Набор реагентов для выявления и дифференциации РНК вируса денге (Dengue virus, DV) 1-4 типов в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® Dengue virus type-FL" по ТУ9398-219-01897593-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
от № ______
УТВЕРЖДАЮ
Директор Федерального
бюджетного учреждения науки
«Центральный научно-
исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной
службы по надзору в сфере
потребителей и
ел о 8 е ка
ШЖШкаШ*Г 2012 г.
" V .'V - V
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для выявления и диф ф еренциации Р Н К вируса денге
{D engue virus, D V ) 1-4 типов в биологическом материале
методом полимеразной цепной реакции (П Ц Р ) с
гибридизационно-ф луоресцентной детекцией
«АмплиСенс® Dengue virus type-FL»
АмплиСенс
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD
--- стр. 2 ---
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ........................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА...............................................................................................3
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ .........................................4
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ................................................................... 5
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ..............................................................................5
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ......................................... 7
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА. .. 8
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК .......................8
ФОРМАТ FRT....................................................................................................... 10
СОСТАВ...........................................................................................................10
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ .............................................................. 1 1
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ..........................................12
ПРОВЕДЕНИЕ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ РНК И АМПЛИФИКАЦИИ кДНК С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» .........................................12
А. Подготовка пробирок для амплификации ...................................................12
Б. Проведение обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с детекцией
в режиме «реального времени».................................................................... 13
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ..................................................14
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ..................17
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Экстракция РНК из плазмы и сыворотки крови, гомогенатов тканей
мозга и внутренних органов, комаров с применением комплекта реагентов «РИБО-
преп».................................................................................................................. “ IS
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ...................................20
Г
--- стр. 3 ---
список СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
В КО
В-
К-
К +
кДНК
НК
ОКО
ПЦР
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
DV
FRT
- Внутренний контрольный образец
- Отрицательный контроль экстракции
- Отрицательный контроль ПЦР
- Положительный контроль ПЦР
- Комплементарная ДНК, получаемая в реакции обратной
транскрипции на матрице РНК
___________
- Нуклеиновые кислоты (РНК/ДНК)
- Отрицательный контрольный образец
- Полимеразная цепная реакция
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека _________
-D e n g u e virus, вирус денге
- Флуоресцентная детекция в режиме «реального време и и» _
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® D e n g u e v ir u s type-FL» предназначен для
выявления и дифференциации РНК вируса денге 1-4 типов в клиническом (плазма и
сыворотка крови) и аутопсийном материалах от людей (ткани мозга, печени,
селезенки), материале от животных (ткани мозга, селезенка), в комарах методом
ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной
диагностике заболевания\
ПРИНЦИП МЕТОДА
Выявление РНК D V методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя два этапа; экстракцию
РНК из образцов биологического материала, проведение обратной транскрипции РНК
и амплификации участка кДНК D V с гибридизационно-флуоресцентной д ет екц и еи
которая производится непосредственно в ходе ПЦР (формат FRT). Экстракция РНК из
биологического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного
образца (ВКО STI-87-гес), который позволяет контролировать выполнение процедуры
исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами проводятся
обратная транскрипция РНК с помощью фермента ТМ-ревертазы и амплификация
участков кДНК D V 1-4 типов при помощи специфичных к данным участкам кДНК
праймеров и фермента Тар-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют
’ В соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.
--- стр. 4 ---
флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с
комплементарными участками амплифицируемых кДНК-мишеней, в результате чего
происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет
регистрировать накопление специфических продуктов амплификации путем
измерения интенсивности флуоресцентных сигналов. Детекция флуоресцентных
сигналов при использовании формата FRT осуществляется непосредственно в ходе
ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигне^ла ь
режиме «реального времени».
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов выпускается в 1 формате.
Формат FRT
Набор реагентов выпускается в 4 формах комплектации:
Форма 1 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F.
Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50, «ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F.
Форма 3 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000, «ПЦР-
комплект» вариант FRT-50 F - 2 штуки.
Форма 4 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения обратной транскрипции
РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
«реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо
использовать комплекты реагентов для экстракции РНК, рекомендованные ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в зависимости от вида исследуемого
материала.
Формы комплектации 2 и 3 предназначены для проведения полного ПЦР
исследования, включающего экстракцию РНК из биологического материала
обратную транскрипцию РНК и амплификацию кДНК с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 4 предназначена для производственных целой для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 4 используется только в соответствии с
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
--- стр. 5 ---
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность
Вид
б и о л о ги ч е
ского
м атер и ал а
Плазма /
сыворотка
крови,
суспензия
комаров
Плазма
крови,
сыворотка
крови
О б ъ е м
и с с л е д у е -
I м о й
п р о б ы
100 мкл
1 мл
К о м п л е к т
д л я
э к с тр а к ц и и
Р Н К
«РИБО-
преп»
« М А Г Н О -
с о р б »
К о м п л е к т
д л я
а м п л и ф и к а
ции и
д е те к ц и и_ _
«ПЦР-
комллект»
вариант
FRT-50 F
«ПЦР-
комллект»
вариант
FRT-50 F
А н а л и т и
ч е с ка я ч у в
с т в и т е л ь
н о с ть ,
к о п и й /м л
5x10^
Тип
в и р уса
денге
1-4 тип
1-4 тип
Пробоподго-
товка
материала
Данная чувстви
тельность
достигается при
соблюдении
нижеизло
женных правил
пробопод-
готовки
биоматериала и
рекомендуемом
исследуемом
объеме пробы
Аналитическая специфичность
Аналитическая специфичность изучена на;
- флавивирусах (вирус клещевого энцефалита, Японского энцефалита, Омской
геморрагической лихорадки);
- риккетсиях группы пятнистых лихорадок { R ic k e ttsia conorii ssp. c a s p i a ,
R. h e jlo n jia n g e n sis);
- Coxiella burnetii:
- B artonell q u in ta n s',
- хантавирусах; Пуумала, Добрава;
- L ep to sp ira in te rro g a n s, L .kirshneri, L .b o rg p e te rse n ii.
При работе с РНК/ДНК вышеперечисленных микроорганизмов, а также с ДНК
человека, ДНК комаров, ДНК грызунов не выявлено ложноположительных
результатов.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с
медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нукпеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
--- стр. 6 ---
При работе всегда следует выполнять следующие требования;
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,
организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3 2322 08
«Безопасность работы с микроорганизмами 1II-IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя
дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность
работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
- Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также
использованные реактивы следует удалять в соответствии с требованиями
СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к
обращению с медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимою
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
- Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром. Одноразовую пластиковую посуду
необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий
дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для
обеззараживания медицинских отходов.
- Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка
ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать
ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.
- Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
- Допускать к работе с набором только специально обученный персонал
- Не использовать набор по истечении срока годности.
- Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во
Время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании
--- стр. 7 ---
работы.
- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте
немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской
помощью.
- Листы безопасности материалов (MSDS - material safety data sheet) доступны по
запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1 . 0,15 М NaCI или фосфатный буферный раствор (PBS) (натрия хлорид, 137 мМ
калия хлорид, 2,7 мМ; натрия монофосфат, 10 мМ; калия дифосфат, 2 мМ
рН=7,5±0,2).
2. Гомогенизатор TissueLyser LT (QIAGEN, Германия) рекомендуется использовать
для гомогенизации аутопсийного материала и комаров.
3. Металлические шарики из нержавеющей стали диаметром 5 мм и 7 мм,
4. Комплекты реагентов для выделения РНК/ДНК (в зависимости от типа
исследуемого биоматериала) - «РИБО-преп» (ТУ 9398-071-01897593-2008) или
«МАГНО-сорб» (ТУ 9398-106-01897593-12) или другие рекомендованные ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора - при работе с формой комплектации 1
5 . Дополнительные материалы и оборудование для экстракции РНК/ДНК - согласно
инструкции к комплекту реагентов для выделения РНК/ДНК.
6. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-«Ламинар -С )
«Ламинарные системы», Россия).
7. Центрифуга/вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
8. Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 mkj:
(например, «Ленпипет», Россия),
9. Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл и до 200 мкл в штативах
(например, Ахудеп, США).
10.Штативы для пробирок объемом 0,2 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия)
11. Одноразовые пролипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл.
12. Штативы для наконечников и пробирок объемом 1,5 мл.
13. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 X для
выделенных проб РНК.
14.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
15. Емкость для сброса наконечников.
--- стр. 8 ---
г
16. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного си 1налс.
в режиме «реального времени» (например, Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett
Research, Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), CFX96 (Bio-Rad, США) и
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в
методических рекомендациях по применению данного набора реагентов)
17. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл:
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой или iinocKoii
оптически прозрачной крышкой - при использовании прибора планшетного
типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крыш ]<ой
(например, Ахудеп, США) - при использовании прибора роторного типа.
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями
«Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-
диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2010 г .
Материалом для исследования служат: плазма крови, сыворотка крови,
аутопсийный материал (ткани мозга, внутренних органов), комары.
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК
Плазма крови, сыворотка крови
Взятие цельной периферической крови проводится утром натощак в пробирку с
6% раствором ЭДТА из расчета 1:20. Закрытую пробирку с цельной периферическог,
кровью несколько раз переворачивают. Для отбора плазмы пробирку с кровью
центрифугируют в течение 20 мин при 1600 д.
Для получения сыворотки крови взятие цельной периферической крови проводится
утром натощак в сухую пробирку. Для формирования сгустка кровь отстаивают 30 мин
при 37 °С, после чего пробирку центрифугируют в течение 20 мин при 1600 g Для
исследования отбирают 100 мкл клинического материала при экстракции РНК с
использованием комплекта «РИБО-преп» или 1 мл клинического материала при
экстракции РНК с использованием комплекта «МАГНО-сорб».
Аутопсийный материал (ткани мозга и внутренних органов)
Данный материал гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых
ступок и пестиков, затем готовят 10 % суспензию на стерильном физиологической!
растворе или фосфатном буфере. При наличии автоматического гомогенизатора
TissueLyser LT применяют следующие параметры для гомогенизации тканей
--- стр. 9 ---
внутренних органов: объем PBS-буфера или 0,15 М раствора NaCI
гомогенизации определяется объемом гомогенизируемой ткани - соотношение
ткань-буфер определяется как 1:9, то есть готовится 10 % суспензия. Общий объем
пробы для пробирок объемом 1,5 мл не должен превышать 1 мл. Условия
гомогенизации для тканей мозга; диаметр шариков - 5 мм; частота - 50 Гц/с; время
гомогенизации - 2-3 минуты; для тканей печени, селезенки; диаметр шариков - 7 мм;
частота - 50 Гц/с; время гомогенизации - 10 мин. Для экстракции РНК берут 30 м к л
суспензии.
Комары
Для приготовления суспензий комаров используют стерильную фарфорсоую
чашку и стерильный пестик. При наличии автоматического гомогенизатора
TissueLyser LT применяют следующие параметры для гомогенизации комаров
(диаметр шариков - 5 мм; частота - 50 Гц/с; время гомогенизации 5 мин объе^;
буфера - 1000 мкл (пул из 25 комаров). Предварительно формируют пулы комаров
(не более 25 особей комаров рода A e d e s ). Комаров гомогенизируют в стерильном
физиологическом растворе или фосфатном буфере из расчета 1 комар - 4 0 м к л
раствора. Центрифугируют пробы при 10 О О О g в течение 1 мин. Затем отбирают
100 мкл надосадочной жидкости для экстракции РНК.
Допускается хранение вышеперечисленного биологического материала д(;
проведения исследования в течение 1 сут при температуре от 2 до 8 “С или 1 нед -
при температуре не выше минус 16 “С. Для аутопсийного материала и комаров
предусмотрены следующие режимы хранения; ткани внутренних органов и KOMapot;
хранят 1 нед при температуре не выше минус 16 °С, длительно - при температуре
минус 68 °С,
--- стр. 10 ---
ФОРМАТ FRT
ФОРМАТ FRT
СОСТАВ
Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 - комплект реагентов для
Р е а к т и в О п и с а н и е О б ъ е м , м л К ол-во
Раствор для лизиса Прозрачная жидкость
голубого цвета^ 15 1 флакон
Раствор для преципитации Прозрачная бесцветная
жидкость 20 1 1 флакОг!
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная
жидкость 25 1 флакон
Раствор для отмывки 4 Прозрачная бесцветная
жидкость 10 1 флако.м
РНК-буфер Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 4 пробирки
контроли. Входит в состав формы комплектации 2.
Комплект реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000 - комплект реагентов для
выделения РНК/ДНК из клинического материала - включает:
Р е а к т и в О п и с а н и е О б ъ е м , м л К ол-во
Лизирующий раствор
МАГНО-сорб
Прозрачная бесцветная
жидкость^ 70 А флакона
Компонент А Прозрачная бесцветная
жидкость 0,6 4 пробирки
Раствор для отмывки 5 Прозрачная бесцветная
жидкость^ 60 4 флакона
Раствор для отмывки 6 Прозрачная бесцветная
жидкость 20 4 флакона
Раствор для отмывки 7 Прозрачная бесцветная
жидкость 6,0 4 флакона
Магнетизированная силика Суспензия черного цвета 0,9 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 12 пробирок
контроли. Объем исследуемого материала 1000 мкл. Входит в состав формы
комплектации 3.
^ при хранении раствора для лизиса при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в
виде кристаллов. ВНИМАНИЕ! Раствор для лизиса из данного набора реагентов имеет неприятныи
запах. Работу проводить в ламинарном боксе.
^ При хранении лизирующего раствора МАГНО-сорб и раствора для отмывки 5 при температуре Н '/1же
20 °С возможно образование осадка в виде кристаллов.
К)