Набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита D (HDV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® HDV-FL" по ТУ 9398-178-01897593-2012 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2011/12382 от 25.11.2011 · класс риска 3

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Вид изделия: Вирус гепатита D нуклеиновая кислота ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 72 контракта, медианная цена за единицу 17 278 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 3 ---
с п и с о к  С О КР А Щ Е Н И Й
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения;
ВКО -  внутренний контрольный образец
К+ -  положительный контроль ПЦР
К - -  отрицательный контроль ПЦР
ОКО -  отрицательный контрольный образец
ОК -  отрицательный контроль экстракции
ОТ -  обратная транскрипция
ПКО -  положительный контрольный образец
ПК -  положительный контроль экстракции
ПЦР -  полимеразная цепная реакция
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
-  Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный  
научно-исследовательский институт эпидемиологии»  
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав  
потребителей и благополучия человека______________________
FEP -  флуоресцентная детекция по «конечной точке»
FRT -  флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
HBV - вирус гепатита В
HCV - вирус гепатита С
HDV - вирус гепатита D («Дельта»)
HGV - вирус гепатита G
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «А мплиС енс® H D V-FL» предназначен для выявления РНК  
вируса гепатита D (HDV)  в клиническом материале методом полимеразной цепной  
реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Материалом для  
проведения ПЦР служат пробы РНК, выделенные из плазмы крови.
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной  
диагностике заболевания^
ПРИНЦИП М Е ТО Д А
Принцип тестирования основывается на экстракции РНК из плазмы крови  
совместно с ВКО, проведении реакции обратной транскрипции РНК и амплификации  
кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (формат  
FEP) или в режиме «реального времени» (формат FRT). По каналу,  
соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ВКО.  
По каналу, соответствующему флуорофору JOE, детектируется продукт  
амплификации кДНК HDV.  Положительный контрольный образец этапа экстракции  
ПКО HDV-rec детектируется по каналам, соответствующим флуорофорам FAM (ВКО)  
и JOE {HDV). Контрольный образец амплификации -  ПКО кДНК HDV-FL -  является  
комплексным для HDV  и ВКО и аналогично детектируется по каналам,
’ В соответствии с директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.


--- стр. 4 ---
ФОРМАТЫ  И Ф О Р М Ы  В Ы П УС КА  НА Б О РА  РЕ А ГЕ Н ТО В 
Набор реагентов в ы пускается в 2 ф орматах:
Ф ормат FEP
Набор реагентов выпускается в 5 формах комплектации:
Форма 1 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50-2  штуки, «ПЦР-  
комплект» вариант FEP.
Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 50-2  штуки, «ПЦР-  
комплект» вариант FEP.
Форма 3 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000, «ПЦР-  
комплект» вариант FEP.
Форма 4 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FEP.
Форма 5 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным  
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 1  предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК из клинического материала методом  
преципитации, проведение обратной транскрипции РН К и амплификации кДНК с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК из клинического материала методом  
сорбции на силикагеле, проведение обратной транскрипции РНК и амплификации  
кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».
Форма комплектации 3 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК из клинического материала магнитной  
сепарацией, проведение обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».
Форма комплектации 4 предназначена для проведения обратной транскрипции  
РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по  
«конечной точке». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо  
использовать комплекты реагентов для экстракции РНК/ДНК, рекомендованные  
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Форма комплектации 5 предназначена для производственных целей для  
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.  
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 5 используется только в соответствии с  
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
соответствующим флуорофорам FAM (ВКО) и JOE {H D V ).
4


--- стр. 5 ---
Ф ормат FRT
Набор реагентов выпускается в 5 формах комплектации;
Форма 1  включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50-2  штуки, «ПЦР-  
комплект» вариант FRT.
Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 50-2  штуки, «ПЦР-  
комплект» вариант FRT.
Форма 3 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000, «ПЦР-  
комплект» вариант FRT.
Форма 4 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT.
Форма комплектации 1  предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК из клинического материала методом
преципитации, проведение обратной транскрипции РН К и амплификации кДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК из клинического материала методом
сорбции на силикагеле, проведение обратной транскрипции РНК и амплификации
кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального  
времени».
Форма комплектации 3 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК из клинического материала магнитной  
сепарацией, проведение обратной транскрипции РН К и амплификации кДНК с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 4 предназначена для проведения обратной транскрипции  
РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме  
«реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо  
использовать комплекты реагентов для экстракции РНК/ДНК, рекомендованные  
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Форма комплектации 5 предназначена для производственных целей для  
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.  
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 5 используется только в соответствии с  
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.


--- стр. 6 ---
А Н А Л И Т И Ч Е С К И Е  Х А Р А К Т И С Т И К И 
А н а л и ти ч е ск а я  ч у в с т в и т е л ь н о с т ь
Формат
Формат FEP
Формат FRT
Объём
экстракции,
мкл1
100
200
1000
100
200
1000
Комплект для  
экстракции  
РНК/ДНК
«РИБО-сорб»
«РИБО-преп»
NucliSENS
easyMAG
«МАГНО-сорб»
«МАГНО-сорб»  
NucliSENS  
easyMAG
«РИБО-сорб»
«РИБО-преп»
NucliSENS
easyMAG
«МАГНО-сорб»
«МАГНО-сорб»
NucliSENS
easyMAG
Аналитическая
чувствительность,
копий/мл
500
250
50
100
50
10
А н а л и ти ч е ск а я  с п е ц и ф и ч н о с т ь
Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством  
добавления в реакцию геномной Д Н К/РН К следующих организмов и вирусов: вирус  
гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека,  
цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус  
ветряной оспы, вирус герпеса человека типы 6 ,  8 ,  парвовирус В19, вирус клещевого  
энцефалита, вирус лихорадки западного Нила, Аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia  
соН, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae. Homo  
sapiens.
Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не  
были.
М ЕРЫ  П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно­
биологические (П Ц Р ) исследования клинического материала на наличие  
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических  
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-1V групп  
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН  
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с  
медицинскими отходами» и методических указаний М У 1.3.2569-09 «Организация  
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при


--- стр. 7 ---
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV  групп патогенности».
При работе всегда выполнять следующие требования:
-  Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,  
организовывать работу и хранить в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность  
работы с микроорганизмами III-IV  групп патогенности (опасности) и  
возбудителями паразитарных болезней».
-  Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя  
дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность  
работы с микроорганизмами III-IV  групп патогенности (опасности) и  
возбудителями паразитарных болезней».
-  Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в  
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения,  
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,  
оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия  
процесса.
-  Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10  
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими  
отходами».
ВН И М А Н И Е! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих  
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,  
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,  
оборудования и реагентов.
-  Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
-  Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
-  Не использовать набор по истечении срока годности.
-  Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во  
время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании  
работы.
-  Избегать контакта реагентов с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При  
контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за  
медицинской помощью.
-  Листы безопасности материалов (M SDS -  material safety data sheet) доступны по  
запросу.


--- стр. 8 ---
Д О П О Л Н И Т Е Л Ь Н Ы Е  М А Т Е Р И А Л Ы  И О Б О Р У Д О В А Н И Е 
ЗО Н А  1. Э к стр а к ц и я  Р Н К  из к л и н и че ско го  м а те р и а л а
1. Ламинарный бокс.
2. Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема.
4. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся  
пробирки объемом 1,5 мл.
5. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл.
6 .  Штативы для наконечников и пробирок объемом 1,5 мл.
7. Холодильник от 2 до 8 °С .
8 .  Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по М У 1.3.2569-09.
9. Емкость с дезинфицирующим раствором.
При использовании комплекта реагентов «РИБО-сорб» Т У  9398-004-01897593-2008) 
или «РИБО-преп» (ТУ 9398-071-01897593-2008):
1. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
2. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 12 тыс д.
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления  
надосадочной жидкости.
4. Одноразовые наконечники до 200 мкп.
5. Одноразовый флакон на 10-20 мл.
При использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (ТУ 9398-106-01897593-2012):
1. Термостат для пробирок объемом 5 мл, диаметром 1 2 мм от 25 до 100 °С.
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 “С.
3. Магнитный штатив для пробирок типа «Эппендорф» на 1,5 мл.
4. Магнитный штатив для пробирок на 5 мл, диаметр 12 мм.
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления  
надосадочной жидкости.
6 .  Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся  
пробирки объемом 1,5 мл.
7. Одноразовые полипропиленовые или полистирольные пробирки объемом до 5 мл  
диаметром 12  мм, круглодонные.
8 .  Одноразовые полипропиленовые крышки для пробирок объемом до 5 мл  
диаметром 12  мм.
9. Автоматический дозатор переменного объема с возможностью дозирования от  
1000 до 5000 мкл.
10.Одноразовые наконечники до 200 мкл, до 1000 мкл и до 5000 мкл.


--- стр. 9 ---
При использовании автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот:
1. Автоматическая станция для экстракции РН К/Д НК (например, NucliSENS  
easyMAG (bioMerieux, Франция)).
2. Набор реактивов и расходных материалов к автоматической станции (например  
NucliSENS easyM AG (NucliSens буфер для экстракции 1, NucliSens буфер для  
экстракции 2, NucliSens буфер для экстракции 3, NucliSens буфер для лизиса,  
NucliSens магнетизированная силика) (bioMerieux, Франция)).
3. Для автоматической станции например NucliSENS easyMAG (bioMerieux,  
Франция) требуется дополнительный комплект реагентов «ЕМ-плюс» (ФБУН  
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).
ЗОНА 2. П роведение реакции обратной транскр ипции, ПЦР и гибридизационно-
ф луоресцентной д етекц и и  продуктов ам плиф икации
1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
2 .  Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема.
4. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл в штативах.
5. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с  
используемыми комплектами реагентов).
6 .  Холодильник от 2 до 8 °С.
7. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по М У 1.3.2569-09.
8 .  Емкость для сброса наконечников.
При работе с «ПЦР-комплектом» (вариант FEP):
9. Программируемый амплификатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология»,  
Россия), Gradient Palm Cycler (Corbett Research, Австралия), GeneAmp PCR  
System 2700 (Applied Biosystems, США), M axyGene (Axygen, США) или  
аналогичные).
10.Флуоресцентный ПЦР-детектор (например, ALA-1/4 (BioSan, Латвия), «Джин-4»  
(«ДНК-Технология», Россия), «Джин-2» (версия п.о. не ниже 4.4i) («ДНК-  
Технология», Россия) или аналогичные).
При работе с «ПЦР-комплектом» (вариант FRT):
11.Программируемый амплификатор роторного типа (например, Rotor-Gene  
3000/6000 (Corbett Research, Австралия)) или амплификатор планшетного типа  
(например, iCycler i0 5  (Bio-Rad, США), МхЗОООР (Stratagene, США)) и  
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в  
методических рекомендациях по применению данного набора реагентов.
12.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл;


--- стр. 12 ---
Ф ОРМ АТ FEP -  « .К
Комплект реагентов «М А ГН О -со рб» вариант 100-1000 -  комплект реагентов для  
выделения РН К/Д Н К из клинического материала -  вклю чает:
Реактив ,  Описание ;  Объем, мл Кол-во
Лизирующий раствор  
МАГНО-сорб
Прозрачная бесцветная  
жидкость^ 70 4 флакона
Компонент А Прозрачная бесцветная  
жидкость 0.6 4 пробирки
Раствор для отмывки 5 Прозрачная бесцветная  
жидкость^ 60 4 флакона
Раствор для отмывки 6 Прозрачная бесцветная  
жидкость 20 4 флакона
Раствор для отмывки 7 Прозрачная бесцветная  
жидкость 6,0 4 флакона
Магнетизированная силика Суспензия черного цвета 0.9 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная  
жидкость 1,2 12 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 100 проб, включая контроли.  
Объем исследуемого материала 1000 мкл.
Входит в состав формы комплектации 3.
Комплект реагентов «П Ц Р -ком пл ект» вариант FEP -  комплект реагентов для  
проведения реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса  
гепатита D {HDV)  с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной  
точке» -  вклю чает:
Реактив Описание Объем, мл Кол-во
RT-G-mix-2 Прозрачная бесцветная  
жидкость 0.015 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-1-FL HDV Прозрачная бесцветная  
жидкость 0.3 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT Прозрачная бесцветная  
жидкость 0.2 4 пробирки
Минеральное масло для ПЦР Бесцветная вязкая 
жидкость 4.0 1 флакон
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная  
жидкость 0.02 4 пробирки
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная  
жидкость 0,01 4 пробирки
ПКО кДНК HDV-FL Прозрачная бесцветная  
жидкость 0.1 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная  
жидкость 1,2 2 пробирки
^ При хранении лизирующего раствора МАГНО-сорб и  раствора для отмывки 5 при температуре ниже
20 °С возможно образование осадка в виде кристаллов.
1 2


--- стр. 13 ---
Ф ОРМ АТ FEP
Комплект реагентов рассчитан на проведение 112 реакций обратной транскрипции и  
амплификации, включая контроли.
Входит в состав форм комплектации 1, 2, 3, 4.
К комплекту реагентов прилагаю тся контрольны е образцы  этапа экстракции;
' Реакт ив Описание Объем, мл Кол-во
ОКО Прозрачная бесцветная  
жидкость 1.2 4 пробирки
ПКО HDV-rec Прозрачная бесцветная  
жидкость 0,06 4 пробирки
ВКО ICZ-rec Прозрачная бесцветная  
жидкость 0,28 4 пробирки
ПРО ВЕДЕНИЕ П Ц Р -И С С Л Е Д О В А Н И Я
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов;
-  Экстракция РН К из исследуемых образцов.
-  Проведение реакции обратной транскрипции и амплификации.
-  Флуоресцентная детекция продуктов амплификации по «конечной точке».
-  Интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ РН К ИЗ И С С Л Е Д УЕ М Ы Х  О БР А ЗЦ О В
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые  
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку  
«RNase-free», «DNase-free».
Для экстракции РН К используются комплекты реагентов, рекомендованные ФБУН  
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора:
-  при использовании комплекта реагентов «Р И Б О -преп» порядок работы см. в  
приложении 1. «Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-  
преп»».
-  при использовании комплекта реагентов «Р И Б О -сорб» порядок работы см. в  
приложении 2. «Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-  
сорб»».
-  при использовании комплекта реагентов «М А ГН О -сорб» порядок работы для  
экстракции РН К из 1000 мкл и 200 мкл плазмы крови см. в приложении 3,  
«Экстракция РН К с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб».
При использовании автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот  
компаний bioMerieux и Qiagen совместно с набором реагентов необходимо  
использование протоколов и реагентов, позволяющих проводить экстракцию РНК из
1 3


--- стр. 14 ---
ФОРМАТ FEP
образцов плазмы и сыворотки крови объемом от 0,1  мл до 1 мл.
Процедура экстракции проводится в соответствии с инструкцией к автоматическим  
станциям, а также с учетом следующих условий:
а) Обязательным условием является внесение ВКО в образцы или лизирующий  
раствор до начала экстракции в объёме 10  мкл на одну пробу.
б) При экстракции образца для проведения нескольких различных исследований  
(допустима одновременная экстракция нуклеиновых кислот для обнаружения  
РНК HDV,  РН К HCV,  РНК HGV,  ДН К HBV,  РНК ВИЧ и НС\/-генотипирования)  
внести все требуемые препараты ВКО (аналогично).
в) Программируемый объем элюции -  50-60 мкл (допускается увеличение объёма  
элюции до 100  мкл).
г) При использовании автоматической станции NucliSENS easyMAG (bioMerieux,  
Франция) обязательно использование дополнительного комплекта реагентов  
«ЕМ-плюс» (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).  
Допускается использование режимов лизиса в приборе (On-board)  и вне  
прибора (Off-board).
д) После окончания экстракции РНК извлечь пробирки из прибора и провести  
реакцию О Т-П Ц Р . Очищенная РНК может храниться до 4 ч при температуре от  
2 до 8 °С. Для длительного хранения препарат необходимо хранить при  
температуре не выше минус 16 °С в течение 1  мес или не выше минус 68  °С в  
течение года.
Также см. методические рекомендации ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии  
Роспотребнадзора по применению наборов реагентов для выявления РНК вируса  
гепатита С (HCV)  «АмплиСенс® HCV-Fb>,  РН К вируса гепатита D (HDV) 
«АмплиСенс® HDV-FL»,  РНК вируса гепатита G (HGV)  «АмплиСенс® HGV-FL»,  ДНК  
вируса гепатита В (HBV)  «АмплиСенс® HBV-FL».
ПРО ВЕДЕН ИЕ Р Е А КЦ И И  О Б Р А ТН О Й  ТР А Н С КР И П Ц И И  И АМ ПЛИФ ИКА ЦИИ 
Общий объем  р еакционно й смеси -  25 мкл, вклю чая объем пробы РНК -  
10 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые  
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку  
RNase-free, DNase-free.
А. Подготовка п р о б и р о к для ам плиф икации
Выбор пробирок для ам плиф икации зав и си т от используемого
14


--- стр. 15 ---
Ф ОРМ АТ FEP
амплиф икатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РН К и контрольны х образцов  
использую тся о д н о р азо в ы е наконечники с ф ильтрам и.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно  
перед проведением ПЦР-исспедования. Смешивать реагенты из расчета на  
необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и  
контрольных образцов, необходимо согласно расчетной таблице (см. табл. 1 ).
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты  
набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации на 0,2 мл или на
0,5 мл с учетом количества исследуемых, контрольных образцов (два контроля  
экстракции, один контроль амплификации) и пробирок «Фон». Тип пробирок  
выбрать в зависимости от используемого прибора.
3. Для приготовл ения реакционной смеси в случае необходим ости подготовки  
пробирок «Ф он» необходимо в отдельной стерильной пробирке смешать  
реагенты из расчета на 1  реакцию: 10 мкл О Т -П Ц Р -см еси -1-FL HDV,  5 мкл ОТ-  
П Ц Р-см еси-2-F E P /F R T  и 0,25 мкл R T-G -m ix-2 (см. такж е табл. 1, пункт А).  
Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
4. Добавить в две пробирки «Ф он» по 15 мкл приготовленной смеси (без  
полимеразы (TaqF) и ТМ-Ревертазы (MMIv)) и по 10 мкл буф ера для элюции,  
перемешать пипетированием. Сверху раскапать по 1  капле минерального масла  
для ПЦР.
ВНИМАНИЕ! После проведения амплификации образцы «Ф он» можно хранить в  
течение 1  мес при температуре от 2 до 20 °С и использовать многократно.  
Многократное использование пробирок «Ф он» допускается при условии их  
использования с набором реагентов той же серии, того же типа выделительных  
реагентов и того же типа ПЦР-пробирок.
5. В оставшуюся часть реакционной смеси добавить из расчета на 1  пробу 0,5 мкл  
полимеразы  (TaqF) и 0,25 мкл ТМ -Р евертазы  (M M Iv) (см. также табл. 1,  
пункт А). Тщ ательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки  
пробирки.
Количество добавляемых в реакционную смесь ферментов полимеразы (TaqF) и  
ТМ-Ревертазы (MMIv), указанное в табл. 1  ,  приведено с учетом уже отобранных  
30 мкп реакционной смеси для двух пробирок «Фон».
1 5


--- стр. 22 ---
ФОРМАТ FRT
Комплект реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000 -  комплект реагентов для
выделения РНК/ДНК из клинического материала включает:
Реактив Описание Объем, мл Кол-во
Лизирующий раствор МАГНО- 
сорб
Прозрачная бесцветная
жидкость 1 1 70 4 флакона
Компонент А Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,6 4 пробирки
Раствор для отмы вки 5 Прозрачная бесцветная
жидкость 1 1 60 4 флакона
Раствор для отмы вки 6 Прозрачная бесцветная 
жидкость 20 4 флакона
Раствор для отмы вки 7 Прозрачная бесцветная 
жидкость 6.0 4 флакона
Магнетизированная силика Суспензия черного цвета 0,9 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная 
жидкость 1,2 12 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 100 проб, включая контроли.  
Объем исследуемого материала 1000 мкл.
Входит в состав формы комплектации 3.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT -  комплект реагентов для  
проведения реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса  
гепатита D {HDV) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме  
«реального времени» -  включает:
Реактив : :  ОпиСЭНив  i Объем, мл Кол-во
RT-G-mix-2 Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,015 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-1-FL HDV Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,3 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,2 4 пробирки
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,02 4 пробирки
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,01 4 пробирки
ПКО кДНК HDV-FL Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,1 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная 
жидкость 1,2 2 пробирки
Комплект реагентов рассчитан на проведение 112 реакций обратной транскрипции и  
амплификации, включая контроли.
При хранении лизирующего раствора МАГНО-сорб и раствора для отмывки 5 при температуре ниже
20 “С возможно образование осадка в виде кристаллов,
22


--- стр. 23 ---
ФОРМАТ FRT
Входит в состав форм комплектации 1 , 2, 3, 4.
К  комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции;
Реактив Описание ■Объем, мл Кол-во
ОКО
Прозрачная бесцветная 
жидкость 1.2 4 пробирки
ПКО HDV-rec Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,06 4 пробирки
ВКО /C Z-rec Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,28 4 пробирки
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
-  Экстракция РН К из исследуемых образцов.
-  Проведение реакции обратной транскрипции и амплификации с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
-  Анализ и интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые  
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку  
«RNase-free», «D Nase-free».
Для экстракции РН К используются комплекты реагентов, рекомендованные ФБУН  
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора:
-  при использовании комплекта реагентов «РИБО-преп» порядок работы см. в  
приложении 1. «Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-  
преп».
-  при использовании комплекта реагентов «РИБО-сорб» порядок работы см. в  
приложении 2. «Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-  
сорб».
-  при использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб» порядок работы для  
экстракции РН К из 1000 мкл и 200 мкп плазмы крови см. в приложении 3.  
«Экстракция РН К с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб».
При использовании автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот  
компаний bioMerieux и Oiagen совместно с набором реагентов необходимо  
использование протоколов и реагентов, позволяющих проводить экстракцию РНК из  
образцов плазмы и сыворотки крови объемом от 0,1 мл до 1  мл.
Процедура экстракции проводится в соответствие с инструкцией к автоматическим
23


--- стр. 24 ---
ФОРМАТ FRT
станциям, а также с учетом следующих условий;
а) Обязательным условием является внесение ВКО в образцы или лизирующий  
раствор до начала экстракции в объёме 10 мкл на одну пробу.
б) При экстракции образца для проведения нескольких различных исследований  
(допустима одновременная экстракция нуклеиновых кислот для обнаружения  
РНК HDV, РНК HCV, РНК HGV, ДН К HBV, РНК ВИЧ и НС\/-генотипирования)  
внести все требуемые препараты ВКО (аналогично).
в) Программируемый объем элюции -  50-60 мкл (допускается увеличение объёма  
элюции до 100 мкл).
г) При использовании автоматической станции NucliSENS easyMAG (bioMerieux,  
Франция) обязательно использование дополнительного комплекта реагентов  
«ЕМ-плюс» (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).  
Допускается использование режимов лизиса в приборе {On-board) и вне  
прибора (Off-board).
д) После окончания экстракции РНК, извлечь пробирки из прибора и провести  
реакцию О Т-П Ц Р . Очищенная РНК может храниться до 4 ч при температуре от  
2 до 8 °С. Для длительного хранения препарат необходимо хранить при  
температуре не выше минус 16 °С в течение 1  мес, или не выше минус 68 °С в  
течение года.
Также см. методические рекомендации ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии  
Роспотребнадзора по применению наборов реагентов для выявления РНК вируса  
гепатита С {HCV) «АмплиСенс® HCV-FL», РНК вируса гепатита D {HDV) 
«АмплиСенс® HDV-FL», РН К вируса гепатита G (HGV) «АмплиСенс® HGV-FL», ДНК  
вируса гепатита В (HBV) «АмплиСенс® HBV-FL».
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ С  
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
Общий объем реакционной смеси -  25 мкл, включая объем пробы РНК -  
10 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые  
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку  
RNase-free, DNase-free.
24


--- стр. 25 ---
ФОРМАТ FRT
А. Подготовка пробирок для амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого  
амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов  
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно  
перед проведением ПЦР-исследования. Смешивать реагенты из расчета на  
необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и  
контрольных образцов, необходимо согласно расчетной таблице (см. табл. 4).
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты  
набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с учетом  
количества исследуемых, контрольных образцов (два контроля экстракции, один  
контроль амплификации). Тип пробирок, стрипов или плашек выбрать в  
зависимости от используемого прибора.
3. Для приготовления реакционной смеси необходимо в отдельной стерильной  
пробирке смешать реагенты из расчета на 1  реакцию: 10 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1-  
FL HDV, 5 мкл ОТ-ПЦР-смеси-2-FEP/FRT, 0,25 мкл RT-G-mix-2, 0,5 мкл  
полимеразы (TaqF) и 0,25 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv). Тщательно перемешать  
смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
4. Внести в пробирки по 15 мкл готовой реакционной смеси.
5. В готовые пробирки внести по 10 мкл РНК-проб, выделенных из клинических  
образцов.
ВНИМАНИЕ! При добавлении РНК-проб, выделенных с помощью комплекта  
реагентов «РИБО-сорб», «!\/1АГНО-сорб» и NucliSENS easyMAG, необходимо  
избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
6. Поставить контрольные реакции;
а) положительный контроль экстракции (ПК) -  внести в пробирку 10 мкл РНК- 
пробы, выделенной из образца ПКО HDV-rec.
б) отрицательный контроль экстракции (ОК) -  внести в пробирку 10 мкл РНК- 
пробы, выделенной из образца ОКО.
в) положительный контроль ПЦР (К+) -  внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК  
HDV-FL.
При подозрении на возможную контаминацию также необходима постановка
2 5