала, содержащего
сгустки (мокрота, аспираты).
22


--- стр. 23 ---
Э К С Т Р А К Ц И Я  Д Н К/РН К
Порядок работы
1. Включить прибор NucIiSENS easyMAG и подготовить его к экстракции ДНК/РНК,  
следуя инструкции к прибору.
2. В  окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие 
параметры: название образца, материал {Matrix) для экстракции ДНК/РНК (уста­
новить Other), объем образца {Volume) -  0,1 ml, объем элюции {Eluate) - 25 mkl, 
тип образца (Туре) -  Lysed, очередность экстракции РНК в  образцах (priority) - 
normal.
3. Создать новый протокол экстракции ДНК/РНК и  сохранить его. В протоколе ука­
зать, что лизис и инкубация образцов происходит вне прибора: On-board Lysis 
Buffer Dispensing-no, On-board Lysis Incubation-no,
4. Перенести таблицу образцов в  созданный протокол.
5. Отобрать необходимое количество специализированных одноразовых пробирок, 
предназначенных для экстракции ДНК/РНК в  приборе NucIiSENS easyMAG,  
(включая отрицательный контроль экстракции). Внести в каждую пробирку на  
внутренние стенки по 10 мкл ВКО STI-rec. Добавить в пробирки по 550 мкл бу­
фера для лизиса NucliSens.
ВНИМАНИЕ! При работе с материалом, содержащем сгустки, лизис рекоменду­
ется проводить в пробирках объёмом 1,5 мл. После окончания инкубации (см. п.
8) следует провести центрифугирование пробирок при 10 тыс об/мин в  течение 1 
мин на микроцентрифуге и перенести надосадочную жидкость в специализиро­
ванные пробирки, предназначенные для экстракции ДНК/РНК в  приборе  
NucIiSENS easyMAG.
6. В  пробирки с раствором для лизиса и  ВКО STI-rec, внести по 100 мкл подго­
товленных проб, используя наконечники с фильтром и тщательно перемешать  
пипетированием. (Следует избегать попадания в  пробирку сгустков слизи и  круп­
ных частиц.)
7. В пробирку ОК внести 100 мкл ОКО.
8. Инкубировать пробирки в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Ресуспендировать пробирку с магнитной силикой NucliSens, интенсивно пере­
мешав на вортексе. Внести в  каждую пробирку отдельным наконечником с  
фильтром по 25 мкл магнитной силики и тщательно перемешать пипетировани­
ем. Магнитная силика должна быть равномерно распределена по всему объему  
пробирки.
10.Загрузить пробирки с образцами в  прибор, установить наконечники, запустить
23
/


--- стр. 24 ---
Э К С Т Р А К Ц И Я  Д Н К/РН К
программу экстракции ДНК/РНК с лизисом образцов вне прибора { O f f board).
11.После окончания экстракции ДНК/РНК, извлечь пробирки из прибора. Надосадоч- 
ная жидкость содержит очищенные РНК и  ДНК. Рекомендуется проводить реак­
цию обратной транскрипции сразу по окончании экстракции.
При необходимости хранения очищенные РНК следует перенести в  стерильные 
пробирки не позднее 30 мин после экстракции. Очищенные РНК можно хранить до 
4 ч при температуре от 2 до 8 °С, в  течение месяца -  при температуре не выше  
минус 16 °С, более длительно ~ при температуре не выше минус 68 °С.
Вариант 2. Экстракция РНК с лизисом образца в приборе
Порядок работы
1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК, сле­
дуя инструкции к прибору.
2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие 
параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции ДНК/РНК (уста­
новить Other), объем образца (Volume) -  0.1 ml, объем элюции (Eluate) -  25 mkl, 
тип образца (Туре) -  Primary, очередность экстракции РНК в  образцах (Priority) - 
normal.
3. Создать новый протокол экстракции ДНК/РНК и сохранить его. В  протоколе ука­
зать, что лизис и инкубация образцов происходит в  приборе: On-board Lysis Buffer 
Dispensing-Ves, On-board Lysis incubation-Ves.
4. Перенести таблицу образцов в созданный протокол.
5. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок, предназначенных для 
экстракции ДНК/РНК в  приборе NucliSENS easyMAG, (включая OK). Внести в  каж­
дую пробирку на внутренние стенки по 10 мкл ВКО STI-rec.
6. В пробирки с ВКО внести по 100 мкл подготовленных проб, используя наконеч­
ники с фильтром. (Следует избегать попадания в пробирку сгустков слизи и  круп­
ных частиц).
7. В пробирку ОК внести 100 мкл ОКО.
8. Загрузить пробирки с образцами в прибор, установить наконечники, запустить  
программу экстракции РНК с лизисом образцов в приборе (on board).
9. Дождаться, пока автоматическая станция NucliSENS easyMAG не остановит ра­
боту в положении Instrument State-Idle.
Ю.Ресуспендировать пробирку с магнитной силикой NucliSens, интенсивно пере­
мешав на вортексе. Открыть крышку прибора, в  каждую пробирку внести отдель­
ным наконечником с фильтром по 25 мкл магнитной силики и тщательно пере-
24


--- стр. 25 ---
Э К С Т Р А К Ц И Я  Д Н К/РН К
мешать пипетированием. Магнитная силика должна быть равномерно распреде­
лена по всему объему пробирки.
11.Закрыть крышку прибора и  продолжить программу экстракции РНК.
12.После окончания экстракции ДНК/РНК, извлечь пробирки из прибора. Надосадоч- 
ная жидкость содержит очищенные РНК и  ДНК. Рекомендуется проводить реак­
цию обратной транскрипции сразу по окончании экстракции.
При необходимости хранения очищенные РНК следует перенести в  стерильные 
пробирки не позднее 30 мин после экстракции. Очищенные РНК можно хранить  
до 4 ч при температуре от 2 до 8 “С, в  течение месяца -  при температуре не вы­
ше минус 16 °С, более длительно -  при температуре не выше минус 68 °С.
25
\


--- стр. 26 ---
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ  
(проводится в ЗОНЕ 2 -  помещении для проведения амплификации)
ВНИМАНИЕ! Объемы реакционной смеси и РНК отличаются от описанных в
стандартной инструкции комплекта реагентов для проведения реакции обратной
транскрипции -  «РЕВЕРТА-L» с реагентом RT-G-mix-1 (ТУ 9398-005-01897593-2008)
-  вариант 100 или вариант 50.
Общий объем реакции -  40 мкл, объем РНК-пробы -  20 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые пла­
стиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», 
«DNase-free».
1. Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 (0,5) мл.
2. Приготовить реакционную смесь на 6 реакций. Для этого в  пробирку с RT-mix вне­
сти 5 мкл RT-G-mix-1 и тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с  
крышки пробирки.
3. К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMIv), пипетировать 5 раз, пе­
ремешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки кратковременным центри­
фугированием.
4. Внести в  микропробирки по 20 мкл готовой реакционной смеси.
5. Используя наконечник с фильтром, добавить 20 мкл РНК-пробы в  пробирку с ре­
акционной смесью. Осторожно перемешать пипетированием.
6. Поставить пробирки в  амплификатор (термостат) при температуре 37 °С на  
30 мин.
7. Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки 
ПЦР развести в  2 раза ДНК-буфером (к 40 мкл кДНК отдельным наконечником с  
фильтром добавить 40 мкл ДНК-буфера, перемешать на вортексе и процентрифу- 
гировать в течение 5 с на вортексе для удаления капель с внутренней поверхности 
крышки пробирки).
Готовый препарат кДНК можно хранить при температуре не выше минус 16 '’С  
в течение 1  нед или при температуре не выше минус 68 в течение года.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2


--- стр. 27 ---
Расчетная таблица приготовления реакционных смесей для проведения ам­
плификации для комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Объем реагента 
на одну реакцию 
(мкл)
Объем реактивов на указанное количество реакций
10.00 5.00 0.50
Число реакций® ПЦР-смесь-1-FL,
мкп
ПЦР-смесЬ"2" 
FRT, мкл
Полимераза 
(TaqF), м кл
6 60 30 3.0
8 80 40 4.0
10 100 50 5.0
12 120 60 6.0
14 140 70 7.0
16 160 80 8.0
18 180 90 9.0
20 200 100 10.0
22 220 110 11.0
24 240 120 12.0
26 260 130 13.0
28 280 140 14.0
30 300 150 15.0
32 320 160 16.0
Число исследуемых образцов, включая контроль этапа экстракции ДНК (N), контрол и этапа ПЦР, с запасом на 
один образец (N+3+1).
27