Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® Yellow fever virus-FL по ТУ 21.20.23.110-246-01897593-2017 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
«УТВЕРЖДАЮ»
Зам. директора Федерального
бюджетного учреждения науки
«Центральный научно-
исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребите;
человеь
благополучия
Акимкин
г.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс®Уе//о1У fever virus-FL
АмплиСенс®
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом ЗА IVD
--- стр. 2 ---
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ......................................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА............................................................................................................4
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ.................................................................................................5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.............................................................................5
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.......................................................................7
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ................................7
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.............................................12
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.. 14
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ РНК...........................16
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ
ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.......................................................................................18
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................................18
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ...................................................18
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1 («ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F)..............................21
СОСТАВ........................................................................................................................21
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ».........................................................................................21
A. Подготовка пробирок для ОТ-ПЦР...................................................................22
Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».............23
B. Анализ и интерпретация результатов..................................................................24
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2 («ПЦР-комплект» вариант FRT-L)...................................27
СОСТАВ........................................................................................................................27
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ».........................................................................................27
A. Подготовка пробирок для ОТ-ПЦР...................................................................27
Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».............28
B. Анализ и интерпретация результатов..................................................................29
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.....................32
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ...............................................32
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ........................................34
стр. 2 из 34
--- стр. 3 ---
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
4
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® Yellow fever virus-FL, далее
- набор реагентов, предназначен для качественного определения РНК вируса
жёлтой лихорадки (Yellow fever virus, YFV) в биологическом материале (плазма
крови, слюна, моча, тканевой (аутопсийный, биопсийный) материал, комары)
методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов
амплификации. Набор реагентов используется в клинической лабораторной
диагностике. Материалом для проведения ОТ-ПЦР служат пробы РНК,
экстрагированной из исследуемого материала.
В соответствии с федеральным законом от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах
охраны здоровья граждан в Российской Федерации» ПЦР-исследование является
одним из методов всестороннего обследования пациента, на основании которых
лечащий врач устанавливает диагноз и выбирает мероприятия по лечению
пациента.
Показания и противопоказания к применению набора реагентов
Набор реагентов используется для исследования биологического материала,
полученного от лиц с подозрением на жёлтую лихорадку. Согласно рекомендациям
центра по контролю за заболеваниями США (CDC)1 определение РНК вируса желтой
лихорадки методом ПЦР обладает наибольшей диагностической чувствительностью
BKO-FL - экзогенный внутренний контрольный образец
«ДНК - комплементарная ДНК, получаемая в реакции обратной
транскрипции на матрице РНК
K+ - положительный контроль ОТ-ПЦР
К- - отрицательный контроль ОТ-ПЦР
OK - отрицательный контроль экстракции
ОКО - отрицательный контрольный образец
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПК - положительный контроль экстракции
пко - положительный контрольный образец
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РУ - регистрационное удостоверение
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
YFV - Yellow fever virus, вирус жёлтой лихорадки
FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
1 Center for Disease Control and Prevention. Yellow fever vaccine: Recommendations of the Advisory
Committee on immunization Practices (ACIP)/ MMWR 2010; 59:1-27
стр. 3 из 34
--- стр. 4 ---
в первые 3-4 дня заболевания. При летальном исходе, согласно данным CDC, РНК
вируса желтой лихорадки обнаруживается методом ПЦР в аутопсийном материале,
в основном в тканях печени.
Противопоказания отсутствуют, за исключением случаев, когда забор материала
не может быть осуществлен по медицинским показаниям.
Потенциальные пользователи медицинского изделия
К работе с набором реагентов допускаются только медицинские работники,
обученные методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-
диагностической лаборатории в установленном порядке (СП 1.3.2322-08
«Безопасность работы с микроорганизмами 111— IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней»).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Принцип тестирования основывается на экстракции РНК из образцов
исследуемого материала совместно с экзогенным внутренним контрольным
образцом (BKO-FL) и одновременном проведении реакции обратной транскрипции
РНК и амплификации участков кДНК выявляемого вируса и кДНК BKO-FL с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией. BKO-FL позволяет контролировать все
этапы ПЦР-исследования для каждого образца и оценивать влияние ингибиторов на
результаты ПЦР-исследования.
С полученными на этапе экстракции пробами РНК проводится обратная
транскрипция РНК с помощью фермента ТМ-Ревертазы и амплификация участков
кДНК при помощи специфичных к этим участкам праймеров и фермента Taq-
полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые
олигонуклеотиды, которые гибридизуются с комплементарным участком
амплифицируемой кДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание
интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление
специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности
флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется
непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции
флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
На этапе ОТ-ПЦР одновременно в одной пробирке проводятся 2 реакции -
амплификация кДНК Yellow fever virus, а также амплификация последовательности
кДНК BKO-FL. Результаты амплификации кДНК Yellow fever virus и кДНК BKO-FL
регистрируются по 2 различным каналам флуоресцентной детекции:
--- стр. 5 ---
Таблица 1
Канал для флуорофора FAM JOE
кДНК-мишень кДНК BKO-FL кДНК Yellow fever virus
Область амплификации
Искусственная
нуклеотидная
последовательность
5’-некодирующая область
и часть генома, кодирующая
нукпеопротеин (5’-UTR-C-6enoK)
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ
Набор реагентов выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1: «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F
Форма 2: «ПЦР-комплект» вариант FRT-L
Формы комплектации 1 и 2 предназначены для проведения обратной
транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени» и позволяют выявлять РНК в
качественном формате. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо
использовать комплекты реагентов для экстракции РНК, рекомендованные
Производителем.
Форма комплектации 1 рассчитана на проведение 55 реакций обратной
транскрипции и амплификации, включая контроли. Форма комплектации 2
рассчитана на проведение 48 реакций обратной транскрипции и амплификации,
включая контроли.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики:
Аналитическая чувствительность (предел обнаружения)
Таблица 2
Вид
исследуемого
материала
Объем
образца для
экстракции,
мкп
Комплект для
экстракции
РНК
Комплект для
амплификации
Аналитическая
чувствительность
(предел
обнаружения),
копий/мл
Плазма крови 100
«РИБО-преп»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
1000
Комары
(гомогенат) 100
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
1000
Моча 100
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
1000
Слюна 100
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
1000
--- стр. 6 ---
Вид
исследуемого
материала
Объем
образца для
экстракции,
мкл
Комплект для
экстракции
РНК
Комплект для
амплификации
Аналитическая
чувствительность
(предел
обнаружения),
копий/мл
Тканевой
(аутопсийный,
биопсийный)
материал
100
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
5000
Плазма крови
200
«МАГНО-сорб»
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
1000
1000
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
100
Моча 1000
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F,
FRT-L
500
Данный предел обнаружения достигается при соблюдении правил, указанных в
разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и
«Подготовка исследуемого материала к экстракции РНК».
Аналитическая специфичность
Набор реагентов обнаруживает фрагменты РНК вируса желтой лихорадки:
вакцинный штамм вируса желтой лихорадки 17-D, штамм Bwamba 1441 Nyamande
207, штамм Кинтампо.
Аналитическая специфичность набора реагентов доказана при исследовании
штаммов гетерологичных флавивирусов, которые могут присутствовать в
исследуемых образцах и давать ложноположительные результаты на вирус желтой
лихорадки: DENV (Dengue virus, вирус денге, штамм вируса денге 1 типа DENV-
1/8/Tailand/01/2013), штамм вируса денге 2 типа DENV-2/131/Philippines/12/2013),
штамм вируса денге 3 типа DENV-3/25/Thailand/01/2013); штамм вируса денге 4 типа
DENV-4/122/Vietnam/11/2013), WNV ( West Nile virus, вирус Западного Нила, ВЗН;
штаммы Ед-101 и LEIV-Vlg99-27889-human), JEV (Japanese encephalitis virus, вирус
японского энцефалита, ВЯЭ, штамм Накаяма), TBEV ( Tick-borne encephalitis virus,
вирус клещевого энцефалита, ВКЭ; штаммы Абсеттаров, Обор-4, Айна), LGT (Langat
virus, вирус Лангат; штамм TP-21), POWV (Powassan virus, вирус Повассан; штамм
Баере), OHFV (Omsk hemorrhagic fever virus, вирус Омской геморрагической
лихорадки, ОГЛ; штаммы Голошубин, Веселовка-752,Крутинка-73/640).
А также был использован штамм вируса Чикунгунья ( CHIKV), который при
инфицировании человека дает сходную клиническую картину заболевания (штамм
Ross late).
стр. 6 из 34
--- стр. 7 ---
Геномная ДНК человека, выделенная из плаценты, образцов плазмы крови,
слюны и мочи, и образцы ДНК комаров Aedes albopictus были использованы для
доказательства отсутствия перекрёстных реакций с ДНК-материалом пациента и
комаров.
При тестировании образцов РНК штаммов вируса желтой лихорадки во всех
случаях был получен положительный результат.
При тестировании кДНК/ДНК вышеперечисленных организмов, ДНК человека и
комаров неспецифических реакций выявлено не было.
Информация об известных интерферирующих соединениях указана в разделе.
«Интерферирующие вещества и ограничения по использованию проб исследуемого
материала».
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Таблица 3
Результаты тестирования набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс® Yellow fever virus-FL в сравнении с референтным набором
реагентов методом ПЦР
♦
Были использованы: 50 образцов плазмы крови, 50 образцов мочи, 50 образцов
слюны, а также 50 образцов тканевого (аутопсийного, биопсийного) материала и 50
образцов суспензий пулов комаров Aedes albopictus, для которых получены
отрицательные результаты с использованием наборов реагентов АмплиСенс® Yellow
fever virus-FL и ОМ-Скрин-денге/ЖЛ-РВ (ЗАО «Синтол», Россия). Из вышеуказанных
2 В качестве референтного набора использовался набор реагентов для выявления и идентификации
РНК вирусов денге и желтой лихорадки методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
ОМ-Скрин-денге/ЖЛ-РВ (ЗАО «Синтол», Россия), РУ № РЗН 2016/4879 от 07.10.2016 г.
Тип образцов
Результаты исследования набора
реагентов для диагностики in
vitro АмплиСенс® Yellow fever
virus-FL
Результаты
референтным на(
сравнения с
эором реагентов2
положительных отрицательных
Плазма крови
Всего
исследовано
150 образцов
положительных 100 0
отрицательных 0 50
Моча
Всего
исследовано
130 образцов
положительных 80 0
отрицательных 0 50
Слюна
Всего
исследовано
110 образцов
положительных 60 0
отрицательных 0 50
Тканевой
(аутопсийный,
биопсийный)
материал
Всего
исследовано 80
образцов
положительных 30 0
отрицательных 0 50
Комары
Всего
исследовано 80
образцов
положительных 30 0
отрицательных 0 50
стр. 7 из 34
--- стр. 8 ---
образцов биологического материала были приготовлены модельные пробы,
контаминированные штаммами вируса желтой лихорадки: 17D, Bwamba 1441
Nyamande 207, Кинтампо в концентрациях, соответствующих аналитической
чувствительности набора реагентов АмплиСенс® Yellow fever virus-FL и ОМ-Скрин-
денге/ЖЛ-РВ (ЗАО «Синтол», Россия) согласно Таблице 4.
Таблица 4
Вид
исследуемого
материала
Штаммы вируса
желтой лихорадки
Концентрация
модельной
пробы,
копий/мл
Количество
проб
Общее количество
контаминированных
(модельных) проб
Плазма крови
17-D 103 20
100
Bwamba 1441
Nyamande 207 103 40
Bwamba 1441
Nyamande 207 ю2 20
Кинтампо 103 20
Моча
17-D 103 20
80
Bwamba 1441
Nyamande 207 103 20
Bwamba 1441
Nyamande 207 5*102 20
Кинтампо 103 20
Слюна
17-D 103 20
60Bwamba 1441
Nyamande 207 103 20
Кинтампо 103 20
Тканевой
(аутопсийный,
биопсийный)
материал
17-D 5*103 10
30Bwamba 1441
Nyamande 207 5*103 10
Кинтампо 5*103 10
Комары
(суспензии
комаров Aedes
albopictus)
17-D 103 10
30Bwamba 1441
Nyamande 207 103 10
Кинтампо 103 10
стр. 8 из 34
--- стр. 9 ---
Таблица 5
Диагностические характеристики набора реагентов
для диагностики in vitro АмплиСенс® Yellow fever virus-FL
Тип образцов
Диагностическая
чувствительность3
(с доверительной
вероятностью 90 %),
в интервале, %
Диагностическая
специфичность4,
(с доверительной
вероятностью 90 %),
в интервале, %
Плазма крови 97,5-100 95-100
Моча 96,5-100 95-100
Слюна 96-100 95-100
Комары 91 - 100 95-100
Тканевой (аутопсийный,
биопсийный) материал 91 - 100 95-100
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-
эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 «Безопасность работ с
микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)»5, СП 1.3.2322-08
«Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-
эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и
методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с
материалом, содержащим микроорганизмы I— IV групп патогенности».
3 Относительно использованного референтного набора реагентов для искусственно
контаминированных образцов.
4 Относительно использованного референтного набора.
5 В соответствии с п.2.1.6 СП 1.3.3118-13, диагностика молекулярно-генетическими методами (без
накопления возбудителя) по детекции в клиническом материале возбудителей инфекционных
болезней могут проводиться в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о
возможности проведения работ с микроорганизмами III группы патогенности в соответствии с
требованиями санитарных правил "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами", утвержденных постановлением Главного государственного врача
Российской Федерации от 28.01.2008 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 21 февраля 2008 г. N
11197). Исследования по детекции нуклеиновых кислот проводятся в боксированных помещениях,
оборудованных системами приточной и вытяжной вентиляции или боксах микробиологической
безопасности II класса. Материал для исследований подлежит предварительной обработке в
соответствии методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы I—IV групп патогенности».
--- стр. 10 ---
При работе необходимо всегда выполнять следующие требования:
- Рассматривать исходные исследуемые образцы биологического материала как
инфекционно-опасные.
- Инактивировать исходные исследуемые образцы биологического материала в
соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реагенты в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
- Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также
использованные реагенты, упаковку6, биологический материал, включая
материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом,
следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими
отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
- Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром7. Одноразовую пластиковую посуду
(пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер,
содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для
обеззараживания медицинских отходов.
- Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР,
до начала и после завершения работ необходимо подвергать
ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.
- Набор реагентов предназначен для одноразового применения для проведения
ПЦР-исследования указанного количества проб (см. раздел «Состав»),
- Набор реагентов готов к применению согласно данной инструкции. Применять
набор строго по назначению.
6 Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты,
упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г.
'Для удаления надосадочной жидкости в процессе экстракции с помощью вакуумного отсасывателя
используются одноразовые наконечники без фильтра.
стр. 10 из 34
--- стр. 16 ---
Комары
Собранный материал разбирают в лаборатории по видам, полу, местам и датам
сбора и помещают в сухие чистые пробирки объемом 2,0 мл. При объединении
комаров в пулы число особей в одном пуле не должно превышать 50.
Допускается хранение материала после разбора и формирования проб:
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 месяца;
- при температуре не выше минус 68 °С или в сосуде Дюара с жидким азотом -
длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ РНК
Образцы плазмы крови не требуют предварительной подготовки.
Образцы мочи требуют предварительной подготовки, если на исследование
предоставлены образцы мутной мочи. В этом случае в пробирки объемом 1,5 мл
отобрать по 1200 мкп мочи. Центрифугируют пробы при 10 000 g (например,
12 000 об/мин для микроцентрифуги типа «Эппендорф») в течение 1 мин. 100 мкп
полученной осветленной мочи используют для экстракции РНК с использованием
комплекта реагентов «РИБО-преп» или 1000 мкл осветленной мочи используют для
экстракции РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб». Если
материал будет исследован позже, чем через 1 сутки после забора, необходимо
перенести по 1100 мкл мочи в несколько пробирок объемом 1,5 мл. Если
предполагается экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп»,
в пробирки с 1100 мкл мочи внести глицерин в объеме 10 % от объема пробы (120 мкл),
перемешать на вортексе для равномерного распределения глицерина. Если
предполагается экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-
сорб», глицерин в мочу не вносить, моча замораживается без глицерина.
Допускается хранение образцов материала с глицерином и без глицерина:
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Образцы (аутопсийного, биопсийного) материала требуют предварительной
подготовки.
Для экстракции РНК берут 30-50 мг (мкл) материала и гомогенизируют его
растиранием с использованием предварительно охлаждённых стерильных
фарфоровых ступок и пестиков или с помощью гомогенизатора. Из растёртой ткани
готовят 10% суспензию на охлаждённом стерильном физиологическом растворе или
фосфатном буфере. Для этого на 1 объём растёртой ткани добавляют 9 объёмов
--- стр. 17 ---
физиологического раствора или фосфатного буфера. Центрифугируют пробы при
10 000 g (например, 12 000 об/мин для микроцентрифуги типа «Эппендорф») в
течение 1 мин. 100 мкп полученной осветленной суспензии используют для
экстракции РНК.
Допускается хранение предварительно обработанных образцов биопсийного
материала до проведения ПЦР-исследования:
- при температуре от минус 24 до минус 16°С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Комары требуют предварительной подготовки.
Предварительно формируют пулы комаров (не более 50 особей). Комаров
гомогенизируют в стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере из
расчета 1 комар - 30 мкл раствора. Центрифугируют пробы при 10 000 g (например,
12 000 об/мин для микроцентрифуги типа «Эппендорф») в течение 1 мин. Затем
отбирают 100 мкл надосадочной жидкости для экстракции РНК.
Для приготовления суспензий комаров используют стерильную фарфоровую
чашку и стерильный пестик. При наличии автоматического гомогенизатора
(например, Tissue Lyser LT) применяют следующие параметры для гомогенизации
комаров (диаметр шариков - 5 мм; частота - 50 Гц/с; время гомогенизации - 5 мин;
объем буфера - 700 мкл (пул из 25 комаров), 1500 мкл (пул из 50 комаров).
Допускается хранение предварительно обработанных комаров до проведения
ПЦР-исследования:
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Слюна требует предварительной подготовки.
Перед экстракцией нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение
слюны, используя реагент «МУКОЛИЗИН». В емкость со слюной добавляют
«МУКОЛИЗИН» в соотношении 1:3 (1 часть слюны к 3 частям «МУКОЛИЗИНА»),
ориентируясь по градуировке емкости. В процессе разжижения слюны (10 минут)
емкость периодически встряхивают на вортексе. Для экстракции РНК используют
100 мкл разжиженной слюны.
Допускается хранение предварительно разжиженной слюны до проведения ПЦР-
исследования:
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
стр. 17 из 34
--- стр. 18 ---
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
ПРОБ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Для исследования не пригодны образцы плазмы крови, взятые в пробирки с
гепарином в качестве антикоагулянта. Гепарин является ингибитором ПЦР («МУ
1.2.2741-10. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Порядок отбора проб для
выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных.
Методические указания»).
Сведения о других интерферирующих веществах при условии соблюдения
правил взятия и предварительной подготовки исследуемого материалах, указанных
в инструкции, отсутствуют.
Для снижения риска получения ложноотрицательного результата из-за наличия в
пробе интерферирующих веществ в наборе реагентов предусмотрено
использование внутреннего контрольного образца (BKO-FL), который добавляется в
каждый биологический образец на этапе экстракции нуклеиновых кислот. По
окончании реакции амплификации наличие сигнала, свидетельствующего о
накоплении фрагментов кДНК BKO-FL, говорит о достаточной эффективности
экстракции нуклеиновых кислот и отсутствии ингибиторов ПЦР.
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
- экстракция РНК из исследуемых образцов,
- обратная транскрипция РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»,
- анализ и интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-
free», «DNase-free».
Для экстракции РНК из разных видов исследуемого материала используются
комплекты реагентов:
- «РИБО-преп» для экстракции РНК из плазмы крови, слюны, мочи, тканевого
(аутопсийный, биопсийный) материала, комаров в соответствии с инструкцией к
используемому комплекту реагентов;
- «МАГНО-сорб» для экстракции РНК из мочи и плазмы крови в соответствии с
стр. 18 из 34
--- стр. 19 ---
инструкцией и методическими рекомендациями к используемому комплекту
реагентов.
Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта реагентов
«РИБО-преп»:
Экстракция РНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии
внутреннего контрольного образца - BKO-FL.
Объем BKO-FL - 10 мкл в каждую пробирку.
Объем исследуемого образца - 100 мкл.
В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 100 мкл ОКО.
В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и
10 мкл ПКО YFV
Объем элюции - 50 мкл.
ВНИМАНИЕ! В случае проведения амплификации с использованием «ПЦР-
комплекта» вариант FRT-L необходимо проводить элюцию РНК в 100 мкл буфера
для элюции.
Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта реагентов
«МАГНО-сорб» для 200 мкл образца:
Экстракция РНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии
внутреннего контрольного образца - BKO-FL.
Объем BKO-FL - 10 мкл в каждую пробирку.
Объем исследуемого образца - 200 мкл.
В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 200 мкл ОКО.
В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 190 мкл ОКО и
10 мкл ПКО YFV
Объем элюции - 50 мкл; при использовании автоматических станций для
экстракции РНК - 100 мкл.
ВНИМАНИЕ! В случае проведения амплификации с использованием «ПЦР-
комплекта» вариант FRT-L необходимо проводить элюцию РНК в 100 мкл буфера
для элюции.
Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта реагентов
«МАГНО-сорб» для 1000 мкл образца:
Экстракция РНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии
внутреннего контрольного образца - BKO-FL.
Объем BKO-FL - 10 мкл в каждую пробирку.
Объем исследуемого образца - 1000 мкл.
В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 1000 мкл ОКО.
стр. 19 из 34
--- стр. 20 ---
В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 990 мкл ОКО и
10 мкл ПКО YFV.
Объем элюции - 50 мкл; при использовании автоматических станций для
экстракции РНК - 100 мкл.
ВНИМАНИЕ! В случае проведения амплификации с использованием «ПЦР-
комплекта» вариант FRT-L необходимо проводить элюцию РНК в 100 мкл буфера
для элюции.
ВНИМАНИЕ! Реакцию ОТ-ПЦР рекомендуется проводить сразу после получения
проб РНК. Допускается хранение проб РНК при температуре от 2 до 8 °С не более 30
мин, при температуре от минус 24 до минус 16 °С не более недели и при
температуре не выше минус 68 °С до года. Допускается только однократное
замораживание-оттаивание проб РНК.
стр. 20 из 34
--- стр. 21 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1 («ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F)
СОСТАВ
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F для обратной
транскрипции РНК и амплификации фрагмента кДНК Yellow fever virus с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»
позволяет проводить ПЦР-исследование в качественном формате. Комплект
реагентов включает:
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ________________________
Реагент Описание Объем, мл Количество
ПЦР-смесь-FL YFV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,6 1 пробирка
ПЦР-буфер-С Прозрачная бесцветная
жидкость 0,3 1 пробирка
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,03 1 пробирка
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,015 1 пробирка
RT-G-mix-2 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,015 1 пробирка
К +YFV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 1 пробирка
К- Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 1 пробирка
ПКО YFV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 1 пробирка
BKO-FL Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 7 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на проведение 55 реакций обратной транскрипции и
амплификации, включая контроли.
Реагенты комплекта упакованы раздельно в соответствии с температурой хранения
(см. раздел «Хранение»), Комплект реагентов состоит из 2-х частей: 1) температура
хранения от 2 до 8 °С; 2) температура хранения от минус 24 до минус 16 °С.
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Выбор пробирок для проведения ОТ-ПЦР зависит от используемого
амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени».
Форма 1: |r EF| R246(1); Форма 2: |REF| R246(2)-Ly / |VERj 29.06.17 / стр. 21 из 34
--- стр. 22 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А. Подготовка пробирок для ОТ-ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкп, включая объем пробы РНК - 10 мкп.
1. Рассчитать количество каждого реагента, требующееся для приготовления
реакционной смеси. На одну реакцию требуется 10 мкл ПЦР-смеси-FL YFV, 5 мкл
ПЦР-буфера-С, 0,5 мкл полимеразы (TaqF), 0,25 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv),
0,25 мкл RT-G-mix-2. Смесь готовить на общее число исследуемых и контрольных
образцов (количество контрольных образцов см. в пункте 7) плюс запас на одну
реакцию.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно
перед проведением ПЦР-исследования.
2. Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-FL YFV. Перемешать содержимое всех
реагентов ПЦР-комплекта, осадить капли на вортексе.
3. В отдельной пробирке подготовить реакционную смесь. Смешать необходимое
количество: ПЦР-смеси-FL YFV, ПЦР-буфера-С, полимеразы (TaqF), ТМ-
Ревертазы (MMIv), RT-G-mix-2,осадить капли на вортексе.
4. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для ОТ-ПЦР РНК
исследуемых и контрольных проб.
5. Внести в каждую пробирку по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить.
6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб РНК, полученных в
результате экстракции из исследуемых образцов.
ВНИМАНИЕ! При добавлении проб РНК, экстрагированных с помощью комплектов
реагентов для проведения экстракции методом магнитной сепарации, необходимо
избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
7. Поставить контрольные реакции.
а) положительный контроль ОТ-ПЦР (К+) - в пробирку с реакционной смесью
внести 10 мкл К+ YFV.
б) отрицательный контроль ОТ-ПЦР (К-) - в пробирку с реакционной смесью
внести 10 мкл К-.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО.
стр. 22 из 34
--- стр. 25 ---
положительным. При получении отрицательного результата в повторной постановке
образец считать сомнительным и рекомендовать повторное взятие материала для
анализа.
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct указаны во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и ОТ-ПЦР РНК в
соответствии с табл. 9 и вкладышем, прилагаемым к набору реагентов.
Таблица 9
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
*
ФОРМА КОМПЛЕНСТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ_________________________
Возможные ошибки:
1. Для положительного контроля ОТ-ПЦР (К+) значение порогового цикла (Ct) по
каналам для флуорофоров FAM и/или JOE отсутствует или превышает граничное
значение. Необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов,
в которых не обнаружена специфическая РНК.
2. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла (Ct) по
каналу для флуорофора JOE отсутствует или превышает граничное значение.
Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции РНК, для
всех образцов.
3. Для отрицательного контроля экстракции (ОК) по каналу для флуорофора JOE
определено значение порогового цикла (Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая РНК, начиная с этапа экстракции РНК.
4. Для отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров FAM
Контроль Контролируемый этап ПЦР-
исследования
Значение порогового
флуорос
цикла по каналу для
[юра (Ct)
FAM JOE
ПК Экстракция РНК Определено меньше
граничного
Определено меньше
граничного
ОК Экстракция РНК Определено меньше
граничного Отсутствует
К- ОТ-ПЦР Отсутствует Отсутствует
К+ ОТ-ПЦР Определено меньше
граничного
Определено меньше
граничного
стр. 25 из 34
--- стр. 26 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
и/или JOE определено значение порогового цикла ( Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая РНК.
5. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на
графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального
подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию).
Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или
параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном
уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести
амплификацию и детекцию для этого образца.
*
стр. 26 из 34
--- стр. 27 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2 («ПЦР-комплект» вариант FRT-L)
СОСТАВ
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-L для обратной транскрипции
РНК и амплификации фрагмента кДНК Yellow fever virus с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» позволяет проводить
ПЦР-исследование в качественном формате. Комплект реагентов включает:
Реагент Описание Объем, мл Количество
ПЦР-смесь YFV-Lyo Порошок белого цвета - 48 пробирок
объемом 0,2 мл
К+ YFV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 1 пробирка
К- Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 1 пробирка
ПКО YFV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 1 пробирка
BKO-FL Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 7 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на проведение 48 реакций обратной транскрипции и
амплификации, включая контроли.
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А. Подготовка пробирок для ОТ-ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы РНК - 25 мкп.
1. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с готовой
лиофилизированной реакционной ПЦР-смесь VFV-Lyo для проведения ОТ-ПЦР
РНК исследуемых и контрольных образцов (количество контрольных образцов см. в
пункте 3.
2. В подготовленные пробирки внести по 25 мкл проб РНК, полученных в
результате экстракции из исследуемых образцов.
--- стр. 28 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
ВНИМАНИЕ! При добавлении проб РНК, экстрагированных с помощью комплектов
реагентов для проведения экстракции методом магнитной сепарации, необходимо
избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
3. Поставить контрольные реакции.
а) положительный контроль ОТ-ПЦР (К+) - в пробирку с реакционной смесью
внести 25 мкл К+ YFV.
б) отрицательный контроль ОТ-ПЦР (К-) - в пробирку с реакционной смесью
внести 25 мкл К-.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ОКО.
г) положительный контроль экстракции (ПК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ПКО YFV.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
ВНИМАНИЕ! Провести ОТ-ПЦР сразу после соединения реакционной смеси и РНК-
пробы и контролей. Время внесения проб в реакционную смесь и запуск реакции на
приборе не должно превышать 10-15 минут.
Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени»
1. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального
времени» для выполнения соответствующей программы амплификации и
детекции флуоресцентного сигнала (см. табл. 10).
Таблица 10
Единая программа амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
«АмплиСенс» для приборов роторного10 и планшетного11 типа
Цикл Температура, °С Время
Детекция
флуоресцентного
сигнала по каналам
для флуорофоров
Количество
циклов
1 50 15 мин - 1
2 95 15 мин - 1
3 95 Юс - 4560 20с FAM, JOE
10 Например, Rotor-Gene Q (QIAGEN) и другие, рекомендованные Производителем.
11 Например, CFX 96 (Bio-Rad) и другие, рекомендованные Производителем.
--- стр. 30 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Таблица 12
Интерпретация результатов анализа исследуемых образцов
Значение порогового цикла по каналу для флуорофора (Ct)
Результат
FAM JOE
Определено меньше
граничного Отсутствует РНК Yellow fever virus
НЕ обнаружена
Определено
или отсутствует* Определено меньше граничного РНК Yellow fever virus
обнаружена
Отсутствует или
определено больше
граничного
Отсутствует или определено
больше граничного Невалидный**
Определено меньше
граничного Определено больше граничного Сомнительный***
* Отсутствие сигнала по каналу для флуорофора FAM несущественно, если РНК
Yellow fever virus обнаружена.
** В случае получения невалидного результата необходимо провести повторное
ПЦР-исследование соответствующего исследуемого образца, начиная с этапа
экстракции РНК.
*** В случае получения сомнительного результата необходимо провести повторное
ПЦР-исследование соответствующего исследуемого образца, начиная с этапа
экстракции. В случае повторения аналогичного результата образец считать
положительным. При получении отрицательного результата в повторной постановке
образец считать сомнительным и рекомендовать повторное взятие материала для
анализа.
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct указаны во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и ОТ-ПЦР РНК в
соответствии с табл. 13 и вкладышем, прилагаемым к набору реагентов.
--- стр. 31 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Таблица 13
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль Контролируемый этап
ПЦР-исследования
Значение порогового цикла по каналу для
флуорофора (Ct)
FAM JOE
ПК Экстракция РНК Определено меньше
граничного
Определено меньше
граничного
ОК Экстракция РНК Определено меньше
граничного Отсутствует
К- ОТ-ПЦР Отсутствует Отсутствует
К+ ОТ-ПЦР Определено меньше
граничного
Определено меньше
граничного
Возможные ошибки:
1. Для положительного контроля ОТ-ПЦР (К+) значение порогового цикла (СО по
каналам для флуорофоров FAM и/или JOE отсутствует или превышает граничное
значение. Необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов,
в которых не обнаружена специфическая РНК.
2. Для отрицательного контроля экстракции (ОК) по каналу для флуорофора JOE
определено значение порогового цикла ( Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая РНК, начиная с этапа экстракции РНК.
3. Для отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров FAM
и/или JOE определено значение порогового цикла {Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая РНК.
4. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на
графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального
подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию).
Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или
параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном
уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести
амплификацию и детекцию для этого образца.
стр. 31 из 34
--- стр. 32 ---
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не
подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 5 сут. в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, всеми
видами крытых транспортных средств. Допускается транспортирование при
температуре от 2 до 25 °С не более 3 сут.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F и вариант FRT-L при
получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами
хранения.
Хранение.
Форма комплектации 1. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F
хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь-FL YFV,
ПЦР-буфер-С, полимеразу (TaqF), ТМ-Ревертазу (MMIv), RT-G-mix-2 хранить в
морозильной камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С. ПЦР-смесь-FL
YFV хранить в защищенном от света месте.
Форма комплектации 2. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-L хранить
в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. Лиофилизированные реагенты
ПЦР-смесь YFV-Lyo хранить в пакетах с влагопоглотителем, в защищенном от света
месте.
Холодильные и морозильные камеры должны обеспечивать регламентированный
температурный режим.
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ
Производитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик
набора реагентов, требованиям, указанным в технической и эксплуатационной
документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий
транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество набора реагентов направлять по адресу 111123,
г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-mail: cs@pcr.ru)12.
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению
12 Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amplisens.ru .
--- стр. 33 ---
набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских
работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется
направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную
государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по
надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим
законодательством.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Е.Н. Родионова
Генеральный директор
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора .А. Максютов
f
стр. 33 из 34
--- стр. 35 ---
--- стр. 36 ---
ФБУН «ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека
111123, Москва, ул. Новогиреевская ЗА тел. (495) 974-96-46, Факс : (495) 305-54-23. e-mail: obtk@Pcr.ru
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА
Набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс® Y e llo w fe v e r v ir u s -F L
Форма 1 LOT 16.05.17
jwf] 2017-05-16
2018-05-16
Т У 2 1 . 2 0 . 2 3 . 1 1 0 - 2 4 6 - 0 1 8 9 7 5 9 3 - 2 0 1 7
К о м п л е к т н о с т ь , у п а к о в к а и м а р к и р о в к а н а б о р а у к а з а н н о й с е р и и с о о т в е т с т в у ю т т р е б о в а н и я м Т У .
Наименование показателя Норма Результаты контроля
П о л о ж и т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а П К
( П К О YFV) ( п о л о ж и т е л ь н ы й к о н т р о л ь
э к с т р а к ц и и )
О п р е д е л е н о з н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о
к а н а л а м д л я ф л у о р о ф о р о в F A M и J O E
с о о т в е т с т в у е т
О т р и ц а т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а О К
( о т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь э к с т р а к ц и и )
З н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о к а н а л у д л я
ф л у о р о ф о р а F A M . З н а ч е н и е Ct о т с у т с т в у е т п о
к а н а л у д л я ф л у о р о ф о р а J O E
с о о т в е т с т в у е т
О т р и ц а т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а К -
( о т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь О Т - П Ц Р )
З н а ч е н и е Ct о т с у т с т в у е т п о к а н а л а м д л я
ф л у о р о ф о р о в F A M и J O E
с о о т в е т с т в у е т
П о л о ж и т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а К +
( К + YFV) ( п о л о ж и т е л ь н ы й к о н т р о л ь О Т - П Ц Р )
О п р е д е л е н о з н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о
к а н а л а м д л я ф л у о р о ф о р о в F A M и J O E
с о о т в е т с т в у е т
Н а б о р р е а г е н т о в д о л ж е н в ы я в л я т ь Р Н К
в и р у с а ж ё л т о й л и х о р а д к и (Yellow fever
virus) в к о н ц е н т р а ц и и 1 0 0 0 к о п и й / м л п р и
э к с т р а к ц и и Р Н К с п о м о щ ь ю « Р И Б О - п р е п »
и з 1 0 0 м к л р а з в е д е н и я с т а н д а р т н о г о
о б р а з ц а п р е д п р и я т и я ( О О П )
О п р е д е л е н о з н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о
к а н а л у д л я ф л у о р о ф о р а J O E
с о о т в е т с т в у е т
2 С о с т а в , в н е ш н и й в и д :
Наименование реагента Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
П Ц Р - с м е с ь - F L YFV П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
П Ц Р - б у ф е р - С П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
П о л и м е р а з а ( T a q F ) П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
Т М - Р е в е р т а з а ( M M I v ) П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
R T - G - m i x - 2 П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
К + YFV П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
К - П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
П К О YFV П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
B K O - F L П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
О К О П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
П Ц Р - с м е с ь YFV - L y o П о р о ш о к б е л о г о ц в е т а с о о т в е т с т в у е т 2
3 . У с л о в и я т р а н с п о р т и р о в а н и я и х р а н е н и я :
Транспортирование. Н а б о р р е а г е н т о в т р а н с п о р т и р о в а т ь п р и т е м п е р а т у р е о т 2 д о 8 ° С н е б о л е е 5 с у т . в
т е р м о к о н т е й н е р а х , с о д е р ж а щ и х х л а д о э л е м е н т ы , в с е м и в и д а м и к р ы т ы х т р а н с п о р т н ы х с р е д с т в . Д о п у с к а е т с я
т р а н с п о р т и р о в а н и е п р и т е м п е р а т у р е о т 2 д о 2 5 ° С н е б о л е е 3 с у т .
К о м п л е к т р е а г е н т о в « П Ц Р - к о м п л е к т » в а р и а н т F R T - 5 0 F и в а р и а н т F R T - L п р и п о л у ч е н и и р а з у к о м п л е к т о в а т ь в
с о о т в е т с т в и и с у к а з а н н ы м и т е м п е р а т у р а м и х р а н е н и я .
Хранение.
Ф о р м а к о м п л е к т а ц и и 1 . К о м п л е к т р е а г е н т о в « П Ц Р - к о м п л е к т » в а р и а н т F R T - 5 0 F х р а н и т ь в х о л о д и л ь н о й к а м е р е п р и
т е м п е р а т у р е о т 2 д о 8 ° С . П Ц Р - с м е с ь - F L YFV, П Ц Р - б у ф е р - С , п о л и м е р а з у ( T a q F ) , Т М - Р е в е р т а з у ( M M I v ) , R T - G - m i x - 2
Форма 1: |REF| R246(1); Форма 2: |REF| R246(2)-Ly
--- стр. 37 ---
х р а н и т ь в м о р о з и л ь н о й к а м е р е п р и т е м п е р а т у р е о т м и н у с 2 4 д о м и н у с 1 6 ° С . П Ц Р - с м е с ь - F L YFV х р а н и т ь в
з а щ и щ е н н о м о т с в е т а м е с т е .
Ф о р м а к о м п л е к т а ц и и 2 . К о м п л е к т р е а г е н т о в « П Ц Р - к о м п л е к т » в а р и а н т F R T - L х р а н и т ь в х о л о д и л ь н о й к а м е р е п р и
т е м п е р а т у р е о т 2 д о 8 ° С . Л и о ф и л и з и р о в а н н ы е р е а г е н т ы П Ц Р - с м е с ь Y F V - L y o х р а н и т ь в п а к е т а х с
в л а г о п о г л о т и т е л е м , в з а щ и щ е н н о м о т с в е т а м е с т е .
Форма 1: |REf| R246(1); Форма 2: |REF| R246(2)-Ly
--- стр. 38 ---
--- стр. 39 ---
ФБУН «ЦЕНТРАЛЬНЫЙ научно -исследовательский институт эпидемиологии »
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека
111123, Москва, ул. Новогиреевская ЗА тел. (495) 974-96-46. Факс : (495) 305-54-23. e-mail: obtk@Pcr.ru
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА
Набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс® Y e llo w fe v e r v ir u s -F L
Форма 2 LOT 16.05.17
|У/Г|
2017-05-16
2018-05-16
Т У 2 1 . 2 0 . 2 3 . 1 1 0 - 2 4 6 - 0 1 8 9 7 5 9 3 - 2 0 1 7
К о м п л е к т н о с т ь , у п а к о в к а и м а р к и р о в к а н а б о р а у к а з а н н о й с е р и и с о о т в е т с т в у ю т т р е б о в а н и я м Т У ,
1 . Т е х н и ч е с к и е х а р а к т е р и с т и к и :
Наименование показателя “ Норма Результаты контроля
П о л о ж и т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а П К
( П К О YFV) ( п о л о ж и т е л ь н ы й к о н т р о л ь
э к с т р а к ц и и )
О п р е д е л е н о з н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о
к а н а л а м д л я ф л у о р о ф о р о в F A M и J O E
с о о т в е т с т в у е т
О т р и ц а т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а О К
( о т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь э к с т р а к ц и и )
З н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о к а н а л у д л я
ф л у о р о ф о р а F A M . З н а ч е н и е C t о т с у т с т в у е т п о
к а н а л у д л я ф л у о р о ф о р а J O E
с о о т в е т с т в у е т
О т р и ц а т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а К -
( о т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь О Т - П Ц Р )
З н а ч е н и е Ct о т с у т с т в у е т п о к а н а л а м д л я
ф л у о р о ф о р о в F A M и J O E
с о о т в е т с т в у е т
П о л о ж и т е л ь н ы й р е з у л ь т а т д л я о б р а з ц а К +
( К + YFV) ( п о л о ж и т е л ь н ы й к о н т р о л ь О Т - П Ц Р )
О п р е д е л е н о з н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о
к а н а л а м д л я ф л у о р о ф о р о в F A M и J O E
с о о т в е т с т в у е т
F i a 6 o p р е а г е н т о в д о л ж е н в ы я в л я т ь P F I K
в и р у с а ж ё л т о й л и х о р а д к и (Yellow fever
virus) в к о н ц е н т р а ц и и 1 0 0 0 к о п и й / м л п р и
э к с т р а к ц и и P F 4 K с п о м о щ ь ю « Р И Б О - п р е п »
и з 1 0 0 м к л р а з в е д е н и я с т а н д а р т н о г о
о б р а з ц а п р е д п р и я т и я ( О О П )
О п р е д е л е н о з н а ч е н и е Ct м е н е е г р а н и ч н о г о п о
к а н а л у д л я ф л у о р о ф о р а J O E
с о о т в е т с т в у е т
2 . С о с т а в , в н е ш н и й в и д :
------------------------~~ * — - -
Наименование реагента Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
П Ц Р - с м е с ь - F L YFV П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
П Ц Р - б у ф е р - С П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
П о л и м е р а з а ( T a q F ) П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
Т М - Р е в е р т а з а ( M M I v ) П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
R T - G - m i x - 2 П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1
К + YFV П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
К - П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
П К О YFV П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
B K O - F L П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
О К О П р о з р а ч н а я б е с ц в е т н а я ж и д к о с т ь с о о т в е т с т в у е т 1 2
П Ц Р - с м е с ь YFV - L y o П о р о ш о к б е л о г о ц в е т а с о о т в е т с т в у е т 2
3 . У с л о в и я т р а н с п о р т и р о в а н и я и х р а н е н и я :
Транспортирование. Н а б о р р е а г е н т о в т р а н с п о р т и р о в а т ь п р и т е м п е р а т у р е о т 2 д о 8 ° С н е б о л е е 5 с у т . в
т е р м о к о н т е й н е р а х , с о д е р ж а щ и х х л а д о э л е м е н т ы , в с е м и в и д а м и к р ы т ы х т р а н с п о р т н ы х с р е д с т в . Д о п у с к а е т с я
т р а н с п о р т и р о в а н и е п р и т е м п е р а т у р е о т 2 д о 2 5 ° С н е б о л е е 3 с у т .
К о м п л е к т р е а г е н т о в « П Ц Р - к о м п л е к т » в а р и а н т F R T - 5 0 F и в а р и а н т F R T - L п р и п о л у ч е н и и р а з у к о м п л е к т о в а т ь в
с о о т в е т с т в и и с у к а з а н н ы м и т е м п е р а т у р а м и х р а н е н и я .
Хранение.
Ф о р м а к о м п л е к т а ц и и 1 . К о м п л е к т р е а г е н т о в « П Ц Р - к о м п л е к т » в а р и а н т F R T - 5 0 F х р а н и т ь в х о л о д и л ь н о й к а м е р е п р и
т е м п е р а т у р е о т 2 д о 8 ° С . П Ц Р - с м е с ь - F L YFV, П Ц Р - б у ф е р - С , п о л и м е р а з у ( T a q F ) , Т М - Р е в е р т а з у ( M M I v ) , R T - G - m i x - 2
|REF| R246(1); Форма 2: 1r Ef|Форма 1: R246(2)-Ly
--- стр. 40 ---
х р а н и т ь в м о р о з и л ь н о й к а м е р е п р и т е м п е р а т у р е о т м и н у с 2 4 д о м и н у с 1 6 ° С . П Ц Р - с м е с ь - F L YFV х р а н и т ь в
з а щ и щ е н н о м о т с в е т а м е с т е .
Ф о р м а к о м п л е к т а ц и и 2 . К о м п л е к т р е а г е н т о в « П Ц Р - к о м п л е к т » в а р и а н т F R T - L х р а н и т ь в х о л о д и л ь н о й к а м е р е п р и
т е м п е р а т у р е о т 2 д о 8 ° С . Л и о ф и л и з и р о в а н н ы е р е а г е н т ы П Ц Р - с м е с ь YFV-Lyo х р а н и т ь в п а к е т а х с
в л а г о п о г л о т и т е л е м , в з а щ и щ е н н о м о т с в е т а м е с т е .
Форма 1: |REF| R246(1); Форма 2: R246(2)-Ly