Наборы реагентов для НLA-генотипирования — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 --- 9. Histo type ABC low Реагент для HLA-генотипирования Гисто тайн ABC низкое разрешение 10. Histo type ABDR low Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайн ABDR низкое разрешение 11. Histo type DR/DQB low Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайн DR/DQB низкое разрешение 12. Histo type Celiac Disease low Реагент для HLA-генотипирования Гисто тайн Целиакия низкое разрешение 13. Histo type DRB 1*01 high Реагент для HLA-генотипирования Гисто тайн DRB 1*01 высокое разрешение 14. Histo type DRB 1*03 high Реагент для HLA-генотипирования Гисто тайн DRB1*03 высокое разрешение 15. Histo type DRB 1 *04 Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB1 *04 высокое разрешение 16. Histo type DRB 1 *07/09 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB1 *07/09 высокое разрешение 17. Histo type DRB 1 *08/12 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB1 *08/12 высокое разрешение 18. Histo type DRB 1*11 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB 1*11 высокое разрешение 19. Histo type DRB 1*13 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB 1*13 высокое разрешение 20. Histo type DRB 1 * 14 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB1 * 14 высокое разрешение 21. Histo type DRB 1*15 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп DRB 1*15 высокое разрешение 22. Histo type DRB1*16 high Реагент для HLA-генотипирования Гисто тайп DRB1*16 высокое разрешение 23. Histo type В27 high Реагент для HLA-генотипирования Г исто тайп В27 высокое разрешение 24. HPA-type Реагент для HLA-генотипирования тромбоцитов НРА-тайп 25. Extra Gene Реагент для HLA-генотипирования Экстра Джен --- стр. 4 --- 3. Материал 3.1 Состав наборов - Планшеты HISTO TYPE содержат аликвотные и высушенные реакционные смеси, которые состоят из аллель-специфичных праймеров, праймеров внутреннего контроля (специфичных для человеческого гена G3PDH) и нуклеотидов. Первая реакционная смесь несет на себе метку, и на планшете напечатан номер партии. В некоторых изделиях HISTO TYPE контроль загрязнения находится в последней позиции планшета (см. прилагаемую таблицу специфичности и диаграмму оценки для каждой партии); - реакционные смеси для ПЦР с контролем загрязнения, праймеры внутреннего контроля и специфичные праймеры для амплификации (не разделены, если контроль загрязнения встроен в последнюю позицию тестового планшета). -10 ПЦР-буферов для 20 типирований - Крышки полосок или ПЦР фольга для 20 типирований - Руководство по эксплуатации, таблица специфичности, схема оценки и рабочий бланк 3.2 Требования и дополнительный материал - Taq Полимераза (5 Ед/мкл) - Набор EXTRA-GENE для выделения ДНК из крови / лимфоцитов / лейкоцитов или материал для других методов выделения ДНК - поршневые пипетки (0,5-250 мкл) - стерильные наконечники со встроенными фильтрами - ДНК Амплификатор (например, РТС 200 с нагреваемой и регулируемой крышкой, MJ Research/BioRad) Устройства и материал для электрофореза в геле - ДНК агароза - 0.5 X буфер ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0,5 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты) - бромистый этидий (EtBr) - блок для электрофореза submarine - электропитание (200-300 В, 200 мА) - стандарт длины ДНК Устройства для интерпретации и регистрации - источник УФ излучения (220-310 нм) - камера (например, Polaroid) с пленками (тип Polaroid 667) 3.3 Хранение и стабильность Набор поставляется размороженным. Храните все реактивы при температуре - 20 ... - 80°С в темном месте. Срок годности указан на ярлыке каждого реактива, он действителен также и для открытых реактивов. Срок годности, указанный на внешнем ярлыке, относится к реактиву с самой низкой стабильностью, находящемуся в наборе. Разморозьте 10 X ПЦР-буфер непосредственно перед использованием. 4. Рабочие характеристики Аналитическая чувствительность: Гарантируется надежное типирование при использовании 50-80 нг ДНК на реакционную смесь. Диагностическая специфичность: Состав смеси праймера гарантирует надежную идентификацию НЕА-типов (основанную на данных последней последовательности), указанных на диаграмме оценки. Будет производиться регулярное обновление. --- стр. 5 --- Для каждой партии специфичность каждой смеси праймера была проверена с использованием ДНК по контрольным образцам: каждая ПЦР реакция прошла, по крайней мере, однократную положительную проверку. Аллели, которые не включены и по причине их редкости, не прошли соответствуюшую проверку, показаны на диаграмме оценки или в таблице специфичности. Оценка рабочих характеристик производилась для всех наборов, по крайней мере, с 50 образцами ДНК. Сравнение результатов анализа с другими типированиями, выполненными с SSP комплектами другого поставщика, не выявило никаких несоответствий. 5. Процедура анализа 5.1 Безопасные условия и особые примечания ПЦР является чрезвычайно чувствительным методом и должен выполняться хорошо обученным персоналом, обладающим достаточным опытом в области методов молекулярной генетики и оценки тканевой совместимости. Следует выполнять требования руководягцих принципов в области трансплантации, а также стандарты EFI, что позволит минимизировать риск ложного типирования в конкретном случае несоответствий серологического и молекулярно-генетического методов. Необходимо учитывать особые условия безопасности, что позволит избежать загрязнения и, таким образом, формирования ложной реакции: - При работе используйте перчатки (если это возможно, используйте перчатки без талька). - При использовании пипетки каждый раз берите новые наконечники (со встроенным фильтром). - Используйте отдельные рабочие зоны для предамплификации (вьщеление ДНК и подготовка реакций) и постамплификации (электрофорез в геле, регистрация). Лучше это делать в двух отдельных помегцениях. - Используйте устройства и другие материалы только в соответствующих местах и не меняйте их. 5.2 Выделение ДНК Для HLA-SSP типирования одного пациента требуется 5-10 мкг ДНК (что соответствует приблизительно 0.5 мл крови). Например, набор EXTRA-GENE больше других подходит для выделения, так как чистую ДНК можно получить из цельной крови за короткое время без использования токсичных химикатов или растворителей. Помимо этого, для получения ДНК достаточной чистоты можно использовать и другие методы, типа, хлороформ-триэтил-аммония-бромида (СТАВ) или фенол-хлороформной очистки. Наличие гепарина может ингибировать ПЦР. Поэтому для типирования рекомендуется использовать кровь, обработанную ЭДТА или цитратом. ДНК должна иметь индекс чистоты (коэффициент экстинкции OD 26 0/OD 28 0) между 1.5 и 2.0. 5.3 Амплификация Все аликвотные и высушенные реакционные смеси уже содержат аллель-, контроль- специфичные праймеры и нуклеотиды. Они поставляются высушенными в реакционных сосудах. Параметры амплификации оптимизированы для окончательного объема 10 мкл. 1. : Извлеките требуемое число планшетов HISTO TYPE HLA-SSP из - 20°С и разморозьте 10 X ПЦР-буфер при комнатной температуре. 2. : С помощью пипетки возьмите Основную смесь (Master-Mix), состоящую из 10 х ПЦР- буфера. раствора ДНК, Taq полимеразы и дистиллированной воды, хорошо перемешайте. --- стр. 6 --- Разные наборы HISTO TYPE SSP работают с одной Основной смесью, поэтому их можно объединять. Состав основной смеси в зависимости от числа реакционных смесей приведен в Таблице 1 (стр.6). Если необходимо осуществить контроль загрязнения, получите Основную смесь без раствора ДНК и с помощью пипетки перенесите 10 мкл этого соединения в контроль загрязнения. Впоследствии добавьте раствор ДНК и распределите Основную смесь по предварительно внесенным реакционным смесям. Таблица 1. Состав Основной смеси в зависимости от числа реакционных смесей: Число смесей Диет. вода Буфер 10 хПЦР Раствор ДНК (SO SO нг/мкл) Taq- полимер аза (5 Ед/мкл) Общий объем 1 8 1 1 0.08 10 мкл 4 63 8 8 0,6 80 мкл 8 79 10 10 0.8 100 мкл 16 151 19 19 1.5 190 мкл 24 222 28 28 2.2 280 мкл 30 269 34 34 2.7 340 мкл 32 285 36 36 2.9 360 мкл 48 412 52 52 4.2 520 мкл 54 459 58 58 4.6 580 мкл 56 475 60 60 4.8 600 мкл 72 618 78 78 6.2 780 мкл 80 681 86 86 6.9 860 мкл 96 808 102 102 8.2 1020 мкл - для различных концентраций ДНК, количество ДНК и воды должно отличаться (например, для 24 смесей: 11,7 мкл раствора ДНК (120 нг/мкл) и 238 мкл дистиллированной воды.). 3.: После перемешивания немедленно добавьте 10 мкл этой смеси к предварительно внесенным и высушенным реакционным смесям. Маркировка Меняйте наконечник после каждого использования пипетки. Плотно закройте пробирки соответствующими крышками. Не касаетесь внутренней стороны крышек и верхних краев пробирок пальцами, это позволит вам избежать загрязнения. Если используются амплификаторы с плотной крышкой, то можно также использовать ПЦР маты многократного использования. Немного потрясите планшет, чтобы растворить синий шарик на дне планшета. Весь ПЦР раствор должен осесть на дне. 4.: Поместите реакционные пробирки в термоциклер и закрепите крышку так, чтобы реакционные сосуды не деформировались при нагреве. Запустите программу ПЦР. Покрытие реакционных смесей минеральным маслом не требуется, если используется обогреваемая и регулируемая крышка! Типы амплификаторов: РТС 100/200 (MJ Research / BioRad) и GeneAmp PCR-System 9600/9700 (пожалуйста, используйте скорость нагрева 9600) (ABI) --- стр. 7 --- Параметры амплификации: Этап программы Температура Время Число циклов Первая денатурация 96°С 5 минут 1 Цикл Денатурация ^ 96°С 20 секунд 5 Циклов Отжиг+Элонгация 68°С 1 минута Денатурация 96°С 20 секунд 10 Циклов Отжиг 64°С 50 секунд Элонгация 72°С 45 секунд Денатурация 96°С 20 секунд 15 Циклов Отжиг 61°С 50 секунд Элонгация 1 Т С 45 секунд Заключительная элонгация 72°С 5 минут 1 Цикл Так как амплификаторы различных производителей имеют разные рабочие характеристики, и даже устройства одного типа могут быть откалиброваны по-разному, может возникнуть необходимость в оптимизации параметров амплификации. Чтобы оптимизировать работу вашего устройства, воспользуйтесь следующими принципами: Ложноположительные реакции (неспецифичные полосы, дополнительные типы): Увеличить температуру отжига с шагом 1°С. Ложноотрицательные реакции (отсутствие полос): Снизить температуру отжига с шагом 1°С и/или увеличить период отжига с шагом 5 секунд и/или увеличить периоды денатурации с шагом 5 секунд. Рекомендуется использовать только те амплификаторы, которые регулярно проходят калибровку. Для этого с успехом можно использовать набор BAG-Cycler Check (Номер по каталогу: 7104). Тесты в рамках контроля качества были выполнены на РТС-200 - 100 (MJ Research) и 9700 (ABI) соответственно. 5.4 Электрофорез в геле Разделение продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза через (горизонтальный) агарозный гель. В качестве буфера для электрофореза мы рекомендуем использовать 0.5 х ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0.5 ммоль ЭДТА). Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы. Перед загрузкой образца дайте гелю полимеризироваться, по крайней мере, в течение 30 минут. После того, как амплификация будет завершена, возьмите образцы из термоциклера и загрузите реакционные смеси в полном объеме в каждую ячейку геля. Кроме того, добавьте 10 мкл стандарта длины ДНК для сравнения размера. Электрофоретическое разделение осуществляется при 10-12 В/см (при расстоянии между электродами 20 см и приблизительно 200-240 В), в течение 20-40 минут. После заверщения процедуры весь гель окрашивается раствором бромистого этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл Бромистого этидия в Н 2О или буфере ТВЕ) в течение 30-40 минут. В качестве альтернативы EtBr (0.5 мкг/мл) можно также добавить в буфер для электрофореза или агарозный гель. Если потребуется, избыток EtBr можно удалить, замочив гель в Н 2О или 0.5 X ТВЕ буфере на 20-30 минут. 5.5 Регистрация и интерпретация результатов С целью регистрации визуализируйте ПЦР амплификацию, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (220-310 нм), и сфотографируйте её, используя соответствующую камеру, пленки и фильтры (например, Polaroid, тип пленки 667). Выберите вьщержку и --- стр. 8 --- диафрагму, чтобы полосы выглядели четкими и выделялись на темном фоне (примерная диафрагма 11, время выдержки 1 секунда). Для интерпретации воспользуйтесь таблицей специфичности и диаграммой оценки (см. дополнительный лист); положительными следует считать только те полосы, которые имеют правильный размер по сравнению со стандартом длины ДНК. Правильные размеры приведены в таблице соответствующей диаграммы. На веех дорожках без аллель- специфичной амплификации, должен быть хорошо виден внутренний контроль 1070 Ьр. В большинстве случаев при наличии аллель-специфичной амплификации, внутренний контроль слабо выражен или полностью исчезает! При получении неверных результатов обратитесь к разделу «Поиск и устранение неисправностей» (6). В контроле загрязнения не должно быть видимых полос. Если имеет место загрязнение геномной ДНК, будет иметь место полоса на 282 Ьр. Дополнительные полосы могут встречаться на 78 Ьр, 104 Ьр, 176 Ьр и приблизительно 580 Ьр. Если имеет место загрязнение амплификатами, то полосы появятся на 78 Ьр и/или 104 Ьр и/или 282 Ьр. 6. Предупреждения и предосторожности Бромистый этидий - мощный мутаген. При работе с гелями или растворами, содержащими бромистый этидий, используйте перчатки! Обратите внимание на руководство по эксплуатации, предупреждения и предосторожности изготовителя! Трансиллюминатор формирует ультрафиолетовое излучение с чрезвычайно короткими волнами, которое может вызвать ожог кожи и сетчатки. Используйте лицевую маску для защиты от УФ облучения! Со всеми биологическими материалами, используемыми для вьщеления ДНК, например, с кровью или человеческой тканью, следует обращаться как с потенциально инфицированными. При работе с биологическим материалом следует придерживаться некоторых правил безопасности (не засасывайте материал в пипетку ртом; используйте одноразовые перчатки при работе с биологическим материалом и при проведении анализа; по окончании теста продезинфицируйте руки). Перед утилизацией биологический материал следует инактивировать (например, в автоклаве). Раеходные материалы следует обработать в автоклаве или сжечь после использования. Разлив потенциально инфицированных материалов следует немедленно устранить, используя абсорбирующую бумажную салфетку, а загрязненные зоны промыть подходящим стандартным дезинфицирующим средством или 70% спиртом. Материал, используемый для устранения разлива, включая перчатки, перед утилизацией должен быть инактивирован (например, в автоклаве). 7. Поиск и устранение неисправностей Проблема Возможная причина Решение отсутствие амплификации, виден стандарт длины ДНК содержит ингибиторы ПЦР повторите выделение ДНК, попробуйте разные методы слишком высокая / слишком низкая концентрация ДНК измените концентрацию ДНК, повторите выделение ДНК отсутствует фермент или его концентрация слишком низкая повторите типирование, измените концентрацию фермента ДНК из гепаринизированной крови повторите типирование, используя кровь, обработанную этилендиаминтетрауксус --- стр. 9 --- ной кислотой или цитратом неверные параметры амплификации оптимизируйте параметры амплификации (см. 4.3) * повторный дефект в отдельных дорожках (нет контроля амплификации) течь в реакционных пробирках; потеря воды и изменение концентрации в ходе ПЦР плотно закройте пробирки крышками; возьмите другие реакционные пробирки неспецифическая амплификация, дополнительные полосы, (допол н ител ьн ые полосы несоответствующего размера следует отбрасывать) загрязнение продуктами амплификации повторите типирование, гарантируйте точность исполнения ДНК загрязнена солями повторите выделение ДНК, попробуйте разные методы слишком высокая концентрация ДНК возьмите меньшее количество ДНК слишком высокая концентрация фермента возьмите меньшее количество фермента неверные параметры амплификации оптимизируйте параметры амплификации (см. 4.3) * при оценке выявлено более 2 специфичностей загрязнение при переносе (продукты амплификации!) новая аллель проверьте смеси для типирования (ДНК не добавлена) гарантируйте точность исполнения полосы не видны или видны только очень светлые полосы, стандарт длины не виден слишком слабое окрашивание EtBr (бромистым этидием) повторите окрашивание слишком яркое фоновое свечение геля слишком длительное окрашивание, слишком высокая концентрация EtBr (бромистого этидия) замочите гель в Н 2О или в ТВЕ (трис-борат-ЭДТА буфере) снизьте концентрацию EtBr(бромистого этидия) размытая полоса слишком горячий буфер для электрофореза неправильный буфер для электрофореза понизьте напряжение воспользуйтесь буфером 0,5хТВЕ * При использовании перечисленного оборудования и материалов, оптимизация параметров амплификации является последним ередством. В большинстве случаев можно оценить результаты испытания, устранив дополнительные полосы, вызванные несоответетвиями в размерах. --- стр. 10 --- 1 ,50 ш и т о , Пронумеровано, И скреплено печать во листов Дире1