Набор реагентов для выявления ДНК Cryptococcus neoformans в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® Cryptococcus neoformans-FL" по ТУ 9398-191-01897593-2012 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2012/13996 от 29.10.2012 · класс риска 2б

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Вид изделия: Множественные виды грибов/дрожжеподобных грибов ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 76 контрактов, медианная цена за единицу 24 760 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДЕНА 
Приказом Росздравнадзора 
от Nq
УТВЕРЖДАЮ
Директор Федерального
бюджетного учреждения науки 
«Центральный научно-
исследовательский институт 
эпидемиологии» Федеральной 
службы по надзору в сфере 
\защиты прав потребителей и  
блaгoflpлyчия чело|
_______Ю кровскиИ
2012 Г .
И Н С Т Р У К Ц И Я
по применению набора реагентов  
для выявления ДНК Cryptococcus neoformans в биологическом  
материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
« А м п л и С е н с ®  C r y p t o c o c c u s  n e o f o r m a n s - F L »
АмплиСенс ®
ш 1
Федеральное бюджетное учреждение науки 
«Центральный научно-исследовательский 
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD


--- стр. 2 ---
СПИСОК С О К Р А Щ Е Н И Й ..........................................................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ...............................................................................................................................................3
ПРИНЦИП М Е Т О Д А ....................................................................................................................................3
ФОРМАТЫ И Ф О РМ Ы  В Ы П УС КА  НАБО РА Р Е А Г Е Н Т О В ..........................................................4
АНАЛИТИЧЕСКИЕ Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И ............................................................................................ 4
МЕРЫ П Р Е Д О С ТО Р О Ж Н О С Т И ............................................................................................................ 5
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫ Е М АТЕРИАЛЫ  И О Б О Р У Д О В А Н И Е ..........................................................6
ВЗЯТИЕ, Т Р А Н С П О Р Т И Р О В А Н И Е  И ХР АН ЕН И Е И С С Л ЕДУЕМ О ГО  М АТЕРИАЛА... 7
ФОРМАТ F R T ................................................................................................................................................8
С О С ТАВ...........................................................................................................................................................8
ПРОВЕДЕНИЕ П Ц Р -И С С Л Е Д О В А Н И Я ............................................................................................. 9
ЭКСТРАКЦИЯ Д Н К  ИЗ И С С Л Е ДУЕМ Ы Х О Б Р А З Ц О В ................................................................. 9
ПРО ВЕДЕНИЕ АМ П Л И Ф И КА Ц И И  С ДЕТЕКЦ И ЕЙ  В Р Е Ж И М Е «РЕАЛЬНОГО
В Р Е М Е Н И ».....................................................................................................................................................9
А. Подготовка пробирок для ам плиф икации ................................................................................... 9
Б. Проведение ам плиф икации с детекцией в режиме «реального врем ени» .............11
АНАЛИЗ И И Н ТЕ Р П Р Е ТА Ц И Я  Р Е З У Л Ь Т А Т О В ............................................................................11
СРОК ГО ДНОСТИ. УС ЛО ВИ Я  ТР АН С П О РТИ РО ВА Н И Я  И Х Р А Н Е Н И Я ..........................14
ПРИЛОЖ ЕНИЕ. С хема приготовления реакционной с м е с и ..................................................15
СИМВОЛЫ , И С П О Л ЬЗУЕМ Ы Е В ПЕЧАТНОЙ П Р О Д У К Ц И И .................................................16
О ГЛ А В Л Е Н И Е


--- стр. 3 ---
список СО КРАЩ ЕНИ Й
В настоящ ей инструкции применяю тся следую щ ие сокращ ения и обозначения;
ВКО STI-87 - экзогенный внутренний контрольный образец
ОКО - отрицательный контрольный образец
ПКО - положительный контрольный образец
В- - отрицательным контроль экстракции
ПЦР - полимеразная цепная реакция
К+ - положительный контроль ГИДР
К - - отрицательный контроль ПЦР
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный 
научно-исследовательский институт эпидемиологии» 
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав 
потребителей и благополучия человека______________________
FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
Н А ЗН А Ч Е Н И Е
Набор реагентов « А м п л и С е н с® C /y p to c o c c u s  n e o fo rm a n s -F L » предназначен для 
выявления Д Н К  C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s в биологическом  материале 
(спинномозговая ж идкость (СМЖ), бронхоальвеолярны й лаваж  (БАЛ), мокрота, 
кровь, пунктаты из очагов поражения кожи, биоптаты  и аутоптаты внутренних 
органов) методом ПЦР с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией продуктов 
амплиф икации.
ВН И М АН И Е! Р езультаты  ПЦ Р-исследования учиты ваю тся в комплексной 
диагностике забо л еван ия^
ПРИНЦИП М Е Т О Д А
Выявление C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s методом полимеразной цепной реакции 
(ПЦР) с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией вклю чает в себя три этапа: 
экстракцию Д Н К  из образцов клинического материала, П Ц Р-амплиф икацию  |иастка 
ДНК данного м икроорганизм а и гибридизационно-ф луоресцентную  детекцию. 
Экстракция Д Н К из клинического материала проводится в присутствии внутреннего 
контрольного образца (ВКО STI-87), который позволяет контролировать выполнение 
процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученны ми пробами ДНК 
проводится реакция ам плиф икации участка Д Н К  
C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s при 
помощи специф ичны х к этому участку Д Н К праймеров и ф ерм ента Тад-полимеразы. 
В составе реакционной смеси присутствую т ф луоресцентно-мечены е 
олигонуклеотидны е зонды, которые гибридизую тся с комплем ентарны м  участком 
амплиф ицируем ой Д Н К-м иш ени, в результате чего происходит нарастание 
интенсивности ф луоресценции. Это позволяет регистрировать накопление
в соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.


--- стр. 4 ---
специф ического продукта ам плиф икации путем измерения интенсивности 
ф луоресцентного сигнала. Д етекция ф луоресцентного сигнала осуществляется 
непосредственно в ходе ПЦР с помощ ью  ам плиф икатора с системой детекции 
ф луоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
Ф О Р М А ТЫ  И Ф О Р М Ы  В Ы П У С К А  Н А Б О Р А  Р Е А ГЕ Н Т О В  
Н абор р е а ге н то в  в ы п у с к а е т с я  в 1  ф орм ате.
Ф о р м а т FRT
Набор реагентов вы пускается в 3 ф ормах комплектации:
Ф орм а 1  включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 100 и «ПЦР-комплекг» 
вариант FRT-100 F;
V  Ф орм а 2 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р-комплект» вариант FRT-100 F.
I  Ф орм а 3 вклю чает наборы реагентов оптом, расф асованны е по отдельным
реагентам, с м аркировкой реагентов на их оптовой ф асовке.
Форма ком плектации 1  предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, 
включающего экстракцию ДН К и ам плиф икацию  Д Н К C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s с 
гибридизационно-ф луоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплиф икации ДНК
C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией в режиме 
«реального времени». Для проведения полного П Ц Р-исследования необходимо 
использовать комплекты  реагентов для экстракции ДН К, рекомендованны е ФБУН 
ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора.
Форма комплектации 3 предназначена для производственны х целей для
последующ ей м аркировки на языке заказчика и ком плектации по наборам. 
В Н И М АН И Е ! Ф орм а комплектации 3 используется только в соответствии с 
регламентом, утверж денны м  ФБУН ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора.


--- стр. 5 ---
г
I
г
АН АЛИ ТИЧЕС КИЕ Х А Р А КТ Е Р И С Т И КИ  
А н а л и тиче ска я ч у в с т в и т е л ь н о с т ь
Вид биологического 
материала
смж,
БАЛ,
мокрота,
кровь,
пунктаты из очагов 
поражения кожи, 
биоптаты и аутоптаты 
внутренних органов
Комплект
для
экстракции
РНК/ДНК
«РИБО-преп»
Комплект для 
амплиф икации 
и детекции
«ПЦР-комплект» 
вариант FRT-100 F
Аналитическая
чувствительность,
копий/мл
400
А н а л и ти ч е с ка я  с п е ц и ф и ч н о с т ь
С пециф ичность теста для выявления 
C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s проверялась на 
штаммах грибов P e n ic illiu m  b re v ic o m p a c tu m , P e n ic illiu m  c h ry s o g e n u m , T richo derm a 
h a rzia n u m , T ric h o th e c iu m  ro se u m , T ric h o d e rm a  v irid e , T ric h o d e rm a  k o n in g ii, F usa rium 
so la n i, F u s a riu m  p o a e , F u s a riu m  o xy s p o ru m , F u s a riu m  sa m b u cin u m , F u sa riu m 
v e rtic iliio id e s , M u c o r p iu m b e u s , M u c o r h ie m a lis , M u c o r ra c e m o s u s , M u c o r p u sillu s, 
A s p e rg illu s  v e rs ic o lo r, A s p e rg illu s  n ig e r, A s p e rg illu s  fla v u s , A s p e rg illu s  fu m ig a tu s, 
R h iz o p u s  s to lo n ife r, R h iz o p u s  o ryza e , R h iz o p u s  m ic ro s p o ru s , S ce d o sp o riu m 
a p io sp e rm u m , T ric h o s p o ro n  b e ig e lii, N e u ro s p o ra  s ito p h ila , S ta c h y b o try s  chartaru m , 
P a e c ilo m y c e s  fu lv u s , C la d o s p o riu m  c la d o s p o rio id e s , W a lle m ia  se b i. G e o tric h u m  candium , 
C a n d id a  a lb ic a n s , C a n d id a  g la b ra ta , C a n d id a  k ru s e i и Д Н К  человека. Неспециф ических 
реакций (лож нополож ительны х результатов) при тестировании не выявлено
М ЕРЫ  П Р Е Д О С ТО Р О Ж Н О С ТИ
Работа долж на проводиться в лаборатории, вы полняю щ ей молекулярно­
биологические (ПЦР) исследования клинического м атериала на наличие 
возбудителей инф екционны х болезней, с соблю дением  санитарно-эпидемических 
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизм ам и III-IV  групп 
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарны х болезней», СанПиН 
2.1.7.2790-10 «С анитарно-эпидем иологические требования к обращ ению с 
медицинскими отходам и» и м етодических указаний М У 1.3.2569-09 «Организация 
работы лабораторий, использую щ их методы ам плиф икации нуклеиновы х кислот при 
работе с материалом, содержащ им  микроорганизмы  I-IV  групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования;
- С ледует рассм атривать исследуемы е образцы  как инф екционно-опасные, 
организовы вать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08
5


--- стр. 6 ---
«Безопасность работы  с м икроорганизмами III-IV  групп патогенности 
(опасности) и возбудителям и паразитарны х болезней».
Убирать и дезинф ицировать разлиты е образцы  или реактивы, используя 
дезинф ицирую щ ие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность 
работы с м икроорганизм ам и III-IV  групп патогенности (опасности) и 
возбудителями паразитарны х болезней».
Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в 
отдельных помещ ениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения, 
продолжать в Зоне Амплиф икации и Детекции. Не возвращать образцы, 
оборудование и реактивы в Зону, в которой была проведена предыдущая стадия 
процесса.
^  - Удалять неиспользованны е реактивы в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10
«С анитарно-эпидем иологические требования к обращ ению  с медицинскими 
отходами».
ВН И М АН И Е ! При удалении отходов после ам плиф икации (пробирок, содержащих 
продукты ПЦР) недопустим о откры вание пробирок и разбры згивание содержимого, 
поскольку это м ож ет привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, 
оборудования и реагентов.
- П рименять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
- Д опускать к работе с набором только специально обученны й персонал.
- Не использовать набор по истечении срока годности.
- Использовать одноразовы е перчатки, лабораторны е халаты , защ ищ ать глаза во
время работы с образцами и реактивами. Тщ ательно вы мы ть руки по окончании 
работы. ^
- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте 
немедленно промы ть пораженное место водой и обратиться за медицинской 
помощ ью.
- Листы безопасности материалов (M SDS -  m aterial safety data sheet) доступны по 
запросу.
Д О П О Л Н И Т Е Л Ь Н Ы Е  М А Т Е Р И А Л Ы  И О Б О Р У Д О В А Н И Е
1. Комплект реагентов для вы деления РН К/Д Н К «Р И БО -преп» (ТУ 9398-071- 
01897593-2008) или другие реком ендованны е Ф БУН ЦНИИ Эпидемиологии 
Роспотребнадзора - при работе с ф ормой комплектации 2.
2. Д ополнительны е м атериалы  и оборудование для экстракции Д Н К -  согласно 
инструкции к ком плекту реагентов для вы деления ДНК.
3. Бокс абактериальной воздуш ной среды (ПЦР-бокс).


--- стр. 7 ---
4. Центрифуга/вортекс.
5. Автоматические дозаторы  переменного объема (от 5 до 20 от 20 до 200 мкл).
6. Одноразовые наконечники с ф ильтром до 100 мкп в штативах.
7. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл.
8. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выш е минус 16 °С для 
выделенных проб ДНК.
9. Отдельный халат, ш апочки, обувь и одноразовы е перчатки по М У 1.3.2569-09.
10.Емкость для сброса наконечников.
11.Программируемы й ам плиф икатор с системой детекции ф луоресцентного сигнала 
в режиме «реального времени» (например, R otor-G ene 3000/6000 (Corbett Research, 
Австралия), R otor-G ene Q (QIAG EN, Германия), iC ycler iQ5 (Bio-Rad, США) и 
реком ендованны е Ф БУН ЦНИИ Эпидемиологии Р оспотребнадзора в методических 
реком ендациях по прим енению  данного набора реагентов).
12.О дноразовы е полипропиленовы е пробирки для ПЦР.
а) тонкостенны е пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой или плоской 
оптически прозрачной крыш кой -  при использовании прибора планшетного 
типа;
б) тонкостенны е пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой 
(например, Axygen, СШ А) или пробирки для ПЦР к Rotor-Gene, объемом 0,1 мл 
в стрипах по 4 шт. с крыш ками (например, Corbett Research, Австралия; Qiagen, 
Германия) -  при использовании прибора роторного типа.
ВЗЯ ТИЕ, Т Р А Н С П О Р Т И Р О В А Н И Е  И Х Р А Н Е Н И Е  И С С Л Е Д УЕ М О ГО  М АТЕ РИ А Л А
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями 
«Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР- 
диагностики», разработанны м и ФГУН ЦНИИЭ, М осква, 2008 г.
М атериалом для исследования служат; СМЖ , БАЛ, мокрота, кровь, пунктаты из 
очагов поражения кожи, биоптаты  и аутоптаты внутренних органов.


--- стр. 8 ---
Ф О Р М А Т  F R T
ФОРМАТ FRT 
СОСТАВ
Комплект р е а ге н то в  «Р И Б О -п р е п»  в а р и а н т 100 -  ком плект реагентов для 
выделения Р Н К/Д Н К из клинического материала -  в к л ю ч а е т;
Р е а к т и в О пи са н и е
в а р и а н т  100
О бъ ем , м л Кол-во
Раствор для лизиса Прозрачная жидкость 
голубого цвета ^ 30 1  флакон
Раствор для преципитации Прозрачная бесцветная 
жидкость 40 1  флакон
Раствор для отм ы вки 3 Прозрачная бесцветная 
жидкость 50 1  флакон
Раствор для отм ы вки 4 Прозрачная бесцветная 
жидкость 20 1  флакон
РНК-буфер Прозрачная бесцветная 
жидкость 1,2 8 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на выделение РН К/Д Н К из 100 образцов, вкпючая 
контроли. Входит в состав ф ормы комплектации 1.
К о м п л е кт р е а ге н то в  « П Ц Р -ко м п л е кт»  в а р и а н т FR T-100 F -  комплект реагентов 
для ам плиф икации и количественного определения Д Н К  C ry p to c o c c u s  n e o fo rm a n s с 
гибридизационно-ф луоресцентной детекцией в реж им е «реального времени» -  
вкл ю ча е т:
Р е а к т и в О пи са н и е О бъ ем , м л К о л -во
ПЦР-смесь-1-FRT C ry p to c o c c u sПрозрачная бесцветная 
жидкость 1.2 1  пробирка
ПЦР-смесь-2-FRT Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,6 1  прс^ирка
Полимераза (TaqF) Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,06 1  пробирка
ДНК-буфер Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,5 1  пробирка
ПКО ДНК C ryp t.-^ Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,2 1  пробирка
ПКО ДНК C ryp t.-2 Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,2 1  пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплиф икации, включая 
контроли.
^  При хранении раствора для лизиса при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в 
виде кристаллов.


--- стр. 9 ---
Ф О Р М А Т  F R T
К комплекту реагентов прилагаю тся контрольны е образцы  этапа экстракции:
Р е а к т и в О п и сан и е О б ъ е м , м л К ол-во
О К О Прозрачная бесцветная 
жидкость 1,2 2 пробирки
В К О  STI-87 Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,6 2 пробирки
ПРОВЕДЕНИЕ П Ц Р -И С С Л Е Д О В А Н И Я
ПЦР-исследование состоит из следую щ их этапов:
- Экстракция Д Н К  из исследуем ы х образцов.
- А м плиф икация с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией в режиме 
«реального времени».
- Анализ и интерпретация результатов.
Детальная инф орм ация по процедуре проведения ПЦР-исследования в 
зависимости от типа используемого оборудования изложена в методических 
рекомендациях по прим енению  набора реагентов для вы явления Д Н К C ryp to co ccu s 
n e o fo rm a n s в клиническом  материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) 
с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией «А мпп\лС енс®  C ryp to co ccu s 
n e o fo rm a n s -F L » , разработанны х ФБУН ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора.
Э КС ТРА КЦ И Я  Д Н К  ИЗ И С С Л Е Д У Е М Ы Х  О Б Р А З Ц О В
Для экстракции Д Н К  использую тся наборы реагентов, рекомендованны е ФБУН 
ЦНИИ Э пидемиологии, в соответствии с инструкцией к используемому набору. 
Экстракция Д Н К  из каждого кпинического образца проводится в присутствии 
внутреннего контрольного образца -  ВКО STI-87 (в каждый образец добавляется 
10 м кл  ВКО  STI-87). В пробирку отрицательного контроля (В -) экстракции вносится 
100 м кл  ОКО.
П РО ВЕД ЕН И Е А М П Л И Ф И К А Ц И И  С Д Е ТЕ КЦ И Е Й  В РЕЖ И М Е «Р ЕАЛ ЬН О ГО  
ВРЕМ ЕНИ»
А. П о д го то в ка  п р о б и р о к  д л я  а м п л и ф и ка ц и и
В ы б о р  п р о б и р о к  д л я  а м п л и ф и ка ц и и  з а в и с и т  о т и с п о л ь зу е м о го  
а м п л и ф и ка то р а  с с и с те м о й  д е те кц и и  в р е ж и м е  « р е а л ь н о го  вр е м е н и » .
Д ля в н е се н и я  в п р о б и р к и  р е а ге н то в , п р о б  Д Н К  и к о н т р о л ь н ы х  о б р а зц о в  
и с п о л ь з у ю тс я  о д н о р а з о в ы е  н а ко н е ч н и ки  с ф и л ь т р а м и .
О бщ ий о б ъ е м  р е а кц и о н н о й  см е си  -  25 м кл , в к л ю ч а я  о б ъ е м  п р о б ы  Д Н К -  
10 м кл.


--- стр. 10 ---
Ф О Р М А Т  F R T
1 . Предварительно необходимо подготовить смесь ПЦР-смеси-2-FRT и  
полимеразы (TaqF). Содержимое одной пробирки с полимеразой (TaqF)  
(60 мкл) необходимо полностью перенести в пробирку с ПЦР-смесью-2-FRT  
(600 мкл), аккуратно перемешать на вортексе, не допуская образования пены и
I
осадить капли кратковременным центрифугированием (1-2 с). Промаркировать  
пробирку, указав дату приготовления смеси.
ВНИМАНИЕ! Приготовленная смесь рассчитана на исследование 120 образцов.  
Смесь хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 3 мес и использовать по  
мере необходимости.
В случае если данная смесь не может быть израсходована в течение трех  
^  месяцев, необходимо готовить смесь на меньшее количество реакций,
например, смешать 150 мкл ПЦР-смеси-2-FRT и 15 мкл полимеразы (TaqF)  
(полученная смесь рассчитана на 30 реакций).
2. Подготовить реакционную смесь. Следует учитывать, что для тестирования  
даже одного исследуемого образца необходимо проводить постановку трех  
контрольных точек этапа амплификации ПКО ДНК C ry p t.A , ПКО ДНК C ry p t-2 
и отрицательный контроль (ДНК-буфер). Кроме того, необходимо брать  
реагенты с запасом: для тестирования N  образцов приготовить реагенты для  
(N+1) реакций.
3. В отдельной пробирке смешать ПЦР-смесь-1-FRT C ry p to c o c c u s и заранее
!  подготовленную смесь ПЦР-смеси-2-FRT и полимеразы (TaqF). Расчет
производится исходя из того, что на каждую постановку ПЦР идет:
-  10 мкл ПЦР-смеси-1-FRT C ry p to c o c c u s ^
-  5 мкл смеси ПЦР-смеси-2-FRT и полимеразы (TaqF).
Сделать расчет на необходимое число реакций, включающее тестирование  
исследуемых и контрольных образцов, можно согласно расчетной таблице,  
приведенной в Приложении.
4. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых 
и контрольных образцов.
5. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной реакционной смеси.
6. В пробирки с реакционной смесью добавить по 10 мкл проб ДНК, полученных в  
результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов.
7. Поставить контрольные реакции:
а) отрицательный контроль ПЦР (К-) -  внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительные контрол и ПЦР (K+i), (К+г) -  в одну пробирку внести 10 мкл
10


--- стр. 11 ---
i
Ф О Р М А Т  F R T
ПКО ДНК C r y p t-Л, в другую 10 мкл ПКО ДНК C ry p t-2 .
в) отрицательный контроль экстракции (В-) -  внести в пробирку 10 мкл  
пробы, выделенной из ОКО.
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»
1 . Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме  
«реального времени») для выполнения соответствующей программы  
амплификации и детекции флуоресцентного сигнала «АмплиСенс-1» (см. табл. 1 ).
Таблица 1
Программа «АмплиСенс-1»
Приборы роторного типа^ Приборы планшетного типа'*
Цикл Темпера­
тура, °С Время Кол-во
циклов
Темпера­
тура, °С Время Кол-во
циклов
1 95 15 мин 1 95 15 мин 1
2
95 5 с
5
95 5 с
560 20 с 60 20 с
72 15с 72 15с
3
95 5 с
40
95 5 с
4060
20 с 
детекция 
флуоресц. 
сигнала
60
30 с 
детекция 
флуоресц. 
сигнала
72 15с 72 15с
Детекция флуоресцентного сигнала назначается по каналам для флуорофоров  
FAM и JOE (при одновременном проведении других тестов назначается детекция и  
по другим используемым каналам).
2. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. ^
3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного  
сигнала.
4. По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации  
результатов.
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения  
используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального
^ Например, Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия); Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) 
и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях 
по применению данного набора реагентов.
^ Например, iCycler iQ5 (Bio-Rad, США) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии 
Роспотребнадзора в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов}
1 1


--- стр. 12 ---
Ф О Р М А Т  F R T
времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум  
каналам:
- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о  
накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК ВКО (ВКО STI-87).
- по каналу для флуорофора JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о  
накоплении продукта амплификации ДНК Cryptococcus neoformans.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия)
пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне  
пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК  
значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. 
Принцип интерпретации результатов следующий:
- ДНК Cryptococcus neoformans  обнаружена, если для данной пробы значение  
порогового цикпа Ct по каналу для флуорофора JOE не превышает указанное  
граничное значение. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна  
пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального  
подъема флуоресценции.
- ДНК Cryptococcus neoformans  не обнаружена, если для данной пробы значение  
порогового цикла Ct по каналу для флуорофора JOE не определено (отсутствует) 
или превышает указанное граничное значение, а в таблице результатов по  
каналу для флуорофора РАМ определено значение порогового цикла Ct, не 
превышающее указанное (граничное) значение.
- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено  
(отсутствует) значение порогового цикпа Ct по каналу для флуорофора FAI\^и по  
каналу для флуорофора JOE значение Ct также не определено (отсутствует) или 
превышает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторно  
провести ПЦР-исследование соответствующего клинического образца.
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Cf указаны во вкпадыше, прилагаемом к набору  
реагентов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены  
правильные результаты для положительных и отрицательного контролей  
амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с  
таблицей оценки результатов контрольных реакций (табл. 2).
12


--- стр. 13 ---
Ф О Р М А Т  F R T
Таблица 2
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль
Контролируемый 
этап ПЦР- 
исследования
Значение порогового цикла, Ct
по каналу для 
флуорофора FAM
по каналу для 
флуорофора JOE
В - Экстракция ДНК Определено значение 
меньше граничного
Значение
отсутствует
К - ПЦР Значение отсутствует Значение
отсутствует
К+1 ПЦР Определено значение 
меньше граничного
Определено 
значение меньше 
граничного
К+2 ПЦР Определено значение 
меньше граничного
Определено 
значение меньше 
граничного
ВНИМАНИЕ!
1. Если для положительных контролей ПЦР K+i и К +2  значение порогового цикла по  
каналу для флуорофора JOE отсутствует или превышает граничное значение,  
необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не  
обнаружена ДНК Cryptococcus neoform ans.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного  
контроля ПЦР (К-) по каналу для флуорофора JOE зафиксировано значение  
порогового цикла Ct, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех  
образцов, в которых обнаружена ДНК Cryptococcus neoform ans,  начиная с этапа  
экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению  
контаминации..
источника
13


--- стр. 14 ---
I
СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ 
Срок годности. 9 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не  
подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,  
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано  
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до  
8 °С не более 5 сут. «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F при получении  
разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.  
Хранение. Набор реагентов хранить при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь-1-FRT 
Cryptococcus  хранить в защищенном от света месте. ПЦР-смесь-1-FRT Cryptococcus,  
ПЦР-смесь-2-FRT и полимеразу (TaqF) хранить при температуре не выше минус 16 °С. 
Условия отпуска. Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических  
учреждений.
Рекламации на качество набора реагентов «АмплиСенс® Cryptococcus  
neoform ans-FL»  направлять на предприятие-изготовитель ФБУН ЦНИИ  
Эпидемиологии (111123 г. Москва, ул. Новогиреевская, д. За) в отдел по работе с  
рекламациями и организации обучения (тел. (495) 974-96-46, факс (495) 916-18-18,  
e-mail: products@pcr.ru)®.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
С_ _ _ _‘ Е.Н. Родионова
Главный врач ФГВУ «Поликлиника № 1» & / У
ф  Управления делами Президента Российской Фе^^ации
К { ^ 0 В
Й г .: ./ ' v r  , L ,  ' t ; ' !
^  Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету 
потребителя на сайте: www.amplisensTu.
14


--- стр. 15 ---
Ф О Р М А Т  F R T
-В*?Ж
ПРИЛОЖЕНИЕ. Схема приготовления реакционной смеси
Объем реактивов на указанное количество реакций
Объем реагентов на 10,0 5,0одну реакцию, мкл
Число клинических ПЦР-смесь-1-FRT Смесь ПЦР-смеси-2-FRT и
образцов Cryptococcus^ полимеразы (TaqF)®
1 50 25
2 60 30
3 70 35
4 80 40
5 90 45
6 100 50
7 110 55
8 120 60
9 130 65
10 140 70
1 1 150 75
12 160 80
13 170 85
14 180 90
15 190 95
16 200 100
17 210 105
18 220 110
19 230 115
20 240 120
2 1 250 125
22 260 130
23 270 135 ^
24 280 140
25 290 145
30 340 170
Приведены значения с учетом запаса (расчет на одну реакцию больше) и с учетом 
необходимости постановки трех контролей этапа ПЦР (ПКО ДНК Crypt.-^,  ПКО ДНК Crypt.-2 и  
отрицательный контроль -ДНК-буфер).
15


--- стр. 16 ---
с и м в о л ы ,  И С П О Л Ь З У Е М Ы Е  В  П Е Ч А Т Н О Й  П Р О Д У К Ц И И
R E F
L O T
Номер в каталоге
Код партии
Осторожно! 
Обратитесь к 
сопроводительной 
документации
Максимальное 
число тестов
IV D Изделие для in vitro 
диагностики Использовать до
V E R
I
Л
i J
Дата изменения •
- J - L
Ограничение
температуры
Верхнее ограничение 
температуры | W T
Производитель
Обратитесь к 
руководству по 
эксплуатации
Не допускать 
попадания 
солнечного света
Дата изготовления
16