Набор реагентов для количественного определения ДНК вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени" "АмплиСенс® HBV-Монитор-FL" по ТУ 9398-031-01897593-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
г
список СОКРАЩЕНИИ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ВКО - внутренний контрольный образец
к+ - положительный контроль ПЦР
к- - отрицательный контроль ПЦР
око - отрицательный контрольный образец
ок - отрицательный контроль экстракции '
ПК - положительный контроль экстракции
пко - положительный контрольный образец
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
HBV - вирус гепатита В
HDV - вирус гепатита D («Дельта»)
PRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® НБ\/-Монитор-РЕ» предназначен для
количественного определения ДНК вируса гепатита В {HBV) в клиническом
материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Материалом для
проведения ПЦР служат пробы ДНК, выделенные из плазмы крови.
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплекснойо
диагностике заболевания^
ПРИНЦИП МЕТОДА
Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови
совместно с ВКО, проведении амплификации ДНК с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (формат FRT). По каналу,
соответствующему флуорофору РАМ, детектируется лродукт амплификации ВКО.
По каналу, соответствующ ему флуорофору JOE, детектируется продукт
амплификации ДНК HBV. Положительные контрольные образцы этапа экстракции
U\{0-^-HBV, П КО -2-Н в\/детектирую тся по каналам, соответствующим флуорофорам
РАМ (ВКО) и JOE {HBV). Контрольные образцы амплификации (ДНК-калибраторы) -
КВ1 HBV и КВ2 HBV, а также калибратор HBV-Q (при использовании формы 5)
аналогично детектируются по каналам, соответствующим флуорофорам РАМ (ВКО)
^ в соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.
стр. 3 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 4 ---
т
и JOE {HBV).
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов выпускается в 1 формате.
Формат FRT
Набор реагентов выпускается в 5 формах комплектации;
Форма 1 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб-12», ОКО (4 пробирки), «ПЦР-
комплект» вариант FRT.
Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50, ОКО
(4 пробирки), «ПЦР-комплект» вариант FRT.
Форма 4 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000, ОКО
(8 пробирок), «ПЦР-комплект» вариант FRT - 2 штуки.
Форма 5 включает комплекты реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT, ОКО
(4 пробирки) и «Комплект для калибровки HBV-Q».
Форма 6 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Примечание - Форма 3 удалена.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включающего экстракцию ДНК из клинического материала методом
сорбции на силикагеле и амплификацию ДНК с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включающего экстракцию ДНК из клинического материала методом
преципитации и амплификацию ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
в режиме «реального времени».
Форма комплектации 4 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включающего экстракцию ДНК из клинического материала магнитной
сепарацией и амплификацию ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме «реального времени».
Форма комплектации 5 предназначена для проведения амплификации ДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для
проведения полного ПЦР-исследования необходимо ислользовать комплекты
реагентов для экстракции РНК/ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора.
стр. 4 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 5 ---
г
Форма комплектации 6 предназначена для производственных целей для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 6 используется только в соответствии с
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТИСТИКИ
Линейный диапазон измерения набора реагентов
Вид
клинического
материала
Объём
экстракции, мкл
Комплект для
экстракции ДНК
Линейный диапазон
измерения, МЕ/мл
Плазма крови
100
«РИБО-сорб-12»
«РИБО-преп» ■
NucliSENS easyM AG
1 5 0 - 100 000 000
200 «М АГНО -сорб» 7 5 - 100 000 000
1000 «М АГНО -сорб»
NucliSENS easyM AG 1 5 - 100 000 000
I
Г
Аналитическая специфичность
Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством
добавления в реакцию геномной РНК/ДНК следующих организмов и вирусов: вирус
гепатита А, вирус гепатита D, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека,
цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус
ветряной оспы, вирус герпеса человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого
энцефалита, вирус лихорадки западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae. Homo
sapiens.
Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не
были.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей
инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СП
1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами»
и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом,
содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
стр. 5 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 6 ---
♦
При работе необходимо всегда выполнять следующие требования:
- Температура в помещении лаборатории от 20 до 28 °С, относительная влажность
от 15 до 75%.
- Рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать
работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами II1-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней».
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы, используя дезинфицирующие
средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами
I11-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование
и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса.
- Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также
использованные реагенты, упаковку^, биологический материал, включая
материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом,
следует удалять в соответствии с СанПиН ,2.1.7.2790-10 «Санитарно-
эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
- Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром^. Одноразовую пластиковую посуду
(пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер,
содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано
для обеззараживания медицинских отходов.
- Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка
ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать
ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.
- Набор реагентов предназначен для одноразового применения для проведения
^ Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты,
упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г.
^ Для удаления надосадочной жидкости с помощью вакуумного отсасывателя используются одноразовые
наконечники без фильтра.
стр. 6 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 7 ---
г
i
ПЦР-исследования указанного количества проб (см. раздел «Состав»),
- Набор реагентов готов к применению согласно данной инструкции. Применять
набор реагентов строго по назначению.
- К работе с набором реагентов допускается только персонал, обученный
методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-
* диагностической лаборатории в установленном порядке (СП I*.3.2322-08
«Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней»).
- Не использовать набор реагентов, если нарушена внутренняя упаковка или
внешний вид реагента не соответствует описанию.
- Не использовать набор реагентов, если не соблюдались условия
транспортирования и хранения согласно инструкции.
- Не использовать набор реагентов по истечении срока годности.
- Использовать одноразовые неопудренные перчатки, лабораторные халаты,
защищать глаза во время работы с образцами и реагентами. Тщательно
вымыть руки по окончании работы. Все операции проводятся только в
перчатках для исключения контакта с организмом человека.
- Избегать вдыхания паров, контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой.
Вреден при проглатывании. При контакте немедленно промыть пораженное
место водой, при необходимости обратиться за медицинской помощью.
- При соблюдении условий транспортировки, эксплуатации и хранения риски
взрыва и возгорания отсутствуют.
- Листы безопасности реагентов (SDS - safety data sheet) доступны по запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
ЗОНА 1. Экстракция ДНК из клинического материала
1. Ламинарный бокс.
2. Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема.
4. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл.
5. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл.
6. Штативы для наконечников и пробирок объемом 1,5 мл.
7. Холодильник от 2 до 8 °С.
8. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
9. Емкость с дезинфицирующим раствором.
стр. 7 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 8 ---
»
При использовании комплекта реагентов «РИБО-сорб-12» или «РИБО-преп» (РУ №
ФСР 2008/03147):
1. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
2. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 12 тыс д.
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости. >
4. Одноразовые наконечники до 200 мкл.
5. Одноразовый флакон на 10-20 мл.
При использовании комллекта реагентов «МАГНО-сорб» (РУ № ФСР 2010/07265):
1. Термостат для пробирок объемом 5 мл, диаметром 12 мм от 25 до 100 °С.
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
3. Магнитный штатив для пробирок типа «Эппендорф» на 1,5 мл.
4. Магнитный штатив для пробирок на 5 мл, диаметр 12 мм.
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости.
6. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл.
7. Одноразовые полипропиленовые или полистирольные лробирки объемом до 5 мл
диаметром 12 мм, круглодонные.
8. Одноразовые полипропиленовые крышки для пробирок объемом до 5 мл
диаметром 12 мм.
9. Автоматический дозатор переменного объема с возможностью дозирования от
1000 до 5000 мкл.
10.Одноразовые наконечники до 200 мкл, до 1000 мкл и до 5000 мкл.
При использовании автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот:
1. Автоматическая станция для экстракции РНК/ДНК (например, NucliSENS
easyMAG (bioMerieux, Франция)).
2. Набор реактивов и расходных материалов к автоматической станции (например
NucliSENS easyMAG (NucliSens буфер для экстракции 1, NucliSens буфер для
экстракции 2, NucliSens буфер для экстракции 3, NucliSens буфер для лизиса,
NucliSens магнетизированная силика) (bioMerieux, Франция)).
ЗОНА 2. ПЦР и гибридизационно-флуоресцентная детекции продуктов
амплификации
1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
2. Центрифуга/вортекс.
стр. 8 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 9 ---
г
3. Автоматические дозаторы переменного объема.
4. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл в штативах.
5. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с
используемыми комплектами реагентов).
6. Холодильник от 2 до 8 °С.
7. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
8. Емкость для сброса наконечников.
9. Программируемый амплификатор роторного типа (например, Rotor-Gene 3000
или 6000 (Corbett Research, Австралия)) или амплиф икатор планшетного типа
(например, iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), МхЗОООР (Stratagene, США)) и
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в
методических рекомендациях по применению данного набора реагентов.
10.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл:
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой - при
использовании прибора планшетного типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой - при
использовании прибора роторного типа.
К
f
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями
«Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-
диагностики», разработанными ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Для проведения ПЦР-исследования используется плазма периферической крови.
Взятие крови проводится утром натощак в пробирку с раствором ЭДТА в качестве
антикоагулянта. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. В
течение 6 ч с момента взятия крови следует отобрать плазму и перенести в новую
пробирку. Для этого пробирку с кровью центрифугируют 20 мин при 800-1600 д.
Хранить плазму можно не более 3 сут при температуре от 2 до 8 °С и длительно -
при температуре не выше минус 68 °С.
В отдельных случаях допускается использование сыворотки крови.
Аналитическая чувствительность набора реагентов для данного материала
сохраняется, однако клиническая чувствительность ввиду соосаждения вирусных
частиц при ретракции сгустка может быть существенно снижена. Хранить сыворотку
можно не более 3 сут при температуре от 2 до 8 °С и длительно - при температуре
не выше минус 68 °С.
стр. 9 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 12 ---
ФОРМАТ FRT
Реагент Описание Объем, мл Кол-во
КВ1 HBV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 4 пробирки
КВ2 HBV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 4 пробирки
Буфер для элюции •
Прозрачная бесцветная
жидкость 1.2 4 пробирки
Комплект реагентов рассчитан на проведение 80 реакций амплификации, включая
контроли и калибраторы.
Входит в состав форм комплектации 1, 2, 5 (в количестве 1-й шт.), 4 (в количестве 2-х
шт.).
К комплекту реагентов «ПЦР-комплект» прилагаются контрольные образцы этапа
экстракции:
Реагент Описание Объем, мл Кол-во
UKO-^-HBV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,06 4 пробирки
ПКО-2-HBV Прозрачная бесцветная
жидкость 0,06 4 пробирки
ВКО STI-87 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,28 4 пробирки
В составе формы комплектации 5 к «ПЦР-комплекту» прилагается следующий
реагент:
Реагент „ Описание Объем, мл Кол-во
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 4 пробирки
Комплект реагентов «Комплект для калибровки HBV-Q» включает:
Реагент Описание Объем, мл Кол-во
Калибратор HBV-Q Порошок желтого цвета 1 пробирка
Растворитель Q Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 3 пробирки
Входит в состав формы комплектации 5.
К набору реагентов прилагается на цифровом носителе или находится на
официальном сайте Изготовителя программное обеспечение Am pliSens Soft Monitor
FRT (в формате Microsoft® Excel) для автоматической обработки результатов.
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
- Экстракция ДНК из исследуемых образцов.
стр. 12 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 13 ---
тФОРМАТ FRT
- Проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме «реального времени».
- Анализ и интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! Для работы с ДНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Для экстракции ДНК используются комплекты реагентов, рекомендованные ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора;
- при использовании комплекта реагентов «РИБО-сорб-12» порядок работы см. в
приложении 1. «Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-
сорб-12».
- при использовании комплекта реагентов «РИБО-преп» порядок работы см. в
приложении 2. «Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «РИБО-
преп».
- при использовании автоматической станций для экстракции нуклеиновых кислот
NucliSENS easyMAG (BioMerieux, Франция) порядок работы см. в приложении 3.
«Экстракция ДНК с использованием автоматической станций для экстракции
нуклеиновых кислот NucliSENS easyMAG».
- при использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб» порядок работы для
экстракции ДНК из 1000 мкл и 200 мкл плазмы крови см. в приложении 4.
«Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб».
- при использовании комплектов реагентов для экстракции, не входящих в состав
данного набора реагентов, порядок работы см. в приложении 5. «Экстракция ДНК
с использованием комплектов для экстракции не входящих в состав данного
набора реагентов».
Также см. методические рекомендации ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора по применению набора реагентов «АмплиСенс® НВУ-М онитор-
FL».
стр. 13 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 14 ---
ФОРМАТ FRT
f
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ»
Общий объем реакционной смеси - 50 мкл, включая объем пробы ДНК -
25 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
А. Подготовка пробирок для амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого
амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно
перед проведением ПЦР-исследования. Смешивать реагенты из расчета на
необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и
контрольных образцов, необходимо согласно расчетной таблице (см. табл. 1).
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты
набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с учетом
количества исследуемых, контрольных образцов (три контроля экстракции, четыре
калибратора). Тип пробирок стрипов или плашек выбрать в зависимости от
используемого прибора.
3. Для приготовления реакционной смеси необходимо в отдельной стерильной
пробирке смешать реагенты из расчета на 1 реакцию: 15 мкл ПЦР-смеси-1-FL
HBV, 10 мкл ПЦР-смеси-2-FRT и 1,0 мкл полимеразы (TaqF). Тщательно
перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
Для 12 (стандартная панель экстракции набором «РИБО-сорб-12») - 16
(экстракция с использованием двух картриджей EasyMag) образцов после
экстракции рекомендуется готовить реакционную смесь на 20 реакций, для этого
в пробирку с ПЦР-смесью-1-FL ЯВ\/ добавить все содержимое пробирки с ПЦР-
смесью-2-FRT и все содержимое пробирки с полимеразой (TaqF). Тщательно
перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
стр. 14 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 15 ---
ФОРМАТ FRT
Приготовленная смесь не хранится.
4. Внести в пробирки по 25 мкл готовой реакционной смеси. Неиспользованные
остатки реакционной смеси выбросить.
5. В готовые пробирки внести по 25 мкл проб ДНК, выделенных из клинических
образцов. Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
ВНИМАНИЕ! При добавлении проб ДНК, выделенных с помощью комплекта
реагентов «РИБО-сорб-12», «МАГНО-сорб» и NucliSENS easyMAG, необходимо
избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
6. Поставить контрольные реакции:
а) положительный контроль экстракции (ПК-1) - внести в пробирку 25 мкл
пробы ДНК, выделенной из образца Г[KO-^-HBV.
б) положительный контроль экстракции (ПК-2) - внести в пробирку 25 мкл
пробы ДНК, выделенной из образца ПКО-2-HBV.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - внести в пробирку 25 мкл ДНК-
пробы, выделенной из образца ОКО.
г) положительный контроль ПЦР (K+i) - внести в две пробирки по 25 мкл
КВ1 HBV.
д) положительный контроль ПЦР (К+г) - внести в две пробирки по 25 мкл
КВ2 HBV
Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать пипетированием,
не допуская появления пузырьков воздуха.
При подозрении на возможную контаминацию также необходима постановка
отрицательного контроля ПЦР (К-). Для этого в пробирку с готовой реакционной
смесью внести 25 мкл буфера для элюции.
стр. 15 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 25 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
i
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
12. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть
крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
13. Центрифугировать при 12 тыс g в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.
14.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
15. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть
крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
16. Центрифугировать при 12 тыс g в течение 2 мин на микроцентрифуге.
17.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
18. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для
подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
19. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе.
Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически
встряхивая на вортексе.
20. Центрифугировать пробирки при 12 тыс g в течение 1 мин на микроцентрифуге.
Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке
реакции обратной транскрипции и ПЦР.
Очищенная ДНК может храниться в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С
или в течение года при температуре не выше минус 16 °С.
стр. 25 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 26 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
i
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Экстракция ДНК с использованием автоматической станции для экстракции
нуклеиновых кислот NucliSENS easyMAG
Порядок работы.
А. Экстракция ДНК из образца объемом 100 мкл и лизис образца вне прибора.
1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции ДНК,
следуя инструкции к прибору.
2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие
параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции ДНК - плазма
(Plasma), объем образца (Volume) - 0,1 ml, объем элюции (Eluate) - 55 mkl, тип
образца (Туре) - Lysed, очередность экстракции ДНК в образцах (Priority) -
Normal.
3. Создать новый протокол экстракции ДНК и сохранить его. В протоколе указать,
что лизис и инкубация образцов происходит вне прибора: On-board Lysis Buffer
Dispensing - No, On-board Lysis Incubation - No.
4. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.
5. В ячейки картриджа, предназначенные для экстракции ДНК в приборе NucliSENS
easyMAG, внести по 450 мкл смеси буфера для лизиса NucliSens.
6. В каждую ячейку добавить “100 мкл исследуемой плазмы отдельным
наконечником с фильтром, тщательно перемешать пипетированием.
7. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1 и
ПК-2). Для этого в ячейку, предназначенную для ПК-1 с буфером для лизиса
NucliSens, добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-HBV, в ячейку,
предназначенную для ПК-2 с буфером для лизиса NucliSens, добавить 90 мкл
ОКО и 10 мкл ПКО-2-HBV, тщательно перемешать пипетированием.
8. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для
этого в ячейку, предназначенную для ОК с буфером для лизиса NucliSens,
добавить 100 мкл ОКО, тщательно перемешать пипетированием.
9. Оставить картридж с образцами на 10 мин при комнатной температуре для
прохождения лизиса.
10. В отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл смешать магнитную силику NucliSens
и ВКО STI-87 одноразовыми наконечниками с фильтрами (см. табл. 5).
стр. 26 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 27 ---
т
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
Таблица 5
Количество образцов Количество
магнитной силики
NucliSens, мкл
Количество Количество
компонента А
«ЕМ-плюс», мклдля экстракции ДНК ВКО STI-87, мкл
1 10 10 10
8 90 90 90
16 170 170 170
24
(полная загрузка прибора)
250
(с запасом на 25 проб) 250 250
I
11. Добавить в каждую ячейку отдельным наконечником по 30 мкл подготовленной
смеси магнитной силики NucliSens и ВКО STI-87. Каждую ячейку тщательно
перемешать пипетированием с помощью дозатора отдельными наконечниками с
фильтрами на 1000 мкл.
12. Загрузить картридж с образцами в прибор, установить наконечники, запустить
программу экстракции ДНК с лизисом образцов вне прибора {Off board).
13. После окончания экстракции ДНК, извлечь картридж из прибора и не позднее
30 мин после окончания процедуры экстракции ДНК провести ПЦР.
Для длительного хранения препарата ДНК необходимо перенести надосадочную
жидкость в стерильную пробирку и хранить в течение 1 нед при температуре от 2 до
8 °С или в течение года при температуре не выше минус 16 °С.
Б. Экстракция ДНК из образца объемом 100 мкл или 1 мл с автоматическим
лизисом образца в приборе.
1. Поставить флакон с буфером для лизиса NucliSens в прибор.
2. В каждую ячейку картриджа, предназначенную для экстракции ДНК в приборе
NucliSENS easyMAG, необходимо добавить 100 мкл или 1 мл исследуемой
плазмы отдельным наконечником с фильтром.
3. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1 и
ПК-2). Для этого в ячейку, предназначенную для ПК-1, добавить 90 мкл ОКО и
10 мкл Г\KO-^-HBV, в ячейку, предназначенную для ПК-2, добавить 90 мкл ОКО и
10 мкл т О -2-HBV.
4. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для
этого в ячейку, предназначенную для ОК, добавить 100 мкл ОКО.
5. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции ДНК,
следуя инструкции к прибору.
6. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие
стр. 27 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 28 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
параметры; название образца, материал {Matrix) для экстракции ДНК - плазма
(Plasma), объем образца (Volume) - 100 mkl или 1 ml, в зависимости от объема
используемого клинического материала, объем элюции (Eluate) - 55 mkl, тип образца
(Tipe) - Primary, очередность экстракции ДНК в образцах (Priority) - Normal.
7. Срздать новый протокол экстракции ДНК и сохранить его. В протоколе указать,
что лизис и инкубация образцов происходит в приборе: On-board Lysis Buffer
Dispensing - Yes, On-board Lysis Incubation - Yes
8. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.
9. Загрузить картридж с образцами в прибор, установить наконечники, запустить
программу экстракции ДНК с лизисом образцов в приборе (On board).
10. Дождаться, пока автоматическая станция NucliSENS easyMAG не остановит
работу в положении Instrument State - Idle (приблизительно 15 мин).
11. В отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл смеш ать магнитную силику
NucliSens и ВКО одноразовыми наконечниками с ф ильтрами (см. табл. 5)
12. Открыть крышку прибора и добавить в каждую ячейку отдельным наконечником
по 30 мкл подготовленной смеси магнитной силики NucliSens и ВКО STI-87
Тщательно перемешать пипетированием с помощью дозатора одноразовыми
наконечниками с ф ильтрами на 1000 мкл.
13. Запустить на приборе программу продолжения экстракции ДНК.
14. После окончания экстракции ДНК, извлечь картридж с образцами из прибора и не
позднее 30 мин после окончания процедуры экстракции ДНК провести ПЦР.
Для длительного хранения препарата ДНК необходимо, не захвытывая сорбент,
перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить в течение 1 нед
при температуре от 2 до 8 °С или в течение года при температуре не выше минус
16 °С.
Набор реагентов при использовании автоматической станции NucliSENS easyMAG
позволяет работать с объемами образцов 0,1 мл или 1 мл.
стр. 28 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 29 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
i
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб»
А. Экстракция из 1000 мкл образца плазмы
Порядок работы.
1. Лизирующий раствор МАГНО-сорб и раствор для отмывки 5 прогреть при
температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.
2. Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок на 5 мл и
одноразовых крышек (включая отрицательный и положительный контроли
экстракции) и промаркировать их.
3. При экстракции ДНК из 24 образцов:
а) во флакон с лизирующим раствором МАГНО-сорб (70 мл) внести 0,28 мл
ВКО STI-87, все содержимое пробирки с компонентом А (0,6 мл) и все
содержимое пробирки с магнетизированной силикой (0,9 мл).
б) закрыть крышку флакона и аккуратно перемешать переворачиванием 5-7 раз,
избегая образования пены.
в) внести в пробирки на 5 мл по 2,6 мл подготовленной смеси лизирующего
раствора МАГНО-сорб, ВКО, компонента А и магнетизированной силики.
4. При экстракции ДНК менее чем из 24 образцов:
а) смешать в отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл ВКО STI-87, компонент
А и магнетизированную силику из расчета на одну точку 10 мкл ВКО STI-87,
20 мкл компонента А и 30 мкл магнетизированной силики. При расчете
необходимо учитывать запас - рассчитывать на одну точку больше, например:
Количество образцов
для экстракции ДНК
ВКО STI-
87, мкл
Компонент А,
мкл
Магнетизированная
силика, мкл
6 70 140 210
12 130 260 390
18 190 380 570
б) внести в пробирки на 5 мл по 60 мкл подготовленной смеси ВКО STI-87,
компонента А и магнетизированной силики.
в) внести в пробирки на 5 мл по 2,6 мл лизирующего раствора МАГНО-сорб.
5. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 1 мл исследуемого
образца плазмы и перемешать пипетированием, закрыть крышкой.
6. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1 и
ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПК-1 с лизирующим раствором
стр. 29 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 32 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
i
на вортексе.
9. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.
10. Перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.
11.Осторожно, по внутренней стенке пробирки отобрать надосадочную жидкость,
ирпользуя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Перенести пробирки в обычный штатив.
12. Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5.
13. Смыть магнетизированную силику вортексированием, а затем осадить капли
кратким центрифугированием.
14. Поставить пробирки в обычный штатив, открыть крышки и переставить в
магнитный штатив. Инкубировать 2 мин.
15.Отобрать надосадочную жидкость и перенести пробирки в обычный штатив.
16. Повторить отмывку раствором для отмывки 5 (пп. 12-15).
17. Аналогично провести одну отмывку 700 мкл раствора для отмывки 6.
18. Добавить 200 мкл раствора для отмывки 7, перемешать, а затем осадить капли
на вортексе. Поставить пробирки в обычный штатив и открыть крышки.
19. Переставить пробирки в магнитный штатив на 1 мин, затем отобрать
надосадочную жидкость.
20. Высушить сорбент, оставив пробирки с открытыми крышками на магнитном
штативе в течение 10 мин.
21. Добавить 70 мкл буфера для элюции и перемешать на вортексе.
22. Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 5 мин, через 2 мин
перемешать на вортексе.
23. Коротко осадить капли на вортексе и переставить пробирки в магнитный штатив.
Инкубировать 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.
ВНИМАНИЕ! Отбор очищенной ДНК для проведения ПЦР осуществляется без
снятия пробирок с магнитного штатива.
Очищенная ДНК может храниться в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С.
Для длительного хранения препарата необходимо, не захватывая сорбент,
перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить при
температуре не выше минус 16 °С в течение года.
стр. 32 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 33 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
i
ПРИЛОЖЕНИЕ 5
Экстракция ДНК с использованием комплектов для экстракции, не входящих в
состав данного набора реагентов
Заявленные аналитические характеристики набора реагентов при работе с
I
ф ормой 5 гарантируются только в случае экстракции ДНК при помощи комплектов
реагентов рекомендованных ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Также см. методические рекомендации ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора по применению набора реагентов «АмплиСенс® НВУ-Монитор-
FL».
В случае, если коэффициент В для используемого комплекта
реагентов/автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот не указан во
вкладыше к набору реагентов «АмплиСенс® Н6У-Монитор-РБ», необходимо провести
калибровку самостоятельно.
Калибровка необходима для определения коэффициента В и производится при
первой постановке набора данной серии. Калибровка осуществляется один раз для
каждой новой серии набора реагентов «АмплиСенс® /-/ВУ-Монитор-РБ» и проводится
на используемом для экстракции ДР1К комплекте реагентов/автоматической станции.
Для проведения калибровки необходимо при первой постановке набора реагентов
данной серии провести анализ 5 дополнительных точек: дополнительный повтор ПКО-
1, дополнительный повтор PIKO-2 и Калибратор HBV-Q в трех повторах.
Подготовка Калибратора HBV-Q к работе:
1. Осадить на вортексе содержимое пробирки, содержащей реагент калибратор
HBV-Q и аккуратно открыть крышку и, избегая распыления содержимого,
добавить 400 мкл растворителя Q, используя одноразовые наконечники с
фильтрами.
2. Плотно закрыть пробирку и оставить на 20 мин при комнатной температуре,
периодически перемешивая на вортексе.
3. После полного растворения открутить содержимое пробирки калибратор HBV-Q
на вортексе в течение 3-5 с для сброса капель жидкости с крышки.
Калибровку необходимо проводить на используемом для экстракции ДР1К
комплекте реагентов. Процедура экстракции ДНК проводится в соответствии с
инструкцией к комплекту реагентов/автоматической станции для экстракции
стр. 33 из 36
50670
13.08.2019
--- стр. 34 ---
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
i
нуклеиновых кислот. Обязательным условием является внесение ВКО в образцы или
лизирующий раствор до начала экстракции в объёме 10 мкл на одну пробу.
В случае если экстракция ДНК проводится из 100 мкл плазмы - внести по 100 мкл
растворенного Калибратора HBV-Q в три пробирки для экстракции нуклеиновых
кислот.
В случае если экстракция ДНК проводится из прочего объема плазмы (100-
1000 мкл) - внести в три пробирки, подготовленные для экстракции ДНК, по 100 мкл
растворенного калибратора HBV-Q и довести растворителем Q объём образца до
используемого объёма экстракции нуклеиновых кислот (например: при экстракции из
1 мл внести 100 мкл растворенного калибратора HBV-Q и 900 мкл растворителя Q).
После окончания экстракции ДНК провести реакцию ПЦР в соответствии сданной
инструкцией.
Средние значения концентрации по каналам РАМ и JOE/HEX, полученные для
трёх повторов Калибратора HBV-Q, использовать в количественных расчетах для
определения коэффициента В по следующей формуле:
число копий ДНК ВКО (канал РАМ) в калибраторе HBV-Q
Коэффициент В = ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ х Коэффициент С
число копий ДНК HBV (канал JOE/HEX) в калибраторе HBV-Q
Коэффициент С указан во вкладыше к данной серии набора реагентов
«АмплиСенс®/-/В\/-Монитор-Р1». "
ВНИМАНИЕ! Вычисленное значение коэффициента В должно укладываться в
диапазон, указанный во вкладыше к набору реагентов «АмплиСенс® Нв\/-М онитор-
FL» данной серии.
Вычисленное значение коэффициента В записать во вкладыш для данной серии
набора реагентов «АмплиСенс® Н6\/-М онитор-Р1» и использовать для расчета
концентрации ДНК HBV в исследуемых и контрольных образцах (см. раздел «Анализ
и интерпретация результатов»).
Также см. методические рекомендации ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора по применению набора реагентов «АмплиСенс® НВУ-Монитор-
FL».
Значения вычисленные для ПКО-1-НВУ и ПКО-2-HBV записать во вкладыш для
данной серии набора реагентов «АмплиСенс® HB\/-MoHHTop-FL», найти среднее
значение для ПКО-1-НВУ и среднее значение для ПКО-2-HBV. Установить диапазон
стр. 34 из 36
50670
13.08.2019