Набор реагентов для определения тропизма и выявления мутаций устойчивости вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) к антиретровирусным препаратам в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием продуктов амплификации «АмплиСенс® HIV-Resist-Seq» по ТУ 9398-013-01897593-2011 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
СОДЕРЖАНИЕ
1 НАЗНАЧЕНИЕ ПРОГРАММЫ.....................................................................................5
1.1 Функциональное назначение......................................................................................5
1.2 Эксплуатационное назначение...................................................................................5
1.3 Обозначение ПО............................................................................................................5
1.4 Дата выпуска ПО...........................................................................................................5
1.5 Класс безопасности ПО.................................................................................................5
1.6 Принцип работы ПО......................................................................................................5
1.7 Краткое описание функциональных возможностей ПО.........................................6
2 УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОГРАММЫ................................................................6
2.1 Требования к техническим средствам оператора ..................................................6
2.2 Требования к входным данным ..................................................................................7
3 ВХОД В ПО......................................................................................................................7
3.1 Общие сведения о входе.............................................................................................7
3.2 Регистрация (первый вход)..........................................................................................7
3.3 Авторизация (повторный вход) ...................................................................................7
4 ВЫПОЛНЕНИЕ АВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ........................................................................................8
4.1 Создание нового проекта и загрузка файлов с прочтениями...............................8
4.2 Загрузка ранее сохраненного проекта ......................................................................8
4.3 Работа с проектом.........................................................................................................9
4.3.1 Описание рабочей области проекта..........................................................................9
4.3.1.1 Команды управления проектом ..................................................................................9
4.3.1.2 Вкладка Хро/иатозрам/иа..........................................................................................10
4.3.1.3 Вкладка Контроль качества .....................................................................................11
4.3.1.4 Вкладка/Иутацш.........................................................................................................13
4.3.1.5 Окно хроматограмм и нуклеотидных последовательностей ..............................13
4.3.1.6 Клавиши для редактирования нуклеотидной последовательности ..................15
4.3.2 Работа с нуклеотидной последовательностью .....................................................16
4.3.2.1 Контроль качества исследования.............................................................................16
4.3.2.2 Скрытие участков........................................................................................................17
4.3.2.3 Редактирование нуклеотидной последовательности ..........................................17
4.3.2.4 Выравнивание последовательностей.....................................................................21
4.3.2.5 Сохранение консенсуса в буфер обмена ............................ 22
4.3.3 Отчет с результатами исследования лекарственной устойчивости и
определения тропизма................................................ 22
4.3.3.1 Формирование отчета...............................................Т...............................................22
4.3.3.2 Описание лекарственной устойчивости/тропизма, выявленных мутаций и
контроля качества исследования в отчете о результатах исследования .....23
5 СООБЩЕНИЯ ОПЕРАТОРУ......................................................................................25
6 ТЕХНИЧЕСКАЯ ПОДДЕРЖКА..................................................................................26
RU.01897593.000001-01 34 01-1
стр. 3 из 26
72967
12.10.2021
--- стр. 4 ---
RU.01897593.000001-01 34 01-1
ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯ
Сокращение Расшифровка
БД База данных
ВИЧ Вирус иммунодефицита человека
Выравнивание Способ сравнения двух и более нуклеотидных
последовательностей относительно друг друга. Действие
является необратимым
Вырожденная позицияПозиция, в которой детектируется более одного нуклеотида
Консенсусная
последовательность
Итоговая нуклеотидная последовательность исследуемого
образца
Контроль качества
исследования
Определение качества сборки, сформированной консенсусной
последовательности с помощью следующих показателей;
- Покрытие участка нуклеотидной последовательности
- Наличие проблемных участков (стоп-кодоны, нетипичные
мутации)
Клавиатура IUPAC Виртуальная клавиатура с буквенными обозначениями
нуклеотидов и их комбинаций в соответствии с номенклатурой
Международного союза теоретической и прикладной химии
(IUPAC)
Некачественные
секции
Секции, среднее качество сигнала которых не превышает
значение 30 по данным параметра «рсоп» файла Abif
Основной пик Пик максимальной высоты в данной позиции на хроматограмме
Повторы Несколько прочтений РНК/ДНК одного и того же клинического
образца
Прочтение Нуклеотидная последовательность, полученная в результате
секвенирования
Проект Сборка прочтений и проведение анализа для одного
клинического образца
Профиль Анализ нуклеотидной последовательности определенного
фрагмента генома определенного возбудителя
Референсная
последовательность
Нуклеотидная последовательность, относительно которой идет
сборка и анализ хроматограмм исследуемого образца
Рамка считывания Последовательность нуклеотидов, способная кодировать
аминокислоту
Реверс-комплемент Комплементарный перевод в обратном направлении имеющейся
нуклеотидной последовательности
Сервер Выделенный компьютер или его мощности (в том числе
виртуальные) под управлением ФБУ|Н ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора для работы с ПО*
Стоп-кодон Последовательность нуклеотидов, кодирующая прекращение
синтеза полипептидной цепи
СУБД Система управления базами данных
Сильный подпик Пик в одной позиции с основным пиком и имеющий высоту
более 1/3 высоты этого пика
Слабый подпик Пик в одной позиции с основным пиком и имеющий высоту
менее 1/3 высоты этого пика
Трансляция Перевод нуклеотидной последовательности в аминокислотную
дар Отсутствие одного или нескольких нуклеотидов в
анализируемой последовательности относительно референсной
последовательности
FPR False positive rate (порог ложноположительного результата)
стр. 4 из 26
72967
12.10.2021
--- стр. 5 ---
RU.01897593.000001-01 34 01-1
1 НАЗНАЧЕНИЕ ПРОГРАММЫ
1.1 Функциональное назначение
ПО предназначено для анализа и обработки нуклеотидных последовательностей
для выявления лекарственной устойчивости возбудителей и/или определения
тропизма.
1.2 Эксплуатационное назначение
Пользователями (операторами) ПО являются медицинские работники и научные
сотрудники, владеющие молекулярно-генетическими методами работы, в том числе
методами анализа и обработки нуклеотидных последовательностей с целью
определения мутаций лекарственной устойчивости и тропизма различных
возбудителей.
ПО функционирует в режиме «онлайн» и доступно операторам через интернет по
адресу resist.amplisens.ru. Отчет о результатах исследования сохраняется на
компьютере оператора в формате PDF.
1.3 Обозначение ПО
RU.89492021.00001-01, где две последние цифры обозначают номер издания
(версии) ПО.
1.4 Дата выпуска ПО
06.03.2020
1.5 Класс безопасности ПО
Класс А (невозможны никакие травмы и ущерб здоровью).
1.6 Принцип работы ПО
ПО анализирует информацию, полученную с^ помощью генетического
анализатора (секвенатора), которая содержит:
- координаты вершин, соответствующих позициям нуклеотидов,
- координаты сигналов нуклеотидов,
- нуклеотидные последовательности,
- показатели качества сигналов.
В автоматическом режиме происходит построение консенсусной
последовательности, сравнение с референсными последовательностями,
определение мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. При
анализе учитываются данные транслированной аминокислотной
последовательности. Результат анализа выдается в виде отчета, содержащего
стр. 5 из 26
72967
12.10.2021
--- стр. 6 ---
информацию о лекарственной устойчивости, о тропизме возбудителя или в виде
консенсусной последовательности, которая может быть проанализирована
внешними сервисами. Данный этап является заключительным этапом исследования
в лаборатории.
Для проведения анализа оператор в ручном режиме осуществляет выбор
профиля, создание нового проекта, загрузку результатов секвенирования, оценку
результата контроля качества исследования, редактирование нуклеотидных
последовательностей (прочтений), внесение данных об исследуемом образце.
В целях конфиденциальности ПО обрабатывает и хранит информацию в
обезличенном виде (деперсонализировано).
1.7 Краткое описание функциональных возможностей ПО
- Сборка и визуализация консенсусной последовательности анализируемых
участков генома возбудителя.
- Идентификация мутаций, значимых для определения лекарственной
устойчивости возбудителя.
- Контроль качества исследования.
- Определение чувствительности к лекарственным лрепаратам и/или тролизма.
- Формирование отчета с результатами исследования или формирование
консенсусной последовательности, с помощью которой можно получить
результат анализа через внешние сервисы, рекомендуемые ВОЗ.
ПО соответствует требованиям ГОСТ Р ИСО/МЭК 9126, ГОСТ 28195,
ГОСТ Р 51188, п. 4.3 ГОСТ Р МЭК 62304.
Руководство оператора и интерфейс программного обеспечения разработан на
русском языке и может быть переведен на английский и другие языки без внесения
j'
изменений в программный код ПО. ”
2 УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОГРАММЫ
ВНИМАНИЕ! Работа с ПО возможна только после регистрации/авторизации
оператора. Регистрация проводится при первом входе в ПО.
2.1 Требования к техническим средствам оператора
Для работы оператора необходим персональный комльютер с выходом в сеть
«интернет» и предустановленным браузером «Google Chrome» или
«Яндекс. Браузер».
Общие требования указаны в таблице 1.
RU.01897593.000001-01 34 01-1
стр. 6 из 26
72967
12.10.2021
--- стр. 7 ---
RU.01897593.000001-01 34 01-1
Таблица 1
Характеристика Минимальное значение
Оперативная память 2 ГБ
Свободное место на жестком диске 50 МБ
Операционная система Microsoft® Windows 7 или выше
Канал связи выхода в интернет 500 кбит/сек
Процессор Intel Pentium/Celeron 1800 МГц и выше
Браузеры Google Chrome (Версия 38 и выше) или
Яндекс.Браузер (Версия 18.3 и выше)
Дисплей SVGA-дисплей
Разрешение экрана Не менее 1280x800
2.2 Требования к входным данным
ПО может загружать и обрабатывать только файлы прочтений клинического
образца, полученные в формате «Abif» с расширением «*.аЫ».
ВНИМАНИЕ! Следует загружать файлы строго в соответствии с профилем
исследования.
ВНИМАНИЕ! Не допускается загружать в один проект файлы прочтений разных
образцов и разных пациентов.
3 ВХОД В ПО
3.1 Общие сведения о входе
Для входа в программу необходимо в браузере «Google Chrome» или
«Яндекс.Браузер» открыть адрес resist.amlisens.ru.
3.2 Регистрация (первый вход)
В окне авторизации программы нажать на кнопку Регистрация.
В появившимся окне заполнить данные для получения доступа к программе:
- E-mail. ж
- Пароль.
- Название организации.
- ФИО пользователя.
- Контактный телефон.
В случае успешной регистрации откроется окно авторизации.
3.3 Авторизация (повторный вход)
Для повторного входа в программу ввести логин и пароль, указанные при
регистрации.
стр. 7 из 26
72967
12.10.2021
--- стр. 8 ---
RU.01897593.000001-01 34 01-1
Если установлена галочка Запомнить меня, авторизация при очередном входе
в ПО будет осуществляться с данного компьютера без повторного ввода логина и
пароля.
Возврат к окну авторизации осуществляется с помощью кнопки Выход в правом
верхнем углу ПО.
4 ВЫПОЛНЕНИЕ АВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
4.1 Создание нового проекта и загрузка файлов с прочтениями
Для создания нового проекта:
- авторизоваться в системе (если ранее не авторизованы),
- выбрать профиль под заголовком Создать проект,
- нажать кнопку загрузки файлов.
Откроется окно для загрузки файлов прочтений клинического образца.
Выбрать (с помощью кнопки Выбрать) из каталога компьютера файлы формата
«Abif» с расширением «*.аЬ1». В окне появится список названий выбранных файлов
для загрузки.
ВНИМАНИЕ! Убедитесь, что файлы прочтений относятся к одному пациенту и к
одному профилю исследования.
Проекту автоматически присваивается название, соответствующее названиям
загружаемых файлов (их общим частям в названии). В случае необходимости,
можно отредактировать название проекта вручную.
Нажать кнопку Создать проект.
Система произведет автоматическую обработку файлов, в результате которой
будет сформирована консенсусная последовательносты (с учетом транслированной
аминокислотной последовательности), отображены вырожденные позиции,
обрезаны некачественные секции и выведены результаты контроля качества
исследования.
В открывшейся рабочей области проекта оператору необходимо провести оценку
результата контроля качества исследования и, при необходимости, отредактировать
нуклеотидные последовательности (см. п. 4.3).
4.2 Загрузка ранее сохраненного проекта
Выбрать в разделе История проектов ранее сохраненный проект. Щелкнуть на
название нужного проекта, откроется рабочая область проекта (см. п.4.3).
стр, 8 из 26
72967
12.10.2021
--- стр. 28 ---
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор Федерального бюджетного
учреждения науки «Центральный
научно-исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной
службы по надзору в сфере защиты
праацпотребителей /йу благополучия
vt человека^,
В.Г. Акимкин
--------2оа.г.
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для определения тропизма и выявления
мутаций устойчивости вируса иммунодефицита
человека (ВИЧ-1) к антиретровирусным препаратам
в клиническом материале методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с последующим секвенированием
продуктов амплификации
«АмплиСенс® H/V-Resist-Seq»
АмплиСенс'
Hi
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом ЗА IVD
72967
12.10.2021
--- стр. 29 ---
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................. 3
НАЗНАЧЕНИЕ.............................................. 3
ПРИНЦИП МЕТОДА........................................................... 4
ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ..................... 7
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ..................... .............................
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ..............................................................................................12
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.................................................13
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА 19
СОСТАВ...................................................................................................................... '21
ЭТАП 1. ЭКСТРАКЦИЯ РНК/ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛ а”^.''..!!.!!..'^’!^
ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И
АМПЛИФИКАЦИИ. I РАУНД................................................................................................. 30
ЭТАП 3. ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ. II РАУНД ..... 35
ЭТАП 4. ПОДГОТОВКА И ПРОВЕДЕНИЕ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ' ' 39
ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ..........................................................................39
ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КОМПЛЕКТА
РЕАГЕНТОВ «Ампли-сорб».......................................................................... 40
ОЦЕНКА КОНЦЕНТРАЦИИ ОЧИЩЕННЫХ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С ..........
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАРКЕРА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС ИЗ «КОМПЛЕКТА ДЛЯ
ПОДГОТОВКИ КСЕКВЕНИРОВАНИЮ».............................................................................42
ПОДГОТОВКА И ПРОВЕДЕНИЕ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
СЕКВЕНАТОРОВ ФИРМЫ Applied Biosystems, США........................................ 48
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ЦИКЛИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ 49
ОЧИСТКА ОТ НЕВКЛЮЧИВШИХСЯ ТЕРМИНАТОРОВ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ
ДЕНАТУРАЦИЯ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ....................................54
АВТОМАТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ С
ПОМОЩЬЮ ПРИБОРА ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ 56
ЭТАП 5. АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................57
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ................ 69
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ ......70
ПРИЛОЖЕНИЕ 1........................................................................................ ..............7-I
Экстракция РНК из плазмы крови при использовании комплекта реагентов «РИБО-
золЬ“Е)^.............................................. ~1 \
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 .................. .....................74
А1. Экстракция ДНК из цельной крови при использовании комплекта реагентов
«РИБО-преп»................................................................................... 74
А2. Экстракция ДНК из сухих пятен крови при использовании комплекта реагентов
«РИБО-преп» ..................... 7g
ПРИЛОЖЕНИЕ 3.................................................. .....................79
Электрофоретическая детекция продуктов амплификации в агарозном геле с
использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200....................................... 79
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ......................... ......81
стр. 2 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 30 ---
список СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие
а/к - аминокислота
ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ВПК - высококонцентрированный положительный контроль
гэ - геномные эквиваленты
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная ДНК
нпк - низкоконцентрированный положительный к о н т р о л ь
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция, совмещенная со стадией
полимеразной цепной реакции
око - отрицательный контрольный образец
ок - отрицательный контроль
пко - положительный контрольный образец
п.н. - пары нуклеотидов
по - программное обеспечение
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
FPR - false positive rate (порог ложноположительного результата^
H IV - human immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита
человека)
pro - protease (ген протеазы)
rev - reverse transcriptase (ген обратной транскриптазы
(ревертазы))
int - integrase (ген интегразы)
env - envelope (ген белка оболочки)
на тестирование
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов рассчитан
50 клинических образцов.
Набор реагентов «АмплиСенс® W/V-Resist-Seq»
предназначен для выявления мутаций лекарственной
устойчивости ВИЧ в гене протеазы (pro), фрагменте гена
обратной транскриптазы (rev) и гене интегразы (int) ВИЧ, а
также для определения тропизма ВИЧ на основе анализа
нуклеотидной последовательности \/3-петли гена белка
оболочки (env).
Для выявления мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в
гене протеазы, фрагменте гена обратной транскриптазы и гене
интегразы ВИЧ данный набор реагентов рекомендуется
стр. 3 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 37 ---
Форма
комплектации гены
Форма 8
Обратная
занскрипта.
(rev).
протеаза (pro),
интеграза (int),
определение
л
Комплект реагентов/реагент Кол-во,
шт.
«РИБО-золь-Е» 2
«РИБО-преп» вариант 100 1
Раствор для лизиса 2 флакона
Раствор для преципитации 1 флакон
ГЕМОЛИТИК 1 флакон
ПКО ДНКВИЧ-1 3 пробирки
око 3 пробирки
« ОТ- П ЦР-ко м п л е КТ- Р ro/Re V» 1
«ПЦР-комплект-Pro/Rev» 1
«ОТ-ПЦР-комплект-lnt» 1
«ПЦР-комплект-lnt» 1
«ОТ-ПЦР-комплект-Env» 1
«ПЦР-комплект-Env» 1
«Ампли-сорб» вариант 50 6
«ЭФ» вариант 200 2
«Комплект для подготовки к
секвенированию Pro/Rev» 1
«Комплект для подготовки к
секвенированию Int» 1
«Комплект для подготовки к
секвенированию Env» 1
Программное обеспечение «АмплиСенс"^ Resist»
версия 01, дата выпуска 06.03.2020, на сайте
Изготовителя или программное обеспечение «ДЕОНА»
версия 1.2.3, дата выпуска 28.04.2014- 1 диск
Формы комплектации 1-4 предназначены для проведения
полного исследования и включают реагенты для экстракции
нуклеиновых кислот из клинического материала, реакции
обратной транскрипции РНК и амплификации методом ПЦР,
электрофоретической детекции продуктов амплификации в
агарозном геле, проведения очистки продуктов амплификации,
определения концентрации очищенных продуктов
амплификации, постановки реакции секвенирования, очистки
продуктов реакции секвенирования от невключившихся
терминаторов.
Формы комплектации 5-8 предназначены для экстракции РНК
из клинического материала, реакции обратной транскрипции
РНК и амплификации методом ПЦР, электрофоретической
детекции продуктов амплификации в агарозном геле,
проведения очистки продуктов амплификации, определения
концентрации очищенных продуктов амплификации, очистки
стр. 10 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 38 ---
продуктов реакции секвенирования от невключившихся
терминаторов, а также включают праймеры для
секвенирования. Для проведения полного исследования
необходимо дополнительно использовать комплект реагентов
для секвенирования с флуоресцентно-мечеными
терминаторами (например, BigDye Terminator v1.1 Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems, США).
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Вид клинического
материала
Объем
экстракции
мкл
Комплект
для
выделения
РНК/ДНК
Мишень Аналитическая
чувствител ьность
Плазма крови 200 «РИБО-золь-Е»
Гены протеазы,
обратной
транскриптазы,
интегразы,
белка оболочки
500 РНК ВИЧ-1,
копий/мл
Плазма крови
с предварительным
ультрацентрифуги
рованием
1000 «РИБО-золь-Е»
Гены протеазы,
обратной
транскриптазы,
интегразы,
белка оболочки
100 РНК ВИЧ-1,
копий/мл
Лейкоцитарное
кольцо, полученное
из цельной крови
250 «РИБО-преп» Ген белка
оболочки
500 ГЭ/мл^ ДНК
ВИЧ-1
Сухая калля крови (один круг,
d=12 мм)
«РИБО-преп» Ген белка
оболочки
5000 ГЭ/мл ДНК
ВИЧ-1
Аналитическая специфичность
Оценка аналитической специфичности набора реагентов
проведена посредством добавления в реакцию геномной
ДНК/РНК следующих организмов и вирусов; вирус гепатита А,
вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита D,
цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого
герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус герпеса
человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого
энцефалита, вирус лихорадки западного Нила, аденовирус
типы 2, 3, 7, Escherichia соН, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens.
Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов
^ Количество геномных эквивалентов (ГЭ) ДНК ВИЧ-1 в 1 мл образца клинического
материала.
стр. 11 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 39 ---
зарегистрированы не были.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей
молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического
материала на наличие возбудителей инфекционных болезней,
с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СанПиН
3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по
профилактике инфекционных болезней», СанПиН 2.1.3684-21
«Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию
территорий городских и сельских поселений, к водным
объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению,
атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям,
эксплуатации производственных, общественных помещений,
организации и проведению санитарно-противоэпидемических
(профилактических) мероприятий» и методических указаний
МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп
патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как
инфекционно-опасные, организовывать работу и хранение в
«Санитарно-
профилактике
образцы или
средства в
«Санитарно-
профилактике
соответствии с СанПиН 3.3686-21
эпидемиологические требования по
инфекционных болезней».
Убирать и дезинфицировать разлитые
реактивы, используя дезинфицирующие
соответствии с СанПиН 3.3686-21
эпидемиологические требования по
инфекционных болезней».
Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с
требованиями СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-
эпидемиологические требования к содержанию территорий
городских и сельских поселений, к водным объектам,
питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному
воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации
производственных, общественных помещений, организации
и проведению санитарно-противоэпидемических
стр. 12 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 40 ---
(профилактических) мероприятий».
ВНИМАНИЕ! При удалении пробирок, содержащих продукты
ПЦР, недопустимо их открывание и разбрызгивание
содержимого, поскольку это может привести к контаминации
продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и
реагентов.
Применять набор строго по назначению, согласно данной
инструкции.
Допускать к работе с набором только специально обученный
персонал.
Не использовать набор по истечении срока годности.
- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой.
При контакте немедленно промыть пораженное место водой
и обратиться за медицинской помощью.
- Листы безопасности материалов (MSDS - material safety
data sheet) доступны по запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
Экстракция РНК/ДНК из исследуемого материала
1. Стерильный ламинарный бокс.
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25-100 X.
3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до
16 тыс g с охлаждением.
4. Вортекс.
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой
для удаления надосадочной жидкости.
6. Отдельный набор автоматических дозаторов переменного
объема.
7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или
плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл.
8. Штативы для пробирок объемом 1,5 мл и наконечников.
9. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного
объема в штативах до 200 мкл и до 1000 мкл.
Ю.Одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов
переменного объема до 200 и до 1000 мкл.
11.Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше
минус 16 °С.
12.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки
по МУ 1.3.2569-09.
стр. 13 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 41 ---
13. Емкость с дезинфицирующим раствором.
При работе с сухими пятнами крови :
14. Компостеры с диаметром 6 мм (например, Qiagen,
Германия).
При экстракции из 1 мл плазмы крови:
15. Центрифуга с охлаждением до 24 тыс g (например, Hettish,
Германия).
Проведение реакции обратной транскрипции и ПЦР
1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
2. Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до
50 мкл, от 50 до 200 мкл).
4. Одноразовые наконечники с фильтром до 50 и до 200 мкл в
штативах.
5. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР
объемом 0,2 мл.
6. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл.
7. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше
минус 16 °С.
8- Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки
по МУ 1.3.2569-09.
9. Емкость для сброса наконечников.
Ю.Программируемый амплификатор (например, GeneAmp PCR
System 2700 (Applied Biosystems, США), PalmCycler (Corbett
Research, Австралия)).
Проведение II раунда ПЦР (Nested-ПЦР)
1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
2. Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема (от 0,5 до
10 мкл, от 5 до 50 мкл, от 50 до 200 мкл).
4. Одноразовые наконечники с фильтром до 10, до 50 и до
200 мкл в штативах.
5. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР
объемом 0,2 мл.
6. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл.
7. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше
минус 16 °С.
8. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки
стр. 14 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 42 ---
по МУ 1.3.2569-09.
9. Емкость для сброса наконечников.
10. Программируемый амплификатор (например, GeneAmp PCR
System 2700 (Applied Biosystems, США), PalmCycler (Corbett
Research, Австралия)).
Детекция продуктов амплификации методом
электрофореза в агарозном геле
1. Камера для горизонтального электрофореза объемом не
более 400 мл.
2. Источник постоянного тока с напряжением 150-460 В.
3. Столик для заливки гелей.
4. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для
просмотра гелей.
5. Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации
результатов.
6. Аквадистиллятор или возможность централизованного
получения дистиллированной воды.
7. Микроволновая печь для плавления агарозы.
8. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления
агарозы на 250 мл.
9. Мерный цилиндр на 1 л.
10. Штатив для пробирок объемом 0,5 мл или 0,2 мл (в
зависимости от типа используемых пробирок).
11.Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в
штативах.
12. Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до
50 мкл).
13. Емкость для сброса наконечников.
14. Пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и
гелей, содержащих бромид этидия.
15.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки
по МУ 1.3.2569-09.
Очистка продуктов амплификации (с помощью комплекта
реагентов «Ампли-сорб»)
1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
3. Центрифуга/вортекс.
4. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до
стр. 15 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 56 ---
концентрации РНК ВИЧ вирусная нагрузка образца
оказалась в диапазоне от 100 до 500 копий/мл,
- с использованием сухих пятен крови в качестве
клинического материала (необходимо учитывать, что в этом
случае чувствительность будет меньше по сравнению с
анализом, где в качестве клинического материала
используется цельная кровь).
Схема 1 - Рекомендуемый алгоритм анализа клинических
образцов при определении тропизма ВИЧ.
* В случае вирусной нагрузки исследуемого образца менее
1000 копий/мл анализ может быть выполнен как на матрице
РНК, так и на матрице ДНК. Однако рекомендуется проведение
анализа на матрице ДНК, вследствие более короткого времени
проведения анализа, а также меньшей трудоемкости.
стр. 29 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 57 ---
ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ
ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ. I РАУНД
(проводится в зоне Амплификации - помещении для
проведения ПЦР).
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать
только одноразовые стерильные пластиковые расходные
материалы, имеющие специальную маркировку RNase-
free, DNase-free.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК/ДНК и
контрольных образцов используются одноразовые
наконечники с фильтрами.
Протокол А. Проведение реакции обратной транскрипции РНК
и амплификации кДНК гена протеазы и фрагмента гена
обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека
тила 1 (ВИЧ-1).
Общий объем реакции - 40 мкл, объем пробы РНК - 20 мкл.
1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом
0,2 мл.
2. Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в
лробирку с ОТ-ПЦР-смесью-1 Pro/Rev добавить 9 мкл RT-
G-mix-1 и 110 мкл ОТ-ПЦР-смеси-2-804, тщательно
леремешать на вортексе, осадить калли с крышки пробирки.
3. К полученному раствору добавить 20 мкл
полимеразы (TaqF) и 10 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv),
перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки.
Примечание - в случае приготовления реакционной смеси на
другое количество реакций смешать компоненты из расчета на
1 реакцию в следующем соотношении:
9 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1 Pro/Rev,
8 мкл ОТ-ПЦР-смеси-2-804,
0,7 мкл RT-G-mix-1,
1,5 мкл полимеразы (TaqF),
0,7 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv).
4. Внести в каждую пробирку по 20 мкл подготовленной
реакционной смеси.
5. В подготовленные пробирки внести по 20 мкл проб РНК,
полученных в результате экстракции из исследуемых или
контрольных образцов. Осторожно перемешать
пипетированием.
стр. 30 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 58 ---
6. Запрограммировать амплификатор для выполнения
соответствующей программы амплификации (см. табл. 1).
Таблица 1
Программа ОТ-ПЦР генов протеазы (Pro) и
Цикл Температура, ®С Время Кол-во циклов
1 45 30 мин 1
2 95 10 мин 1
3
95 30 с
3050 30 с
72 1 мин 30 с
4 72 5 мин 1
5 4-10 хранение
7. Установить пробирки в ячейки амплификатора и запустить
программу амплификации.
8. После окончания реакции пробирки отправить в
специальный бокс для проведения реакции Nested-ПЦР.
Бокс должен быть снабжен отдельным комплектом
лабораторной одежды, автоматических дозаторов,
вспомогательных материалов и оборудования.
Протокол Б. Проведение реакции обратной транскрипции РНК
и амплификации кДНК гена интегразы вируса иммунодефицита
человека типа 1 (ВИЧ-1).
Общий объем реакции - 40 мкл, объем пробы РНК - 20 мкл.
1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом
0,2 мл.
2. Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в
пробирку с ОТ-ПЦР-смесью-1 Int добавить 9 мкл RT-G-mix-
1 и 110 мкл 0Т-ПЦР-смеси-2-504, тщательно перемешать
на вортексе, осадить капли с крышки пробирки.
3. К полученному раствору добавить 20 мкл
полимеразы (TaqF) и 10 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv),
перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки.
Примечание - В случае приготовления реакционной смеси
на другое количество реакций смешать компоненты из расчета
на 1 реакцию в следующем соотношении:
9 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1 Int,
8 мкл 0Т-ПЦР-смеси-2-804,
0,7 мкл RT-G-mix-1,
1,5 мкл полимеразы (TaqF),
стр. 31 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 69 ---
ОЦЕНКА КОНЦЕНТРАЦИИ ОЧИЩЕННЫХ ПРОДУКТОВ
АМПЛИФИКАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАРКЕРА
МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС ИЗ «КОМПЛЕКТА ДЛЯ
ПОДГОТОВКИ к СЕКВЕНИРОВАНИЮ»
(проводится в зоне Детекции - помещении для детекции
продуктов амплификации)
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна
проводиться в отдельной комнате сотрудником лаборатории,
не производящим манипуляций в зонах Экстракции и
Амплификации.
Перед постановкой реакции секвенирования необходимо
оценить концентрацию очищенных продуктов амплификации
(ПЦР-продуктов), исходя из которой определить объем ПЦР-
продукта, который будет использован для проведения реакции
секвенирования, т.к. количество вносимого в реакцию ПЦР-
продукта может влиять на качество получаемых хроматограмм.
Избыточное количество ампликонов приводит к получению
хроматограмм с большой амплитудой пиков в начале прогона и
быстрым падением амплитуды пиков в конце прогона,
недостаточное количество - уменьшает выраженность сигнала
и высоту пика. Оценка концентрации осуществляется с
помощью электрофоретической детекции в агарозном геле с
использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200.
Объем очищенного ПЦР-продукта - 5 мкл.
Для внесения реагентов и ПЦР-лродукта ислользуются
одноразовые наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! До начала работы разморозить, тщательно
перемешать на вортексе маркер молекулярных масс и
буфер для нанесения образцов, осадить капли с крышек
пробирок.
1. Приготовить агарозный гель. При использовании комплекта
реагентов «ЭФ» вариант 200 производства ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора см. приложение 3
«Электрофоретическая детекция продуктов амплификации в
агарозном геле с использованием комплекта реагентов
«ЭФ» вариант 200».
стр. 42 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 70 ---
2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок
на 0,5 мл с учетом количества клинических и контрольных
образцов. Промаркировать пробирки.
3. Раскапать на дно промаркированных пробирок по 5 мкл
буфера для нанесения образцов.
4. В подготовленные пробирки с буфером для нанесения
образцов внести по 5 мкл очищенного ПЦР-продукта
согласно маркировке, используя новый наконечник для
каждой пробы. Тщательно перемешать на вортексе и
осадить капли с крышек пробирок. Оставшийся объем
очищенного ПЦР-продукта поместить в холодильник и
хранить при температуре не выше минус 16 °С до
следующего этапа работы (проведение реакции
секвенирования).
5. Аккуратно внести 10 мкл маркера молекулярных масс в
первую лунку геля и 5 мкл маркера молекулярных масс во
вторую лунку геля. Для правильной оценки концентрации
амплифицированных образцов маркер молекулярных
масс должен быть обязательно представлен в каждом ряду
дорожек геля. Избегать перетекания маркера в соседние
лунки.
6. Аккуратно внести весь объем подготовленной смеси
ПЦР-продукта с буфером для нанесения образцов в
свободные лунки геля, используя новый наконечник для
каждой пробы. Избегать перетекания образцов в соседние
лунки.
7. Для каждого амплифицируемого гена должны быть
обязательно представлены ОК, ВПК, НПК. Аналогично
клиническим образцам приготовить смесь контрольных
образцов с буфером для нанесения образцов и внести в
свободные лунки геля. Для более точного учета результатов
контрольные и клинические образцы по каждому
амплифицируемому гену рекомендуется располагать на
одном ряду.
8. Провести электрофоретическую детекцию согласно
приложению 3.
9. Последовательно провести: а) учет результатов в
контрольных и исследуемых образцах, б) оценку
концентрации в исследуемых образцах.
стр. 43 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 71 ---
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учет результатов ПЦР-исследования проводится по наличию
или отсутствию на электрофореграмме специфических полос
амплифицированных фрагментов ДНК гена протеазы,
фрагмента гена обратной транскриптазы, гена интегразы и
фрагмента гена белка оболочки вируса иммунодефицита
человека типа 1 (ВИЧ-1).
Длины полученных специфических полос
амплифицированных фрагментов ДНК в клинических образцах
должны соответствовать длинам соответствующих фрагментов
ДНК контрольных образцов.
Учет результатов в контрольных образцах
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если
получены правильные результаты для положительных и
отрицательного контролен, в соответствии с таблицей оценки
результатов контрольных реакций (см. табл. 9).
Таблица 9
Контроль Контролируемый этап Специфическая полоса на
электрофореграмме
ОК Экстракция РНК/ДНК, ПЦР Нет
ВПК Экстракция РНК/ДНК, ПЦР Есть
нпк Экстракция РНК/ДНК, ПЦР Есть
1. В дорожках с положительными контролями провести
визуальное сравнение размеров специфических полос
амплифицированных фрагментов ДНК соответствующего
размера (табл. 10) с маркером молекулярных масс.
Характеристика полос маркера молекулярных масс
приведена в табл. 11.
Таблица 10
Амплифицируемая мишень Размер целевого
фрагмента ДНК, пн
Ген протеазы (pro) 570
Фрагмент гена обратной транскриптазы {rev) 765
Ген интегразы (int) 1085
Фрагмент гена белка оболочки (env) при анализе ДНК ВИЧ-1 799
Фрагмент гена белка оболочки (env) при анализе РНК ВИЧ-1 424
2. В дорожках, соответствующих отрицательным контролям
этапа экстракции, не должно быть никаких полос.
стр. 44 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 72 ---
Результаты анализа не подлежат учету в следующих
случаях:
1. Если в каком-либо положительном контроле не выявляется
специфическая светящаяся полоса, то это может
свидетельствовать об ошибках, допущенных на этапе
экстракции нуклеиновых кислот и/или постановках ОТ-ПЦР и
И-го раунда ПЦР. В этом случае требуется повторить
исследование клинических образцов, в которых не
обнаружены специфические полосы, начиная с этапа
экстракции для тех генов, для которых положительный
контроль был отрицательным. Например, если в
положительном контроле на ген протеазы отсутствует
специфическая полоса, необходимо повторить
исследование на ген протеазы для всех клинических
образцов, оказавшихся отрицательными по этому гену.
2. Если в отрицательном контроле (ОК) выявляется
светящаяся полоса, то это может свидетельствовать о
контаминации реактивов или исследуемых образцов.
Требуется повторить исследование для всех
положительных образцов, начиная с первого этапа анализа
(с экстракции нуклеиновых кислот), а также предпринять
меры по выявлению источника контаминации.
Учет результатов в исследуемых образцах
1. Образцами, лодходящими для секвенирования, считаются
образцы, которые содержат специфические светящиеся
полосы на уровнях, соответствующих уровням фрагментов
ДНК контрольных образцов большей или меньшей
интенсивности даже при наличии слабых неспецифических
полос.
ВНИМАНИЕ! Наличие «шмера» и дополнительных
неспецифических фрагментов амплификации над или под
специфической полосой не влияет на качество хроматограмм.
2. При проведении анализа наличия мутаций
резистентности в генах лротеазы, обратной
транскриптазы и интегразы. Для образцов, которые не
содержат специфических светящихся полос на
необходимом уровне и имеют вирусную нагрузку в пределах
аналитической чувствительности набора реагентов,
необходимо провести повторное исследование, начиная с
стр. 45 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 73 ---
первого этапа анализа (экстракция РНК). Если при
повторном исследовании образцы вновь не содержат
слецифических светящихся полос на необходимом уровне,
то по этим образцам выдается результат «не определено ло
причине низкой вирусной нагрузки».
3. При проведении анализа определения тропизма ВИЧ.
Для образцов, амплифицированных на матрице РНК после
экстракции из плазмы крови и не содержащих
специфических светящихся полос на необходимом уровне,
необходимо провести повторное исследование, начиная с
этапа экстракции нуклеиновых кислот. Однако в этом случае
необходимо провести анализ, исследуя провирусную ДНК
вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). То есть,
необходимо провести экстракцию ДНК ВИЧ-1 из клеток
крови, а затем провести один раунд ПЦР для амплификации
целевого фрагмента ДНК. Если при повторном
исследовании образцы вновь не содержат специфических
светящихся полос на необходимом уровне, то по этим
образцам выдается результат «не определено по причине
низкой вирусной нагрузки».
ОЦЕНКА КОНЦЕНТРАЦИИ В ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦАХ
1. Концентрация ДНК в каждом исследуемом образце
определяется путем сравнения интенсивности свечения
специфических полос образцов с интенсивностью свечения
полос маркера молекулярных масс. Характеристика полос
маркера молекулярных масс приведена в табл.11.
Определение концентрации ДНК исследуемого образца
ведется по трем верхним полосам маркера молекулярных
масс.
Таблица 11
Положение полосы
маркера
на агарозном геле
Размер полосы,
п.н.
Количество нг
в 10 мкл маркера
Количество нг
в 5 мкл маркера
Верхняя 1000 100 50
Вторая 700 70 35
Третья 500 50 25
2. Концентрация ДНК в каждом исследуемом образце
определяется путем сравнения интенсивности
стр. 46 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 74 ---
специфических полос образцов с интенсивностью свечения
полос маркера молекулярных масс. На рис. 1 представлен
результат электрофореза образцов имеющих различные
концентрации ДНК. После определения примерной
концентрации ДНК в каждом образце необходимо
подготовить ПЦР-продукты к секвенированию, доведя
концентрацию фрагментов с помощью Н 2О стерильной до
необходимой для проведения реакции секвенирования
согласно рекомендациям, указанным в табл. 11а.
ВНИМАНИЕ! В таблице приведены объемы Н 2О стерильной
для разведения 25 мкл очищенного ПЦР-продукта. Если
количество разводимого ПЦР-продукта не соответствует
25 мкл, объемы Н 2О стерильной должны быть также
пропорционально изменены.
Таблица 11а
Определение количества ДНК в исследуемых образцах
Порядковый
номер в
агарозном
геле на рис.1
Интенсивность свечения полосы
образца по сравнению с
интенсивностью свечения
определенных полос маркера
молекулярных масс
Примерное
количество нг
в 5 мкл
исследуемого
образца
Объем Н2О
стерильной для
доведения ПЦР-
продуктов до
рабочей
концентрации
(кратность
разведения), мкл
3
Больше интенсивности свечения
полосы размером 1000 п.н.,
содержащей 100 нг
Более 100 150 (разведение
в 7 раз)
4
Больше интенсивности свечения
полосы размером 1000 п.н.
маркера в количестве 5 мкл, но
меньше интенсивности свечения
полосы размером 1000 п.н.
маркера в количестве 10 мкл,
содержащих 50 и 100 нг
соответственно
60-100 75 (разведение в
4 раза)
5
Больше интенсивности свечения
полосы размером 700 п.н. маркера
в количестве 5 мкл, но меньше
интенсивности свечения полосы
размером 700 п.н. маркера в
количестве 10 мкл, содержащих 35
и 70 нг соответственно
40-60 40(разведение в
2,6 раза)
стр. 47 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 77 ---
подготовки к секвенированию» и реагенты «Комплекта для
секвенирования», осадить капли с крышек пробирок.
Компоненты реакционной смеси следует смешивать
непосредственно перед проведением анализа.
ВНИМАНИЕ! Реагенты, входящие в состав «Комплекта для
секвенирования» светочувствительны! Не оставлять на свету
в течение длительного времени!
ВНИМАНИЕ! Необходимо ислользовать новые наконечники с
фильтрами для внесения образца в лробирки с разными
реакционными смесями.
Порядок работы
1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом
0,2 мл или 96-луночный планшет (в зависимости от модели
используемого лрибора) для лроведения реакции
секвенирования исследуемых образцов.
ВНИМАНИЕ! Для каждого исследуемого образца необходимо
приготовить количество лробирок объемом 0,2 мл (если
реакция циклического секвенирования будет лроводиться в
пробирках), соответствующее числу праймеров для
секвенирования. При этом лробирки необходимо
промаркировать следующим образом «№ образца/название
праймера» (например, «1/Рго1», «1/Рго2», «1/Rev1», «1/Rev2»,
«1/Rev3», «1/Rev4»).
2. Отобрать необходимое количество лробирок объемом
0,5 мл, соответствующее числу лраймеров для
секвенирования, для лриготовления реакционных смесей.
Промаркировать лробирки согласно ислользуемым
лраймерам для секвенирования (налример, «Рго1», «Рго2»,
«Rev1», «Rev2», «Rev3», «Rev4»).
3. В каждую из лробирок для лриготовления реакционных
смесей внести из расчета на 1 реакцию: 1,0 мкл смеси Seq,
2,0 мкл 5х буфера Seq, 2,0 мкл соответствующего
праймера из комплекта реагентов «Комплект для
подготовки к секвенированию» (например, праймер Рго-1
вносится в пробирку «Рго1», праймер Рго-2 вносится в
пробирку «Рго2» и Т.Д.). Реакционные смеси необходимо
готовить с запасом на один образец (табл. 12). Полученные
реакционные смеси перемешать на вортексе и осадить
капли с крышки пробирки.
стр. 50 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 78 ---
Таблица 12
Приготовление реакционных смесей для реакции
секвенирования
Объем реагентов на
1 реакцию, мкл 1,0 мкл 2,0 мкл 2,0 мкл
Объем реагентов на
указанное кол-во
реакций
Смесь Seq^,
мкл
5х буфер Seq^,
мкл
Праймер'*,
мкл
5 6 12 12
7 8 16 16
9 10 20 20
15 16 32 32
20 21 42 42
4. Аккуратно добавить в каждую пробирку (лунку планшета) в
соответствии с маркировкой по 5 мкл каждой из
приготовленных реакционных смесей.
ВНИМАНИЕ! При использовании пробирок объемом 0,2 мкл
реакционная смесь Рго1 вносится в пробирки,
промаркированные № образца/Рго1. Реакционная смесь Рго2
вносится в пробирки, промаркированные № образца/Рго2 и т.д.
При использовании 96-луночного планшета реакционные смеси
вносятся в определенные лунки в соответствии с шаблоном
заполнения.
5. В подготовленные пробирки (лунки планшета) с
раскапанными реакционными смесями аккуратно внести по
5 мкл очищенных ПЦР-продуктов.
ВНИМАНИЕ! Каждый исследуемый образец внести в
необходимое количество пробирок/лунок планшета,
содержащих раскапанные реакционные смеси (при
исследовании генов протеазы и обратной транскриптазы - в 6,
интегразы - в 4, определении тропизма - в 2), используя при
этом каждый раз новый наконечник с фильтром.
6. Закрыть крышки пробирок. При использовании планшета
закрыть его специальным материалом, предназначенным
для этих целей (например, прозрачной адгезивной пленкой).
7. Перед постановкой в амплификатор при использовании
пробирок перемешать пробы на вортексе и осадить капли с
крышек пробирок кратким центрифугированием на вортексе
Объемы вносимых реагентов приведены с запасом на 1 образец.
стр. 51 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 79 ---
(1-3 с); при использовании планшетов перемешать пробы на
шейкере для планшетов и центрифугировать планшеты на
центрифуге с ротором для планшетов при 2 тыс g в течении
5 с.
Протокол А2. В случае использования набора реагентов
«АмплиСенс*^ H/V-Resist-Seq» в формах комплектации 5, 6,
7, 8.
ВНИМАНИЕ! До начала работы разморозить, тщательно
перемешать на вортексе праймеры из «Комплекта для
подготовки к секвенированию», осадить капли с крышек
пробирок.
Компоненты реакционной смеси следует смешивать
непосредственно перед проведением анализа.
Порядок работы
1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом
0,2 мл или 96-луночный планшет (в зависимости от модели
используемого прибора) для проведения реакции
секвенирования исследуемых образцов.
ВНИМАНИЕ! Для каждого исследуемого образца необходимо
приготовить количество пробирок, кратное числу праймеров
для секвенирования. При этом пробирки необходимо
промаркировать следующим образом: № образца/название
праймера (например, 1/Рго1, 1/Рго2, 1/Rev1, 1/Rev2, 1/Rev3,
1/Rev4).
2. Отобрать необходимое количество пробирок объемом
0,5 мл, кратное числу праймеров для секвенирования, для
приготовления реакционных смесей. Промаркировать
пробирки согласно используемым праймерам для
секвенирования (например, Рго1, Рго2, Revi, Rev2, Rev3,
Rev4).
3. В каждой пробирке приготовить реакционные смеси,
используя соответствующий праймер и стерильную НгО из
комплекта реагентов «Комплект для подготовки к
секвенированию», а также BigDye Terminator vl.1 Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с
инструкцией производителя. Реакционные смеси
необходимо готовить с запасом на один образец.
Полученные реакционные смеси перемешать на вортексе и
осадить капли с крышки пробирки.
стр. 52 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 80 ---
4. В подготовленные для проведения реакции секвенирования
пробирки объемом 0,2 мл или лунки планшета внести
согласно маркировке по необходимое количество
приготовленных реакционных смесей.
5. В подготовленные пробирки (лунки планшета) с внесенными
реакционными смесями, внести 5 мкл очищенной ДНК-
матрицы.
6. Закрыть крышки пробирок. При использовании планшета
закрыть его специальным материалом, предназначенным
для этих целей (например, прозрачной адгезивной пленкой).
7. Перед постановкой в амплификатор при использовании
пробирок перемешать пробы на вортексе и осадить капли с
крышек пробирок кратким центрифугированием на вортексе
(1-3 с): при использовании планшетов перемешать пробы на
шейкере для планшетов и центрифугировать планшеты на
центрифуге с ротором для планшетов при 2 тыс g в течении
5 с.
ВНИМАНИЕ! Необходимо использовать новые наконечники с
фильтром и для внесения образца в пробирки с разными
реакционными смесями.
Протокол Б. Проведение реакции циклического
секвенирования.
1. Запустить программу амплификации SEQ (см. табл. 13).
Поместить пробирки (планшет) в ячейки амплификатора,
закрыть крышку прибора и запустить выполнение
программы.
Таблица 13
Цикл Температура, °С Время Кол-во
циклов
0 96 Пауза
1 96 1 мин 1
96 Юс
2 50 5 с 25
60 4 мин
3 4 хранение
2. По окончании выполнения программы очистить
получившиеся продукты реакции секвенирования от
невключившихся терминаторов. Продукты реакции
секвенирования до проведения стадии очистки могут
стр. 53 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 81 ---
храниться при температуре не выше минус 16°С в течение
3 сут.
ОЧИСТКА ОТ НЕВКЛЮЧИВШИХСЯ ТЕРМИНАТОРОВ И
ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ
СЕКВЕНИРОВАНИЯ
(проводится в зоне Детекции - помещении для детекции
продуктов амплификации)
Для проведения очистки от невключившихся терминаторов в
состав набора реагентов «АмплиСенс® /-//\/-Resist-Seq» входит
раствор F. Однако данный этап может быть проведен другими
способами с использованием реагентов, не входящих в состав
набора.
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна
проводиться в отдельной комнате сотрудником лаборатории,
не производящим манипуляций в зонах Экстракции и
Амплификации.
ВНИМАНИЕ! Для внесения реагентов и продуктов реакции
секвенирования используются одноразовые наконечники с
фильтрами.
Протокол А. Очистка продуктов реакции секвенирования от
невключившихся терминаторов с использованием
раствора F из «Комплекта для подготовки к
секвенированию».
Объем продукта реакции секвенирования - 10 мкл.
1. В пробирки (лунки планшета) с продуктами реакции
секвенирования добавить по 100 мкл раствора F. При
использовании пробирок перемешать пробы на вортексе,
при использовании планшета - на шейкере для планшетов,
не закрывая его адгезивной пленкой.
2. Инкубировать пробирки (планшет) 15 мин при комнатной
температуре.
3. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге с
адаптерами для 0,2 мкл пробирок при 12 тыс g (например,
13 400 об/мин для центрифуги MiniSpin, Eppendorf) в
течение 20 мин. При использовании планшета
центрифугировать пробы на центрифуге с ротором для
планшетов при 2 тыс g в течение 30 мин.
стр. 54 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 96 ---
СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и
ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком
годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых
реагентов соответствует сроку годности, указанному на
этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не
указано иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при
температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут.
Хранение. Комплекты реагентов «РИБО-золь-Е», «РИБО-лрел»
и «Ампли-сорб», а также реагенты ГЕМОЛИТИК, раствор для
лизиса, раствор для преципитации, ПКО ДНК ВИЧ-1 и ОКО
хранить при температуре от 2 до 8 °С. тРНК 1 мкг/мкл,
калибратор HIV-Q и растворитель О (из комллекта реагентов
«РИБО-золь-Е») хранить при температуре не выше минус 16 °С.
Комплекты реагентов «ОТ-ПЦР-комллект-Pro/Rev», «ОТ-ПЦР-
комплект-lnt», «ОТ-ПЦР-комплект-Env», «ПЦР-комллект-
Pro/Rev», «ПЦР-комплект-lnt», «ПЦР-комплект-Env», «Комплект
для подготовки к секвенированию Pro/Rev», «Комплект для
лодготовки к секвенированию Int», «Комплект для подготовки к
секвенированию Env», «Комплект для секвенирования»
хранить при температуре не выше минус 16 °С.
«Комплект для секвенирования» хранить в защищенном от
света месте.
Комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 до
25 °С в защищенном от света месте.
ВНИМАНИЕ! Не допускается замораживание/оттаивание
реагентов из «Комплекта для секвенирования» и раствора для
денатурации из «Комплекта для подготовки к секвенированию»
более двух раз.
стр. 69 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 97 ---
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ
Изготовитель гарантирует соответствие основных
параметров и характеристик набора реагентов требованиям,
указанным в технической и эксплуатационной документации, в
течение указанного срока годности при соблюдении всех
условий транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество набора реагентов направлять по
адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. ЗА, e-mail:
obtk@pcr.ru^.
При выявлении побочных действий, не указанных в
инструкции по применению набора реагентов, нежелательных
реакций при его использовании, фактов и обстоятельств,
создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских
работников при применении набора реагентов, рекомендуется
направить сообщение по адресу, указанному выше, и в
уполномоченную государственную регулирующую организацию
(в РФ - Федеральная служба по надзору в сфере
здравоохранения) в соответствии с действующим
законодательством.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора
Директор
ГБУЗ МО МОНИКИ
им. М.Ф. Владимирского
Е.Н. Родионова
К.Э. Соболев
" Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amplisens.ru,
стр. 70 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 98 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Экстракция РНК из плазмы крови при использовании
комллекта реагентов «РИБО-золь-Е»
Объем исследуемого материала для экстракции РНК -
0. 2.мл или 1,0 мл.
В случае необходимости предварительное
ультрацентрифугирование 1,0 мл плазмы должно
проводиться в течение 1 ч при скорости центрифуги не
менее 24000 д при температуре от 2 до 8 °С с
использованием пробирок на 1,5 мл. Сразу после окончания
ультрацентрифугирования необходимо удалить 800 мкл
надосадочной жидкости и работать с осадком (200 мкл) как
описано ниже.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать
только одноразовые стерильные пластиковые расходные
материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free,
DNase-free.
ВНИМАНИЕ! Перед началом процедуры экстракции
поместить флакон с раствором для отмывки 3 ^ в
морозильную камеру с температурой не выше минус 16 С,
включить центрифугу с охлаждением и задать температуру
от 2 до 8 °С.
Порядок работы:
1. Подготовить калибратор HIV-Q к работе (используется для
приготовления положительных контролей). Для этого
осадить на вортексе содержимое пробирки калибратор HIV-
Q, аккуратно открыть крышку и, избегая распыления
содержимого, добавить 250 мкл растворителя Q. Плотно
закрыть пробирку и оставить ее на 15 мин при комнатной
температуре, периодически перемешивая на вортексе.
После полного растворения осадить содержимое пробирки
калибратор HIV-Q на центрифуге/вортексе в течение 3-5 с
для сброса капель с крышки.
2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок
на 1,5 мл (включая отрицательный (ОК) и положительные
контроли экстракции — высококонцентрированный
положительный контроль (ВПК) и низкоконцентрированный
положительный контроль (НКП). Промаркировать пробирки.
3. В пробирки внести по 400 мкл раствора D.
стр. 71 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 99 ---
4. В пробирки внести по 200 мкл исследуемых образцов,
используя наконечники с фильтром. Закрыть крышки и
перемешать на вортексе. Осадить на центрифуге для
сброса капель жидкости с крышки.
5. Для каждой панели необходимо поставить положительные
контроли (ВПК, НПК). Для этого в пробирку с раствором D,
подписанную ВПК, добавить 200 мкл растворенного
калибратора HIV-Q. В пробирку с раствором D,
подписанную НПК, добавить 10 мкл растворенного
калибратора HIV-Q и 190 мкл ОКО. Содержимое пробирок
ВПК и НПК перемешать на вортексе и осадить капли
жидкости с крышки кратким центрифугированием.
6. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный
контроль (ОК). Для этого в пробирку с раствором D,
подписанную ОК, добавить 200 мкл ОКО, перемешать на
вортексе и осадить капли жидкости с крышки кратким
центрифугированием.
ВНИМАНИЕ! После добавления раствора D проба может
раствориться не полностью. Полное растворение происходит
после добавления раствора Е и раствора А.
7. Добавить к образцам, лизированным в растворе D, по
40 мкл раствора Е. Перемешать на вортексе.
Центрифугировать для удаления капель с крышки пробирки.
8. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора А, перемешать
на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с
крышки пробирки.
9. Добавить в пробирки по 130 мкл раствора В. Перемешать
на вортексе не менее 15-20 с, пока раствор не станет
равномерно молочно-белым.
10. Поставить пробирки в морозильную камеру с температурой
не выше минус 16 °С на 10 мин.
11 .Центрифугировать пробирки 10 мин при 10-16 тыс g (если
количество пробирок нечетное, уравновесить центрифугу
пробиркой на 1,5 мл, содержащей примерно 1,0 мл воды). В
процессе центрифугирования раствор разделится на две
фазы: нижнюю, содержащую белки и ДНК, и верхнюю -
водную, содержащую РНК.
12. Во время центрифугирования образцов отобрать новые
пробирки объемом 1,5 мл в количестве, соответствующем
количеству обрабатываемых образцов, включая контроли.
стр. 72 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 100 ---
Внести в каждую пробирку по 500 мкл раствора С, 10 мкл
тРНК 1 мкг/мкл (препарата нагрузочной РНК) и по 10 мкл
гликогена 1%.
13. Из пробирок с клиническими и контрольными образцами
после центрифугирования аккуратно отобрать верхнюю
фазу (приблизительно 500-550 мкл), используя наконечники
с фильтром, и перенести в пробирки, содержащие
раствор С, тРНК 1 мкг/мкл и гликоген 1%.
14. Перемешать на вортексе, центрифугировать для удаления
капель с крышки пробирки и поставить в морозильную
камеру с температурой не выше минус 16 °С на 20 мин.
15. Центрифугировать пробирки 10 мин при 10—16 тыс д.
Визуально найти положение осадка РНК (если пробирка
была помещена в центрифугу «хвостиком» или меткой на
крышке пробирки вверх, то осадок после
центрифугирования будет находиться на дне пробирки
строго под «хвостиком» или меткой). Аккуратно отобрать
надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для
каждой пробы. Если осадок не виден, отобрать
надосадочную жидкость, не касаясь стенок, оставив на дне
пробирки примерно 20 мкл.
16.Осадок ресуспендировать в 800 мкл холодного раствора
для отмывки 3. Перемешать на вортексе,
центрифугировать 10 мин при 10-16 тыс д. Отобрать
надосадочную жидкость, не задевая осадка.
17. Подсушить осадок в термостате для микропробирок при
температуре 56 °С в течение 5-7 мин. При этом крышки
пробирок должны быть открыты.
18. Растворить осадок в 50 мкл РНК-буфера (в случае
одновременного анализа образца на наличие мутаций
устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам,
расположенных в генах протеазы, обратной транскриптазы,
интегразы, а также определения тропизма ВИЧ необходимо
увеличить объем элюции до 70 мкл), прогреть при
температуре 56 °С в течение 5 мин. Надосадочная жидкость
содержит очищенную РНК. Пробы готовы к постановке
реакции обратной транскрипции и ПЦР.
Раствор РНК можно хранить при температуре не выше
минус 68 °С в течение года.
стр. 73 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 101 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
А1. Экстракция ДНК из цельной крови при использовании
комплекта реагентов «РИБО-преп»
Объем клинического материала для экстракции ДНК -
0. 25.мл.
Порядок работы
Подготовка клинического материала при экстракции _ДНК из
цельной КРОВИ.
1. Раствор для лизиса (если он хранился при температуре
от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 65 °С до полного
растворения кристаллов.
2. Центрифугировать первичную пробирку с кровью при 800-
1600 g в течение 20 мин.
3. Отобрать необходимое количество пробирок на 1,5 мл с
завинчивающейся крышкой (включая контроли) и
промаркировать. В пробирки, предназначенные для
клинических проб, внести отдельными наконечниками по
1,0 мл гемолитика и по 0,25 мл лейкоцитарного кольца
(находится на разделе двух фаз - плазмы и клеточной
фракции крови) соответственно маркировке. Закрыть
пробирки и аккуратно перемешать содержимое пробирок на
вортексе.
4. Оставить пробирки при комнатной температуре на 5 мин,
затем еще раз аккуратно перемешать содержимое пробирок
на вортексе и оставить на 5 мин.
5. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при
8 тыс g в течение 2 мин. Надосадочную жидкость отобрать с
помощью вакуумного отсасывателя, не задевая осадка.
Полученный осадок лейкоцитов следует немедленно
лизировать или заморозить лри температуре не выше
минус 16 °С и хранить 2 нед, а лри темлературе не выше
минус 68 °С - длительное время.
Примечание - Полученный осадок лейкоцитов может быть
транспортирован при температуре не выше минус 16 °С в
другую лабораторию для продолжения процедуры анализа.
Лизис клинического материала
1. Для каждой панели необходимо лоставить положительные
контроли (высококонцентрированный ПК (ВПК),
низкоконцентрированный ПК (НПК)). Для этого в
стр. 74 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 102 ---
пробирку, подписанную ВПК, добавить 50 мкл ПКО ДНК
ВИЧ-1 и 50 мкл ОКО. В пробирку, подписанную НПК,
добавить 5 мкл ПКО ДНК ВИЧ-1 и 95 мкл ОКО.
2. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный
контроль (ОК). Для этого в пробирку, подписанную ОКО,
добавить 100 мкл ОКО.
3. Добавить в пробирки с лейкоцитами и в пробирки с
контрольными образцами по 300 мкл раствора для лизиса.
4. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и
прогреть в термостате при температуре 65 °С в течение
5 мин.
5. Сбросить капли жидкости с крышки кратким
центрифугированием и добавить в пробирки по 400 мкл
раствора для преципитации. Перемешать на вортексе.
6. Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге при
12 тыс g в течение 5 мин.
7. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая
осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный
наконечник без фильтра для каждой пробы.
8. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3,
плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок,
переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести
процедуру одновременно для всех пробирок. Для этого
необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой
или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.
9. Процентрифугировать при 12 тыс g в течение 1-2 мин на
микроцентрифуге.
10.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную
жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный
наконечник без фильтра для каждой лробы.
11. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4,
плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок,
переворачивая пробирки 3-5 раз.
12. Процентрифугировать при 12 тыс g в течение 1-2 мин на
микроцентрифуге.
13.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную
жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный
наконечник без фильтра для каждой пробы.
14.Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на
стр. 75 из 81
72967
12.10.2021
--- стр. 103 ---
5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок
должны быть открыты).
15. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать
на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 С
на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
16. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс g в течение
1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость
содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить в течение 1 нед при
температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при
температуре не выше минус 16 °С.
Примечание - Очищенная ДНК может быть
транспортирована при температуре не выше минус 16°С в
другую лабораторию для продолжения процедуры анализа.
А2. Экстракция ДНК из сухих пятен крови при
использовании комплекта реагентов «РИБО-преп»
Объем клинического материала для экстракции РНК/ДНК —
1 сухое пятно крови.
Примечание - Раствор для лизиса (если он хранился при
температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 65 С до
полного растворения кристаллов.
1. Отобрать необходимое количество пробирки на 1,5 мл
(включая контроли) и промаркировать их.
2. Отобрать необходимое количество заранее
простерилизованных компостеров (с диаметром 6 мм).
3. Используя для каждого образца отдельный компостер
выбить в соответствующие пробирки круги с сухими пятнами
крови. Для получения достаточного количества материала
компостером необходимо вырезать одно целое пятно крови,
последовательно совершая 4-5 вырезаний.
4. Для каждой панели необходимо поставить положительные
контроли {высококонцентрированный ПК (ВПК),
низкоконцентрированный ПК (НПК)). Для этого в
пробирку, подписанную ВПК, добавить 50 мкл ПКО ДНК
ВИЧ-1 и 50 мкл ОКО. В пробирку, подписанную НПК,
добавить 5 мкл ПКО ДНК ВИЧ-1 и 95 мкл ОКО.
5. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный
контроль (ОК). Для этого в пробирку, подписанную ОК,
СТр. 76 ИЗ 81
72967
12.10.2021
--- стр. 104 ---
добавить 100 мкл ОКО.
6. В пробирки, содержащие бумагу с сухими пятнами крови, и с
контрольными образцами добавить по 700 мкл раствора
для лизиса. Закрыть пробирки и аккуратно перемешать
содержимое пробирки на вортексе.
7. Переставить пробирки в термостат и прогреть при 65 °С в
течение 30 мин. Во время инкубации пробирки необходимо
встряхивать на вортексе каждые 8-10 мин.
8. Во время инкубации необходимо приготовить и
промаркировать необходимое количество новых пробирок
на 1,5 мл для клинических образцов.
9. Вынуть из термостата пробирки и процентрифугировать их
на микроцентрифуге при 10 тыс g в течение 1 мин.
10. Для клинических образцов перенести надосадочную
жидкость в соответствующие промаркированные новые
пробирки.
ВНИМАНИЕ! Необходимо перенести максимальное количество
жидкости. Для этого во время отбора жидкости наконечником
необходимо отжимать бумагу, находящуюся в осадке.
Допустимо попадание небольшого количества бумаги вместе с
отобранной жидкостью в новые пробирки.
11. Добавить в пробирки по 600 мкл раствора для
преципитации, перемешать на вортексе.
12 . Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге при
12 тыс g в течение 5 мин.
13. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая
осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный
наконечник без фильтра для каждой пробы.
14. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3,
плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок,
переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести
процедуру одновременно для всех пробирок, для этого
необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой
или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.
15. Процентрифугировать при 12 тыс g в течение 1-2 мин на
микроцентрифуге.
16.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную
жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный
наконечник без фильтра для каждой пробы.
стр. 77 из 81
72967
12.10.2021