Набор реагентов "Urit CD3 Assay Kit, Model: CD3 FITC" для определения популяции клеток, экспрессирующих антиген CD3, методом цитофлуориметрии в образцах крови человека — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
Approved by
«URIT Medical Electronic Co., Ltd.»
Position Jie Huang (Vic^^c^std€;n
_ ■
Signatii re л. ' vt' ^ ,.
ИНСТРУКЦИЯ n o ПРИМЕНЕНИЮ
«Набор реагентов «Urit CD3 Assay Kit, Model; CD3 FITC» для определения
популяции клеток, экспрессирующих антиген CD3, методом
цитофлуориметрии в образцах крови человека»
Разработчик и производитель: УРИТ Медикал Электроник Ко., Лтд., КНР /
URIT Medical Electronic Co., Ltd., P.R. China.
2025
--- стр. 4 ---
Инструкция по применению набора реагентов
«Urit C D 3 Assay Kit, Model: C D 3 F IT C » для
определения популяции клеток,
экспрессирующ их антиген C D 3, методом
цитофлуориметрии в образцах крови человека
Набор реагентов «Urit CD3 Assay Kil, Model: CDS FITC» для
определения популяЕхии клеток, экспрессирующих антиген
CD3. методом цитофлуориметрии в образцах крови человека
1. Назначение
Используется для обнаружения и количественного подсчёта
клеток, экспрессирующих антиген CD3+ в образцах цельной
(венозной и капиллярной) крови человека, обработанной
антикоагулянтом ЭДТЛ-2, методом проточной цитометрии с
детекцией флуоресцентных маркеров при определении
иммунного статуса человека.
Функциональное назначение: используется при комплексной
оценке клеточного иммунитета для определения иммунного
статуса человека.
Применяется квалифицированным персоналом (врачом
клинической лабораторной диагностики, врачом-лаборантом,
медицинским лабораторным техником. биологом) в
клинико-диагностических лабораториях.
ПопуляциоЕ 1ныс. дсмоЕ'рафические аспекты отсутствуют.
2 . Область применения
Клиническая лабораторная диагностика in vitro.
3. Принцип метола
В реагенте используется метод прямого окрашивания. Когда к
реагенту добавляется цельная кровь, меченные флуорохромом
антитела в реагенте специфически связываюзся с антигенами
клеточной поверхности. Во время сбора данных, клетки
проходят мимо лазерного пучка и рассеивают лазерное
излучение. Эти сиЕналы рассеивания и флуоресценции,
обнаруживаемые прибором, предоставляют информацию о
размере клетки, внутреннем составе и относительной
интенсивности флуоресценции.
4. Научное обоснование аналнта
CD3+ — это трансмембранный белковый комплекс,
ассоциироваЕЕный с Т-клеточным рецептором, который
является ключевым маркером зрелых покоящихся (иеетэктньех )
Т-лимфоцитов. CD3+ присутствует Eia поверхности
большинства T-joicix)k (включая CD4+ и CD8+ субпопуляции)
и играет кризическую роль в передаче сигналов при
активации иммунного ответа.
СПЗ является универсальЕЕым маркером 1-лимфоцитов и
широко используется в иммунологии и клинической
диагностике. Его экспрессия стабильна и Eie зависит от
фуЕЕКционального состояния клетки. СПЗ включен в
диагЕюстические панели для оценки иммунноЕХ) статуса
и используется для оценки эффективности подбора
терапии и при комплексной ОЕгенке состояний орЕднизма.
требующих вмешательства (усиления или подавления) в
Т-клеточное звено иммунитета.
5. Транспортировка и хранение набора
5.1 Транспортировка изделия должна осуществляться
всеми видами крьЕТОЕЧ) транспорта в соответствии с
действующими правилами перевозок. Условия
Е рансЕюрт ировки осуществляются при допустимом
температурном режиме: от +2 до +8°С.
5.2 Храните изделие при температуре 2®С-8°С. Не
замораживайте и не подвергайте его воздействию
прямого света.
5.3 В случае дробного использования Набора
компоненты следует хранить при температуре 2®С-8®С.
После открьЕтия его можно хранить в течение 8 месяцев.
5.4 Срок 1Х)дности: не вскрытый реагент можно
стабильно хранить в течение 18 месяцев с даты
ЕЕроизводства.
5.5 Для получения надёжных результатов необходимо
строгое соблюдение инструкции по применению
Ha(Sopa.
5.6 Допустимое время транспортировки — не более 7
ДЕЕеЙ.
6. Показания и противопоказания к применению
медицинского изделия
Используется для обнаружения и подсчёта kjectok ,
эксЕфсссирующих антиЕ-ен СПЗ в образцах цельЕЕой
(венозной и капиллярной) крови человека.
Рекомендуется к назначению для контроля ЕЕОказателей
иммунноЕХ) статуса в динамике в ходе комплексноЕХ)
иммунологическоЕХ) обследования.
НротивоЕюказания к медициЕюкому изделию
отсутствуют.
7. Популяционные и демографические аспекты
применения набора pcaieiriOB
Изделие ЕЮЕЕуляционно и демоЕрафически не зависимо.
8. Информация о потенциальных потребнте.1Ях
медицинского изделия
Набор предназЕЕачеЕЕ для ЕЕрименеЕЕИя только для диагностики
in vitro в клинико-диагЕЕОСТИческих лабораториях.
Применяется квалифицированЕЕЫм персоналом (врачом
клинической лабораторной дизгееостики . врачом-лаборантом.
медициЕЕСким лабораторным техником. биологом) в
клинико-диагЕЕОстических лабораториях).
9. Используемые анализаторы
Данный набор реаЕОЕЕТов предЕЕазЕЕачсЕЕ для использования на
цитофлуориметрах серии BF производства комееэееии УРИТ
Медикал Электроник Ко.. Лтд.. КНР / U RIT Medical Electronic
Co.. Ltd., P.R. China.
10. .Аналитические характеристики
10.1 Точность
Все клеточные анализы с известными целевыми значениями
находятся в пределах целевых значений анализа.
10.2 Линейность разведения
Среднее число ЕЕОвгорных значений теста для каждого
разведения до ;ежеео находиться в пределах абсолютЕЕЫх 3%
Ш ЕИ относительЕЕЫх 8 % от медианы всех зеезчсееий теста на
разведение.
10.3 Воспроизводимость в пределах анализа
Реагенты были ЕЕротестированы дважды для одного и того же
образца (п = 10). и результаты должееы соответствовать
следующему: разЕЕИца между зеезчсееиями должееэ быть не
более 15% для тех результатов, где содержаЕЕие СПЗ+ клеток
составляет более чем 30% от общего числа Т-лимфоцитов;
Разница между значениями должна составлять менее 6% для
тех результатов, где содержание СПЗ+ юЕеток составляет
менее чем 30% от общего числа Т-лимфоцитов.
10.4 ВосЕЕроизводимость между аЕЕализами
Реагенты из трех ЕЕартий, протестировзЕЕЕЕые на одном и том
же образце, должееы давать следующие результаты: разница
между значениями должна быть не более 15% для тех
результатов, где содержание СПЗ+ клеток состав.зяет менее
30% от обЕЕхего числа Т-лимфоцитов: разЕЕИца между
значениями должна быть не более 6% д;ея тех результатов, где
содержание СПЗ+ клеток составляет более 30% от общего
числа Т-лимфоцитов.
10.5 СтабильЕЕОсть окрашивания
После окрашивания образца реаЕеЕЕтами. измеЕЕение
результатов между Еювторными испытания.ми ЕЕроводилось в
течение 24 часов. В предыдущем исееветзееии разница между
двумя испытаниями до и после измеЕЕения до.лжна
соответствовать следующему:
--- стр. 5 ---
значение I) должно составлять не более 8% для тех
результатов, где содержание CD3+ клеток составляет не менее
30% от общею числа лимфоцитов:
значение I) должно составлять не более 10% для тех
результатов, где содержание CD 3+ клеток составляет от 10 до
30% от общего числа лимфоцитов:
значение D должно составлять не более 30 % для тех
результатов, где содержание CD3+ клеток составляет менее
10% от общего числа лимфоцитов.
10.6 Интервал и:шсрения:
5 — 95% для 03 носитсльного значения (% от лимфоцитов).
11. Состав набора
Набор рсщ-ентов «Urit CD3 Assay Kit. Model: CD3 FITC» для
онр>еделения популяции клеток, экспрессирующих антиген
CD3. метолом цитофлуориметрии в образцах крови человека,
в вариантах исполнения:
1. Набор реагентов «Urit CD3 Assay Kit. Model: CD3 FITC»
для определения популяции клеток, экспрессирующих антиген
CD3. метолом цитофлуориметрии в образцах крсэви человека
на 50 тестов, в составе:
1) Антитела к антигену СПЗ, меченые флуоресцеином
изотиоционата (Urit СПЗ Assay Kit. Model: СПЗ FITC) - I
флакон / 1 мл.
2) Инструкция (Instruction) - 1 шт.
2. Набор реагентов «Urit СПЗ Assay Kit, Model: СПЗ FITC»
для определения популяции клеток, экспрессирующих антиген
СПЗ. метолом цитофлуориметрии в образцах крови человека
на 100 тестов, в составе:
1) Антитела к антигену СПЗ, меченые флуоресцеином
изотиоционата (Urit СПЗ Assay Kit, Model: СПЗ FITC) — 1
флакон /2 мл.
2) Инструкция (Instruction) - 1 шт.
Химический состав антител к антигену СПЗ, меченых
флуоресцеином изотиоционата:
11азвание
шмпонента
Регистрационный
номер CAS
химического
компонента
Содержание
(%)
Натрия хлорид 7647-14-5 <0.9
Калия хлорид 7447-40-7 < 0.03
Додекагидрат 10039-32-4 <0.4
двузамещенный
фосфата натрия
Калия фосфат
двухосновный.
безводный
Альбумин
бычьей
сыворотки
СПЗ-FITC
Proclin 300
Вода
7758-11-4
9048-46-8
96118-96-6
7732-18-5
<0.03
<0.05
< 0.01
<0.15
<98.56
12. .Меры прелосторожностн
12.1 ЬСласс риска изделия - 2а (Согласно Приказу
Минздрава РФ № 4н «Об утверждении номенклатурной
классификации .медицинских изделий» от 06.06.2012).
12.2 Такие потенциальные инфекционные агенты, как
клинические образцы, средства контроля качества,
калибраторы, лабораторные отходы, продукты с
истекшим сроком годности следует профилактически
обрабатывать.
12.3 Неоткалибровагшый цитофлуориметр.
неправильно компенсированные сигналы
флуоресценции и неточные гейты мшут привести к
ложным результатам теста.
12.4 Реагенты следует хранить в холодном и
защищенном от света месте. Во время использования их
также следует хранить вдали от света.
12.5 Данный продукт содержит флуоресцеин. он не
должен напрямую контактировать с кожей или
контаминироваться пищевыми продуктами, при работе
необходимо надевать перчатки. Чтобы предотвратить
совокупный ущерб, вызванный длительным контактом с
продуктом, лаборатория должна предпринимать
разумные меры биобезопасности и процедуры защиты.
12.6 Операторы эксперимента должны пройти
профессиональную подготовку в области
цитофлуориметрии и иметь соответствующую
квалификацию.
12.7 Данный продукт используется только для
диагностики in vitro, а результаты предназначены для
клинического справочника. Клинический диагноз и
лечение пациентов следует всесторонне рассматривать в
соответствии с их симптомами/признаками, историей болезни,
други.ми лабораторными тестами и реакцией на лечение.
12.8 Не используйте реагент с истёкшим сроком годности.
12.9 Не замораживайте рэеагент.
12.10 Перед использованием необходимо выдержать реагент
при комнатной температуре.
12.11 Все образцы крови следует рассматривать как
потенциально инфицированные. При работе с ними
необходима соблюдать все меры предосторожности (в
частности, использовать защитные перчатки, халат и очки).
12.12 После завершения работы пробирки с кровью и все
одноразовые материалы необходимо поместить в специальные
контейнеры для утилизации.
12.13 Реагент предназначен дтя однократного применения.
12.14 Утилизация неиспользованных реагензхэв. реагентов с
истекшим сроком годности, а также использованных
реагонтов, в том числе флаконов, содержащих образцы
анализируемого материала, инструменты и предметы,
зафязненные биологическим материалом, должна
осуществляться в соответствии с требованиями С'анПиП
2.1.3684-21.
12.15 Производитель сообщает, что в составе содержатся
компоненты биологического происхождения. Материалы
животного происхождения (антитела), используемые при
производстве набора. сопровождались официальным
везеринарным свидетельством о состоянии здоровья
животных. Компоненты животного проис.хождения были
получены от здоровых животных под наблюдением
ветеринара, которые не были подвержены иЕ|фекционным.
заразным и паразитическим заболеваниям. Тем не менее, с
изделием необходимо обращаться так же, как и с
потенциально опасным перэеносчиком инфекционных
заболеваний, используя средства индивидуальной защиты, а
также тщательно мыть руки после работы с и:эдслие.м.
13. Утилизация
13.1 Компоненты изделия не содержат токсичных и
взрывоопасных веществ. представляющих угрозу
окружающей среды и здоровью медицинского персонала.
13.2 После завершения теста уберите использованные
флаконы с реагентами, калибраторами, шнтролями и
образцами из анализатора.
13.3 Компоненты набора реагентов «Urit CD3 Assay Kit, Model:
СПЗ F irC » для определения популяции клеток.
--- стр. 6 ---
)кс1 1рессир\ ющих антиг-ен СПЗ, методом цитофлуориметрии в
обращах крови человека содержат биологический материа.ч.
Утилизация изделия, а также инструментов и предметов,
загрязненных биологическим материалом. должна
проводиться с использованием защитной одежды (перчатки,
медицинский халат).
13.4 Биологический материал, включая инструменты и
предметы, зафязненные материалом, относятся к классу
опасности медицинских отходов Б.
13.5 Для утилизации компонентов набора использовать
подходящие контейнеры во избежание загрязнения
окружающей среды.
14. Оборудование и материалы, необходимые при работе
с набором
• Цитофлуориметр серии BF производства компании УРИТ
Медикал Электроник Ко., Лтд.. КНР / URJT Medical
Electronic Co., Ltd.. P.R. China;
• Лизирующий раствор «U RIT Lyse. Model; BFL-70» для
предварительной обработки образцов перед анализом на
цитофлуориметре серии BF;
• Очищающая жидкость «U RIT Detergent. Model: BFD-70» для
обслуживания цитофлуориметров серии BF;
• Проточная жидкость «UR1T Sheath, Model; BFS-70» для
обслуживания цитофлуориметров серии BF;
• Одноразовые медицинские перчатки;
• Пробирки и материалы дтя отбора проб;
• Автоматические дозаторы с одноразовыми наконечниками
на 20. 100 и 500 мкл;
• Пластиковые пробирки для гемолиза;
• Миксер (вортекс);
• Одноразовые медицинские перчатки;
• Холодильная камера. подтерживающая температуру
+2-+8 °С;
• Ёмкость для утилизации использованных материалов.
15. Информация об интерферирующих веществах
Когда концентрация билирубина, дексаметазона, гемоглобина
и триглицерида превышает клиническую концентрацию,
существенного влияния на зффект обнаружения набора
реагентов не оказывается.
При анализе с набором реагентов обратите внимание на
недавнее использование даунорубицина пациентом, чтобы
избежать ложноположительных результатов.
16. Подготовка образцов
16.1 Для этой процедуры требуется минимум 200 мкл цельной
крови.
16.2 Собранную кровь с.ледует обрабатывать
антикоа 1Л’лянтом ЭДТА-К2 и хранить при
комнатной температуре (20-25 ®С).
16.3 Тестирование отобраннош образца следует
выполнить в течение суток.
16.4 Кровь с антикоагулянтом должна быть окрашена в
течение 24 часов после взятия. избегая
встряхивания.
16.5 Если образец необходимо транспортировать, это
можно сделать при комнатной температуре. Если
есть особые требования, это также можно
осуществить при температуре 2°С-8®С.
16.6 После обработки лизирующим раствором образец
следует хранить при температуре 2-8°С и
анализировать в течение 6 часов после
окрашивания. Время достижения устойчивых
результатов - 40 - 60 минут.
16.7 Необходимо избегать образцов с
микробиологическим загрязнением, хилезом.
наличием сгустков или нежизнеспособными
клетками. Если образец соответствует
вышеуказанным условиям и его нельзя заменить па
другой, это необходимо отметить в протоколе
исследования.
17. Подготовка к использованию
Набор реагентов готов к использованию, специальная
подготовка не требуется.
18. Процедура
18.1 Протокол ана.тиза
(1) Внесите пипетюй 20 мкл реагента на дно
одноразовой полистироловой пробирки размерс)м 12^75
м.м.
(2) Убедитесь, что образец крови достатч)чно перемешан
и однороден. Обратной пипетютй внесите 100 мкл
образца крови па дно пробирки.
(3) Закройте пробирку и осторожно перемешайте на
вихревой мешалке со скоростью не более 500 об/мин.
Инкубируйте 20-25 минут в темноте при комнатной
температуре.
(4) Внесите пипеткой 900 мкл готового к использованию
лизируюшего раствора в пробирку.
(5) Закройте пробирк>' и осторожно перемсЕнайте на
вихревой мешалке со скоростью не более 500 об/мин.
Инкубируйте 15 минут в темноте при комнатной тс.мпературе.
(6) После обработки лизирующим растворо.м его следует
хранить при температуре 2—8°С и анализировать в течение 6
часов после окрашивания. Перед получением данных на
цитофлуориметре. перемешайте образец на вихревой мешалке
со скоростью не более 500 об/мин.
18.2 Результаты
При использовании профаммного обеспечения
цитофлуориметра. результаты показывают положительные
клетки в процентах от лимфоцитов.
Сначала строится диафамма рассеяния FSC (forward
scatter)/SSC (side scatter) (отношения прямого к боковому
рассеянию). Методом гейтирования считается общий процент
лимфоцитов в образце (рис. 1а).
Затем строится диаграмма рассеяния CD3/SSC (отношения
флуоресценции антител, конъюгированных FITC к боковому
рассеянию) - рис. 16.
У
с .
} * i > >
' 1
3
1
•. ■ !
- •
C D 3 -
1С^ «5*
Рисунок 1: (а) График рассеяния FSC/SSC (прямого
светорассеяния к боковому); (Ь) График рассеяния CD3/SSC
(флуоресценция антител, конъюгированных FITC к боковому
рассеянию).
19. Референсные интервалы
Международные стандарты для референсных интервалов для
CD3+ указаны в следующей таблице:
Относительные значения для здоровых пациентов:
Возрастная фуппа CD3+ (% )
Новорожденные (0-1 мес) 60-80%
Грудные дети (1-12 мес) 55-75%
Дети 1-3 года 50-70%
Дети 4-6 лет 45-65%
--- стр. 7 ---
Возрастная группа
Дети 7-12 лет
Подростки (13-18)
Взрослые (>18)
CD3+ (%)
40-60%
50-70%
60-80%
Сам производитель использует данные значения рсференсного
интервала_на_3_51 пациенте:
_________________________________
Маркер ______Диапазон 95% _________
CD3+ 55,84%-81,57%
Производитель рекомендует каждой лаборатории
использовать свои собственные референсные значения.
20. Результат анализа
Неправильная и}перпретаиия результатов может оказать
существенное влия14ие на диагностику и лечение пациентов.
Предполагается, что лабораторный персонал, ответственный
за интерпретацию данных и составление отчетов, должен
иметь соответствующее техническое образование и
клинический опыт. Это необходимо для разумной
медицинской интерпретации экспериментальных данных.
При получении аномальных результатов важно учитывать, не
настроен ли цитофлуориметр неправильно. Неправильный
инструмент, неадекватная компенсация флуоресценции или
неправильное тойтирование могут привести к неверным
результатам.
Если результат ненормальный, можно протестировать
концентрацию лейкоцитов. При необходимости образец
можно разбавить или увеличить концентрацию перед
повторным окрашиванием.
21. Ограничения
Результаты анализа предназначены тольш для к.линического
использования. Клинический диагноз и лечение пациентов
следует всесторонне рассматривать с учетом их симптомов,
истории болезни, дру 1их лабораторных тестов и реакции на
лечение.
22. Процедура внутреннею контроля
Для контроля отбирались три единицы продукции из каждой
произведённой партии, две из них должны быть из первой
партии, а одна последней из партии. Производственная партия
признавалась неквалифицированной, если хотя бы одна
упаковка из них не соответствует стандартам проверки.
Исследование стабильности функциональных
характеристик
Три партии набора реагентов «Urit СПЗ Assay Kit. Model:
СПЗ Е1ТС» для определения популяции к-лсток.
экспрессирующих антиген СПЗ, методом
цитофлуориметрии в образцах крови человека
оценивали на предмет всесторонней аналитической
эффективности. включая точность. линейность
разведения. прецизионность внутри серии.
прецизио}тность между сериями и все аспекты
стабильности окрашивания.
(1) Точность
Результаты реагентов для клеток с известными
целевыми значениями находились в пределах диапазона
подсчитанных целевых значений.
(2) Линейность разведения
Медианное значение повторного испытания для
каждогхэ разведения должно находиться в пределах 3%
абсолютного или 8% относительного значения
медианного испытания для всех разведений.
(3) Воспроизводимость в пределах анализа
Реагенты были протестированы дважды для одного
и того же образца (п = 10). и результаты должны
соответствовать следующему; разница между
значениями должна быть не более 15% для тех
результатов, где содержание СПЗ+ клеток составляет
более чем 30% от общего числа Т-лимфоцитов; Разница
между значениями должна составлять менее 6% для тех
результатов, где содержание СПЗ+ клеток составляет
менее чем 30% от общего числа Т-лимфоцитов.
(4) Воспроизводимость между анализами
Реагенты из трех партий, протестированные на
одно.м и том же образце, должны давать следующие
результаты: разница между значениями должна быть не
более 15% для тех результатов, где содержание CD3+
клеток составляет менее 30% от общего числа
Т-лимфоцитов; разница между значениями должна быть
не более 6% для тех результатов, где содержание CD3+
клеток составляет более 30% от общего числа
Т-лимфоцитов.
(5) Стабильность после окрашивания
После окрашивания образцов с использованием
реагентов в течение 24 часов тест повторяли, а разницу
.между результатами двух тестов до и после теста
относительно изменения результатов предыдущего теста:
для тех результатов, где содержание СПЗ+ клеток составляет
менее 30% от общего числа Т-лимфоцитов. значение КВ
должно быть менее 10%: для тех результатов, где содержа}ше
СПЗ+ клеток составляет более 30% от общего числа
Т-лимфоцитов. значение КВ должно быть менее 8%.
23. Дата производства
Смотрите на упаковке или этикетке.
24. Срок годности
18 месяцев с даты производства.
25. Калибровка
Не применимо для данного изделия
26. Информация о стери.зьном состоянии медицинского
изле.1ня
Набор является нестерильным медицинским изделием.
Стерилизация и дезинфекция шмпонентов набора - не
применимо.
27. Литература
[1] Хайдуков, С.В. Проточная цитометрия как современный
метод анализа в биологии и медицине / С.В. Хайдуков. Л.В.
Зурочка//Мед.иммунол. - 2007. - Т. 9. № 4. 5. - С. 373-378
[2] Кудрявцев И.В. Опыт измерения параметров иммунного
статуса с использованием шестицветного
цитофлуориметрического анализа/ И.В. Кудрявцев. А.И.
Субботовская//Мед.иммунол. - 2015. -T I7 №1 - С 19-26.
28. Интерпретация логотипов
ш См. инструкции по использованию
Лот (серия)
Дата изготовления
Оу Ц
i J
Гемиература хранения
Изделие для диагностики in vitro
Использовать до
Производитель
--- стр. 8 ---
Ьиологическая опасность
Беречь от влаги
Материалы животного происхождения
Беречь от солнечных лучей
m l УРИТ Медикал Электроник Ко., Лтд.. КНР / U RIT
Medical Fdectronic Co.. Ltd., P.R. China.
No.D-07 Information Industry District. High-tech Zone.
Guilin, Guangxi 541004, P.R. China (541004, Китайская
Народная Республика, провинция Гуанси, г. Гуилинь, зона
высокотехнологичных разработок, район предприятий
информационной отрасли, № D-07)
Тел: +86(773)2288586
ЕЗеб-сайт; www.urit.com
Эл. почта: service{^/uritest.com
Места производства:
1) No. 4 East Alley. Jiuhua Road. 541001 Guilin, Guangxi.
PEOPLE'S REPUE3L1C OF CH IN A (541001. Китайская
Народная Республика, провинция Гуанси, г. Гуилинь, Ист-Эли
№ 4. Цзиух>а роуд)
2) No.D-07 Information Industry District, High-tech Zone,
Guilin, Guangxi 541004. P.R. CHIN A (541004. Китайская
Народная Республика, провинция Гуанси, г. Гуилинь. зона
высокотехнологичных разработок, район предприятий
информационной отрасли, № D-07)
3) No. D-02 Information Industry District, High-tech Zone,
541004 Guilin. Guangxi, PEOPLE'S REPU BLIC OF CHIN A
(541004. Китайская Народная Республика, провинция Гуанси.
г. Гуилинь. зона высокотехнологичных разработок, район
предприятий информационной отрасли, № D-02)
4) 1F & 2F of Building No. 1. Building No. 2, No. GX-G08.
East Side of Donghuan Road, Qixing District, 541004 Guilin.
Guangxi, PEOPLE'S REPU BLIC OF CH IN A (541004,
Китайская Народная Республика, провинция Гуанси. г.
Гуилинь. район Цисин, Дунхуань Роуд. восточная часть,
GX-G08. 1F и 2F строения 1 и строения 2)
Сведения об уполномоченном
производителя в РФ
представителе
Общество с ограниченной ответственностью «Инвитро
Импорт» (ООО «Инвитро Им(юрт»)
Адрес; 398001. Липецкая область, г. Липецк, ул.
Первомайская, дом 78, помещ. 29
Телефон: +7(961)036-53-00
Адрес электронной почты: invitroimport(^mail.ru
Редакция 03/2025
--- стр. 9 ---
Медицинск я Иммунология d ti'^ n 'n P k l
2007, Т. 9, № 4-5, стр. 373-378 \J U J U p O l
© 2007, СПб РО РЛЛКИ
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
КАК СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД
АНАЛИЗА В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
Хайдуков C.B.S Зурочка А.В.^
' Институт Биоорг иической химии им. к д. М. М. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москв
^ ГОУ В ПО Челябинск я госуд рственн я медицинск я к демия РОСЗДРЛВА, г. Челябинск
Резюме. Проточная цитометрия — это современная технология быстрого измерения характери
стик клеток, их органелл и происходящих в них процессов. Она представляет собой эффективный
подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии и клеточной инженерии. В дан
ной статье отображены основные направления развития проточной цитометрии и применение ее
в медико-биологической практике. Использование современных достижений в области флуоресцент
ных красителей, развитие лазерных и компьютерных технологий, а также эффективное программ
ное обеспечение привели к широкому использованию данной технологии в медицинской практике.
Использование моноклональных антител, конъюгированых с различными флуорохромами, в свою
очередь, привело к развитию многопараметрового анализа и значительно упростило работу специ
алистов в диагностике различных нарушений иммунной системы.
Появление новых направлений в проточной цитометрии, таких как проточная цитоэнзимология, от
крывает широкие перспективы для дальнейшей идентификации поврежденных или измененных кле
ток, и позволяют принимать адекватные решения по лечению выявленных патологических изменений.
Авторы предполагают, что данная статья послужит началом серии публикаций по применению
данной технологии и современных ее приложений в широкой лабораторной практике.
Ключевые слов : проточи я цитометрия, сортировк ,многоп р метровый и лиз, моноююн льные нтител ,
флуорохромы.
Khaidukov S. V., Zurochka А. V.
FLOW CYTOMETRY AS А MODERN ANALYTICAL TOOL IN BIOLOGY AND MEDICINE
Abstract. Flow cytometry is considered as a modern technology for fast measurements of cellular
characteristics, their organelles, and processes occurring within them. It is regarded as an efficient solution
in many important areas of cell biology, immunology and cellular engineering. Present article bears on main
developments in flow cytometry and their applications in medical and biological practice. Usage of modern
achievements in fluorescent dyes, progress in laser and computer technologies, as well as potent software,
resulted in wide application of this technique in medical practice. Accordingly, usage of monoclonal antibodies
conjugated to different fluorochromesm has led to elaboration of multiparametric analysis and did sufficiently
simplify specialized works aimed for diagnostics of various immune disorders. The new directions in flow
cytometry, e.g., flow cytoenzymology, provide wide opportunities for detailed identification of damaged
or altered cells, and taking adequate decisions in treatment of detected pathological changes. The authors
suggest that this article could initiate a series of publications concerning usage of this technology and its modern
applications in broad laboratory practice. (Med. Immunol., 2007, vol. 9, N 4-5, pp 373-378)
Адрес для переписки: Проточная цитометрия как современная тех-
X ыдуков Сергеи В леръевин нология быстрого измерения характеристик кле-
Институт биоорг иической химии ток, направленная в сторону их автоматизации,
им. к д. М.М. Шемякин и Ю.А. Овчинников появилась в результате естественного развития
Российской Ак демии И ук традиционных гистохимических и цитохимиче-
1П997, Россия, Москв ,ул. Миклухо-М кл я, 16/10. ских методов анализа. Созданная для ускорения
Тел.' (495) 336-02-55 +7(985) 103-41-62 анализа в клинической цитологии и цитодиаг-
E-mail: khsv@maiiibch.ru: khsergey54@mail.ru ностике, эта технология постепенно развилась
373
--- стр. 10 ---
Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Медицинск я Иммунология
в эффективный подход к решению многих важ
ных задач биологии клетки, иммунологии, кле
точной инженерии и т.д. [2].
Проточная цитометрия базируется на всем
арсенале современных цитохимических флуорес
центных методов анализа структурных компо
нентов клеток их антигенов и внутриклеточных
процессов. От классической цитохимии проточ
ную цитометрию отличает высокая производи
тельность. Так, исследуются выборки от несколь
ких тысяч до нескольких миллионов клеток, что
гарантирует статистическую достоверность ре
зультатов [8]. В свою очередь, от классической
биохимии и молекулярной биологии современ
ную цитометрию отличает возможность анали
зировать не усредненные молекулярные характе
ристики по всей популяции, а индивидуальные
параметры для каждой из клеток [14].
Можно отметить существование двух направ
лений: проточная цитометрия и проточная цито-
метрия-сортировка. Первое представляет собой
чисто аналитический подход, второе позволяет
отобрать интересующие исследователя субпо
пуляции клеток, основываясь на аналитических
возможностях первого, и в дальнейшем прово
дить работу с отобранными субпопуляциями.
Хотя в последнее время позиции проточных ци
тометров как сортировщиков несколько поколе
бались за счет появления магнитной сепарации
[5], но целый ряд научных исследований невоз
можен без их использования. К. таким исследо
ваниям можно отнести сортировку индивиду
альных хромосом 113|, получение тетраном 116|,
получение трансфицированных клонов супер
продуцентов с GFP 117] и др.
Две существенные особенности проточной
цитометрии делают этот метод особенно ценным
для клинической практики:
- во-первых, этот метод позволяет охарактери
зовать гетерогенные клеточные популяции по фе
нотипу, а при использовании ДНК-цитометрии
[3] - и генотипу входящих в них клеток. Анализы
такого рода служат для выявления отклонений,
происходящих в процессе онкогенеза. Большин
ство современных применений цитометрии связа
но. в первую очередь, с анализами именно такого
рода 111 ;
- во-вторых, это способность обнаружить
и охарактеризовать редкие события, т.е. встречаю
щиеся с частотой 10'^-10'^, что возможно благодаря
его огромной производительности [8, 16]. Так, со
временные цитометры могут регистрировать не
сколько параметров для каждой отдельной клетки
со скоростью до 10 О О О клеток в секунду [15].
Основной принцип проточной цитометрии
очень прост. Через проточную ячейку движется
постоянный ток изотонического раствора под
определенным давлением, который называется
«обжимающим». Внутри проточной ячейки на
ходится зонд, из которого подается образец, со
держащий клетки. Условия подобраны таким
образом, что за счет разницы давления в зонде
и «обжимающей» жидкости происходит гидроди
намическое фокусирование струи в струе, и клет
ки за счет этого выстраиваются друг за другом.
В определенном месте клетки пересекают луч
света, и здесь происходит считывание информа
ции [15].
Какие же параметры клеток можно измерять,
используя проточную цитометрию, и какую ин
формацию несет это исследователю? Во-первых,
это рассеянние света под малыми углами (1-10°).
Этот параметр используется для определения
размеров клеток. Во-вторых, рассеянние света
под углом 90°. Использование этого параметра
позволяет судить о соотношении размеров ядра
и цитоплазмы, а также о неоднородности или
гранулярности цитоплазмы. И наконец, третий
параметр — это измерение интенсивности флу
оресценции изучаемого объекта. Следует от
метить, что именно способность анализировать
интенсивность флуоресценции сделала метод
проточной цитометрии высокоинформативным
и широко применяемым.
Современные цитометры, как правило, обо
рудованы несколькими фотоэлектронными ум
ножителями (ФЭУ), что позволяет одновременно
регистрировать несколько типов флуоресценции.
Кроме этих основных параметров, существует
возможность измерять поляризацию флуорес
ценции и время пролета частицы через зону ана
лиза. Первое позволяет исследователю судить
о степени вязкости мембран клеток, которая ме
няется в зависимости от их функционального со
стояния, а второе — о степени асимметричности
клеток или исследуемых органелл [15].
В связи с возможностями приборов области
применения проточной цитометрии стали весьма
разнообразны. Сначала интенсивно развивались
способы количественного анализа внутрикле
точных компонентов, таких как ДНК и РНК [15].
Работа в данном направлении привела исследо
вателей к разработке различных методик анализа
параметров клеточного цикла. В свою очередь,
это послужило фундаментом для разработки
методик диагностирования делящихся клеток
и клеток с аномальным содержанием ДНК [3].
Для этих целей используют такие флуоресцент
ные красители, как иодид пропидия, Hoechst,
7-амино-актиномицин D (7-AAD) и целый ряд
других [2].
Информация, извлекаемая из сигналов свето
рассеяния и измерения времени пролета клеток
через зону анализа, позволила исследователям
374
--- стр. 11 ---
2007, Т. 9, № 4-5 Цитометрия в биологии и медицине
судить о морфологических характеристиках кле
ток (размере, отношении размеров ядра и цито
плазмы, гранулярности цитоплазмы, степени
асимметрии клеток). В свою очередь, это приве
ло к возможности типировать клетки без приме
нения флуоресцентных красителей, что особен
но ценно при работе с периферической кровью.
Примером может служить одновременное из
мерение рассеяния света клетками под малыми
углами (1-10°) и под углом 90°. Данный подход
позволяет разделить и расположить в виде ги
стограммы лейкоциты периферической крови
на три группы клеток: лимфоциты, моноциты
и гранулоциты [4].
Однако современная диагностика гематоло
гических заболеваний не ограничивается только
клиническим анализом форменных элементов
крови. В дополнении к этому анализу появилась
возможность выявления патологий на клеточном
и мембранном уровне.
Развитие гибридомной технологии привело
к тому, что у исследователей появился в руках
такой инструмент, как моноклональные анти
тела (МА) [11]. МА предоставили возможность
типировать клетки не только благодаря их мор
фологическим различиям, но и за счет набора
поверхностных антигенов и рецепторов, харак
терных для строго определенных клеток и их
функционального состояния. Однако в различ
ных лабораториях мира были получены МА к од
ним и тем же антигенам, и авторы присвоили
им свои собственные названия. Это привело
к тому, что в литературе возникла путаница — ис
следователи говорили об одних и тех же антиге
нах клеточной поверхности, но называли их раз
ными именами. Чтобы избежать этого, в начале
80-х годов было созвано международное рабочее
совещание по антигенам лейкоцитов челове
ка. Было предложено объединить МА в группы
или кластеры исходя из того, какую антигенную
структуру на клеточной поверхности они рас
познают. Таким образом, первоначальный смысл
понятия «кластер дифференцировки» (Cluster
of Differentiation, CD) - это набор МА, которые
распознают одну и ту же структуру на клеточной
поверхности независимо от эпитопной спец
ифичности [11].
Со временем это понятие видоизменилось,
и многие исследователи понимают под CD саму
структуру на клеточной поверхности. Исходя
из изложенного выше, становится понятно, что
для эффективного использования МА должны
быть кластеризованы, т.е. внесены в реестр из
вестных МА и отнесены к определенному кла
стеру дифференцировки. Для этого каждые
МА должны пройти проверку в нескольких не
зависимых лабораториях, где должно быть пока
зано, что они взаимодействуют с определенными
клетками и распознают определенную структуру
на их поверхности. Совещания, посвященные
этим вопросам, проходят с периодичностью в не
сколько лет и на них исследователи вносят на рас
смотрение своих коллег все новые и новые МА.
Некоторые из них распознают уже известные
структуры, но встречаются такие, которые взаи
модействуют с неизвестными ранее. В настоящее
время известно 339 кластеров дифференцировки
клеток человека.
Использование МА революционизировало
подходы к типированию клеток, и в настоящее
время большинство клинических применений
проточной цитометрии выполняется именно с их
помощью. Меченые флуорохромами МА позво
ляют проводить как качественный, так и коли
чественный анализ поверхностных и внутрикле
точных антигенов.
На сегодняшний день ряд фирм предлага
ют широкий спектр МА, позволяющих опре
делять поверхностные антигены или кластеры
дифференцировки лейкоцитов человека. Эти
МА используются для типирования лейкемий
и опухолей, определения аутоиммунных и им-
мунодефицитных заболеваний, исследования
активации Т-, В-клеток, натуральных киллеров
и моноцитов/макрофагов и др. Кроме этого, по
следние достижения в области флуоресцентных
красителей позволяют значительно повысить
информативность получаемых результатов. Так,
использование нескольких МА, меченых различ
ными флуоресцентными красителями, позволя
ет в одном эксперименте получать информацию
сразу о нескольких антигенах на поверхности
клеток и, как следствие этого, дает возможность
исследователю судить о субпопуляционном со
ставе клеток и наличии различных аномалий,
а также об активности клеток внутри одной суб
популяции.
В качестве примера можно привести исполь
зование таких красителей, как флуоресцеин
(FITC), фикоэритрин (РЕ) и так называемый
краситель с переносом энергии (ECD). Первые
два возбуждаются одной и той же линией спек
тра испускаемой аргоновым лазером, т.е. 488 нм,
но испускают свет в различных областях спектра:
первый — 515-525 нм, а второй — 575-585 нм, что
позволяет развести их флуоресценцию по разным
фотоэлектронным умножителям. В третьем слу
чае используется так называемый эффект пере
носа энергии. На МА ковалентно пришивается
сразу два красителя, в данном случае это фикоэ
ритрин и Техасский красный. Фикоэритрин воз
буждается аргоновым лазером и испускает кван
ты света в более высоковолновом диапазоне, это,
в свою очередь, вызывает возбуждение молекулы
375
--- стр. 12 ---
Хайдуков С. В., Зурочка А. В. Медицинская Иммунология
ТАБЛИЦА 1. ФЛУОРОХРОМЫ. НАИБОЛЕЕ ЧАСТО
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПРЯМОЙ КОНЪЮГАЦИИ
С МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ
Флуорохромы
Флуоресцеинизотиоци-
анат(Р1ТС)
Алекса Флуор 488
(Alexa Fluor 488)
Фикоэритрин (РЕ,
R-PE, RD1)
ECD (PE-Texas Red)*
РС5 (PE/CY5)*
PC5.5{PE/CY5.5)*
РЕ Alexa Fluor 700*
PC7 (PE/CY7)
Алофикоцианин (АРС)
Alexa Fluor 647
Alexa Fluor 700
APC Alexa Fluor 700*
APC7 (APC/CY7)*
Длинна волны
возбуждения
(нм)
488
488
488
488
488
488
488
488
633/635
633/635
633/635
633/635
633/635
Эмиссия
(нм)
525
525
575
610
675
700
725
790
680
680
725
725
790
Примечания: CY- цианин;
красители
- тандемные флуоресцентные
Техасского красного, который, в свою очередь,
испускает кванты света в еще более дальней об
ласти спектра (610-635 нм) — именно они и реги
стрируются инструментом. Таким образом, если
мы имеем МА к CD3, CD4 и CD8, меченые этими
флуорохромами, мы можем сразу количественно
охарактеризовать содержание в периферической
крови Т-клеток, Т-хелперов и Т-цитотоксических.
По аналогичному принципу работает и комплекс
фикоэритрина и цианина-5 (CY5) и целый ряд
других тандемных красителей, но испускание
кванта света происходит в еще более дальней
красной области спектра (670 нм и больше), чем
у Техасского красного (табл. 1).
Поскольку современные цитометры, как
правило, оборудованы более чем тремя фото
электронными умножителями (от 3 до 9 ФЭУ),
это позволяет на одном образце периферической
крови проанализировать практически все основ
ные субпопуляции клеток [6, 11].
Наличие на рынке большого выбора МА, ме
ченых различными флуорохромами, дает воз
можность исследователю подобрать такой набор
МА, чтобы на меньшем количестве образцов
получить максимальную информацию. Все это
привело к формированию многопараметрового
анализа в цитометрии |6|.
В проточной цитометрии начало развивать
ся как отдельное направление исследование
ТАБЛИЦА 2. СИНТЕТИЧЕСКИЕ СУБСТРАТЫ ДЛЯ
ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ
ФЕРМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Субстраты Ферментативная
специфичность
A*Aminopeptidase М Aminopeptidase ГИ
AAPL'Elastase Leukocyte & pancriatic
elastases
AAPV- Elastase Leukocyte & pancriatic
elastases
AG'Cathepsin Cathepsin В & С
Bu'Butyryl Esterase a) Butyry! esterase
b) Phospholipase A2
ClAc'CI Acetate Esterase Chloroacetate esterase
D'Aminopeptidase A Aminopeptidase A
DCFH'Peroxidase Process specific
DCFH, PMA'Oxidative
Burst Process specific
E. coli'Phagocytosis Process specific
FDA-Esterase Acetate esterase
FDA, NaF'Esterase Acetate esterase
FR'Kallikerin Kallikerin
G'Aminopeptidase Aminopeptidases
GaPGalactosidase a & p galactosidase
GFGA-Coliagenase Galactosidases
GGL'Subtilisin Subtilisin
GbCathepsin D Cathepsin D
Glu'Glucosidase B-glucosidase
Glucuronide*
Glucuronidase B-glucuronidase
GP-DPP IV Dipeptidyl peptidase IV
GPLGP'Collagenase Collagenases
K'Aminopeptidase В Aminopeptidase В
КАЮРРИ Dipeptidyl peptidase II
L'Aminopeptidase Aminopeptidases
LL'DPPl Dipeptidyl peptidase 1
LY'DPP 1 Dipeptidyl peptidase 1
LY'Calpain Calpain
P»Pro Aminopeptidase Prolyl Aminopeptidase
Palmitate'Alkyl Esterase B1 & B2 Esterase
P04*Acid Phosphatase Acid Phosphatase
QS'Cathepsin Cathepsin D
R'Aminopeptidase В Aminopeptidase В
RGES-Elastase Leukocyte & pancriatic
elastases
TP'Cathepsin Cathepsin С & G
VK'Cathepsin Cathepsin D & В
VS'Cathepsin Cathepsin D & В
376
--- стр. 13 ---
2007, Т. 9, № 4-5 Цитометрия в биологии и медицине
активности внутриклеточных ферментов с по
мощью флуорогенных субстратов. Это направ
ление получило название «проточная цито-
энзимология». Был разработан ряд реагентов,
представляющих собой синтетические субстра
ты, которые могут быть использованы для из
мерения активности внутриклеточных фермен
тов (табл. 2). Они проникают через мембрану
живой клетки и имеют большие преимущества
перед синтезированными прежде субстратами,
включая возросшую разрешающую способ
ность и уменьшение времени анализа. Большое
число новых субстратов позволяет оценивать
активность значительно большего количества
ферментов, чем было возможно. Важность при
менения их заключается в том, что при сравне
нии уровней активности ферментов нормаль
ных клеток с уровнями активности в клетках,
вовлеченных в процесс заболевания, могут быть
обнаружены значительные различия, и это по
зволяет идентифицировать поврежденные или
измененные клетки и исследовать протекаю
щие в них процессы 110].
Целый набор различных флуорохромов сделал
возможным количественное исследование таких
физиологических параметров, как внутрикле
точный pH (флуоресцеин и 7-гидроксикумарин),
концентрация свободных ионов кальция (Fura-2,
Indo-1, Fluo-3), уровень окислительных процес
сов, активация митохондрий, потенциал наруж
ной мембраны клеток, процессы апоптоза, и т.д.
[15].
Все новые и новые достижения в различных
областях молекулярной биологии, биохимии
и медицины позволяют изучать при помощи про
точной цитометрии различные аспекты биологии
клетки, такие как содержание секретируемых ци-
токинов в сыворотке при помощи мультиплекс
ного анализа [14], локализацию антигенспеци-
фических клонов клеток при помощи тетрамеров
119| и многое другое.
Кроме всего этого в настоящее время суще
ствуют .методики, позволяющие при помощи
проточной цитометрии измерять и такой физио
логический параметр, как фагоцитоз, экспрес
сию цитокинов и др. Все это создает предпосылки
для современных исследований всего комплекса
внутриклеточных процессов на уровне отдель
ных клеток.
Таким образом, высокий уровень автомати
зации, простота в эксплуатации и небольшие
размеры современных приборов позволяют рас
сматривать их не только как исследовательские,
но и как клинико-диагностические.
Перечисленные возможности метода проточ
ной цитометрии определяют следующие области
его применения;
• клинические: иммунология, онкология,
онкогематология (включая диагностику, оценку
эффективности лечения, мониторинг пациентов,
входящих в фуппу риска), трансплантология, об
щая гематология, диагностическое типирование
клеток и др.;
• обшебиологические: клеточная кинетика,
клеточная энзимология, изучение механизмов
действия различных иммуномодуляторов и дру
гих биологически активных веществ, клеточная
физиология, генетика и др.
Очень важны.м разделом для биологии и меди
цины при появлении новых методик исследова
ния является формирование нормативных пока
зателей. Не является исключением и проточная
цитометрия. Поэтому в заключение хотелось
бы привести сравнительную таблицу распределе
ния CD маркеров на поверхности клеток перифе
рической крови здоровых доноров, полученных
разными авторами (табл. 3) [7, 12, 20]. Остается
открыты.м вопрос о Российских нормах, связан
ТАБЛИЦА 3. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ОСНОВНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ
КРОВИ ВЗРОСЛЫХ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ ПО ЛИТЕРАТУРНЫМ ДАННЫМ [7,12, 20] И ДАННЫМ АВТОРОВ
(ПРОЦЕНТИЛИ 5%-95%)
Субпопуляции
Zidovec Lepe] S.
etal. (2003)
П = 50
Pope V. et al. (1994)
n = 246
Comans-Bitter W.M.
et al. (1997)
П = 51
Данные авторов
(п = 356)
Т-лимфоциты (CD3*) 73,3 (59,0-88,2) 72,1 (54-85) 72 (55-83) 73 (61-85)
Т-хелперы
{С0Ъ*С04*} 43,8(34,9-64,3) 44,1 (32-58) 44 (28-57) 45 (35-55)
Т-цитотоксические
(CD3XD8*) 23,9 (11,0-37,1) 31,2(19-44) 24 (10-39) 27 (19-35)
Т-активированные
(CD3*HLA-DR0 1,9 (0,5-25,9) Нет данных 5(2-12) 3 (0,5-6)
В-лимфоциты (CD19*) 9,7 (4.4-26,4) 13,3(6-23) 12(6-19) 12(7-17)
NK-клетки
(CD3-CD16^CD56*) 3,9(0,4-19,3) 12,2 (5-23) 13(7-31) 15(12-18)
377
--- стр. 14 ---
Хайдуков С. В., Зурочка А. В. Медицинская Иммунология
ных с региональными особенностями отдельных
областей. Все это требует объединения усилий
различных лабораторных коллективов в проведе
нии исследований в данном направлении.
Авторы предполагают, что данная статья по
служит началом серии публикаций по примене
нию данной технологии и современных ее при
ложений в широкой лабораторной практике.
Список литературы
1. ЛуговскаяС.А,, Почтарь М.Е.,Тупицын Н.Н.
Иммунофенотипирование в диагностике гемобла-
стозов. — М., Тверь: Триада, 2005. — 168 с.
2. Полетаев А. И. Проточная цитометрия и со
ртировка в цитологии, молекулярной биологии,
биотехнологии и медицине / ИНТ серия «Общие
проблемы физико-химической биологии». — М.,
1989.- Т 12.-88 с.
3. Шмаров Д.А., Козинец ГИ. Лабораторно
клиническое значение проточно-цитометричес-
кого анализа крови. — М.: МИА, 2004. — 128 с.
4. Bossuyt X., Marti G.E., Fleisher ТА.
Comparative analysis of whole blood lysis methods
for flow cytometry // Cytometry. - 1997. - Vol. 30. -
P. 124-133.
5. Chou T, Sano М., Ogura М., Marishima Y,
Itagaki H., Takuda Y. Isolation and transplantation
of highly purified autologous peripheral CD34^
progenitor cells; purging efficacy, hematopoietic
reconstitution following high dose chemotherapy
in patients with breast cancer: results of feasibility
study in Japan // Brest Cancer. — 2005. — Vol. 12,
N 3 .-P . 178-188.
6. Claude L., Lobagiu C., Genin C. Enumeration
of peripheral lymphocyte subsets using 6 vs. 4 color
staining: a clinical evaluation of new flowcytometer
// Cytometry, Part B. - 2005. - Vol. 70B. - P. 29-38.
7. Comans-Bitter W.M., de Groot R., van den
Beemd R.. Neijens H.J., Hop W.C., Groeneveld K..,
Hooijkaas H., van Dongen J.J. Immunophenotyping
of blood lymphocytes in childhood. Reference values
for lymphocyte subpopulations//J. Pediatr. — 1997. —
Vol. 130, N 3 .- P 388-393.
8. Di Nicola М., Siena S., Bregni М., Peccatori F.,
Magni М., Ravagnani F, Zorzino L., Bonadonna G.,
Gianni A.M. Quantization of CD34^ peripheral blood
hematopoietic progenitors for autografting in cancer
patients// Int. J. Artif Organs. - 1993. - Suppl. 5. -
P. 80-82.
9. Llorente L., De La Fuente H., Richaud-Patin Y,
A!varado-De La Barrera C., Diaz-Boijon A., Lopez-
Ponce A., Lerman-Garber I., Jakez-Ocampo J.
Innate immune response mechanisms in non-insulin
dependent diabetes mellitus patients assessed by flow
cytoenzymology// Immunol. Lett. - 2000. - Vol. 74,
N 3. - P. 239-244.
10. Leucocyte typing VI / Ed. Kishimoto K. et al. —
Garland Publishing, Inc. N. Y. & L., 1997. — P. 1342.
11. Luider J., Cyfra М., Johnson P., Auer 1. Impact
of the new Beckman Coulter Cytomics FC 500 5-color
flow cytometer on a regional flow cytometry clinical
laboratory servise// Lab. Hematol. - 2004. - Vol. 10. -
P. 102-108.
12.Pope V, Larsen S.A., Rice R.J., Goforth S.N.,
Parham C.E., Fears M.B. Flow cytometric analysis
of peripheral blood lymphocyte immunophenotypes
in persons infected with treponema pallidum // Clin.
Diagn. Lab. Immunol. — 1994. — Vol. 1, N 1. —
P. 121-124.
13.Rack K.A., Harris PC., MacCarthy A.B.,
Boone R-, Raynham H., McKinleyt М., Fitchett М.,
Towe C.M., Rudd P., Armour J.A.L., Lindenbaum
R.H., Buckle VJ. Characterization of three de novo
derivative chromosomes 16 by «reverse chromosome
painting» and molecular analysis // Am. J. Hum.
Genet. - 1993. - Vol. 52. - P 987-997.
14. SackU.,ScheibeR.,\\btzelМ.,HammerschmidtS.,
KuhnH.,EmmrichF.,HoheiselG.,WirtzH.,GessnerC.
Multiplex analysis of cytokines in exhaled breath
condensate // Cytometry. - 2006. - Vol. 69, Iss. 3. -
P. 169-172.
15.Shapiro H.M. Practical flow cytometry, —
WILEY-LISS, Inc., N.Y, Chichester, Brisbane,
Toronto & Singapore, 1995. - P. 542.
Ib.Stratieva-Taneeva PA., KJiaidukov S.V,
Kovalenko V.A., Nazimov l.V, Samochvalova L.V,
Nesmeyanov VA. Bispecific monoclonal antibodies
to human Interleikin 2 and horseredish peroxidase //
Hybridoma. - 1993. - Vol. 12, N 3. - P. 271-284.
17.TeixeiraG., Lenormand B., Jean P., Fardoun D.,
Sumereau-Dassin E., Bastit D.. Tilly H., Piguet H.,
Monconduit М., Vannier J.P Immunological
evaluation of harvested stem cells obtained
by leukapheresis after chemotherapy // Am. J.
Hematol. - 1992. - Vol. 39, N 3. - P. 172-175.
18.Xian H.-Q., McNichols E., St. Clair A.,
Gottlieb D.l. A subset of ES-cell-derived neural cells
marked by gene targeting // Stem Cells. — 2003. —
Vol. 21.-P . 41-49.
19.Xu L., Zha Q., Sun H., Jia Q., Li F, He X.
Preparation and characterization of HLA-A*0201
tetramer loaded with IE-1316-324 antigenic peptide
of human cytomegalovirus // Cell Mol. Immunol. —
2006. - Vol. 3, N 5. - P. 367-371.
20.Zidovec Lepej S., Vince A., RakuSic S., Pakovic
Rode O., Sonicki Z., Jeren T. Center for disease
control (CDC) flow cytometry panel for human
immunodeflciency virus infection allows recognition
of infectious mononucleosis caused by Epstein—Barr
virus or Cytomegalovirus // Croat. Med. J. — 2003. —
Vol. 44. ~ P 702-706.
поступила вред кцию 28.04.2007
принят к пен ти 14.05.2007
378
--- стр. 15 ---
Medical Immunology (Russia)/
Медицинск я иммунология О р 1 1 В 1 1 Н С 1 Л Ъ Н Ы € C ltlC llT lb U Meditsinskayo Immunologiya
2015, T. 17, № I, cmp. 19-26 * 1 • / PP'
© 2015, СП6 PO РЛАКИ ( J r i g i n a l a r t i c l e s © 2015, ЗРЬ RAACI
ОПЫТ ИЗМЕРЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОГО
СТАТУСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШЕСТИЦВЕТНОГО
ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Кудрявцев И.В.^ ^ Субботовская А.И.^
‘ФГБУ«Н учно-исследов тельский институт эксперимент льной медицины» СЗО РАМН,
С нкт-Петербург, Россия
льневосточный федер льный университет, г. Вл дивосток, Россия
^ ФГБУ «Новосибирский н учно-исследов тельский институт п тологии кровообр щения имени к демик
Е.Н. Меш лкин » М3 РФ, г. Новосибирск, Россия
Резюме. В статье рассматриваются вопросы использования 6-цветного анализа для исследова
ния параметров иммунного статуса методом проточной цитометрии. Цельная кровь условно здо
ровых доноров окрашивалась комбинацией моноклональных антител HLA-DR'FITC, CD16’ ^56-PE,
CD4-ECD, CD19-ECD, CD8-PC5.5, CD3-PC7, CD45-APC (Beckman Coulter, США) по безотмывоч-
ной технологии. Для настройки напряжения ФЭУ проточного цитометра использовали пробирки,
окрашенные каждым моноклональным антителом по отдельности, оптимальным считали напря
жение при нахождении негативной популяции по центру первой декады логарифмической шкалы.
Настройка компенсаций осуществлялась в автоматическом режиме программного обеспечения про
точного цитометра Navios (Beckman Coulter, США). Также рассматривается оптимальная «стратегия
гейтирования» для получения искомых популяций Т-клеток (CD3^CD19’), Т-хелперов (CD3'^CD4^),
цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3^CD8^), В-клеток (CD3-CD19^), NK-клеток (CD3“CD56^),
NKT-клеток (СОЗ^СОЗб’ ^), активированных Т-лимфо[ттов (СОЗ^НLA-DR"").
Ключевые слов .проточи я иитометрия, многоцветный н лиз, иммунофенотипиров ние лимфоцитов
APPLICATION OF SIX-COLOR FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS
FOR IMMUNE PROFILE MONITORING
Kudryavtsev I.V.^* ^ Subbotovskaya A.I.*^
“ Research Institute of Experimental Medicine, North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences,
St. Petersburg, Russian Federation
* Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russian Federation
^ E.N.Meshalkin Research Institute of Circulation Pathology, Russian Ministry of Health Core, Novosibirsk, Russian
Federation
Abstract. The article deals with applications ofsix-color flow analysis for studying the immune state parameters
by means of flow cytometry. Whole blood from healthy donors was stained with combination of monoclonal
Адрес для переписки: Address for correspondence:
Кудрявцев Игорь Вл димирович Kudryavtsev Igor V.
ФГБУ «Н учно-исследов тельский институт Research Institute of Experimental Medicine, Russian Academy
эксперимент льной медицины» СЗО РАМИ of Medical Sciences
197376, Россия, С нкт-Петербург, ул. к д. П влов , 12. 197376, Russian Federation, St. Petersburg, 1. Pavlovstr, 12.
Тел.: 8(812) 234-16-69 Phone: 7(812) 234-16-69
Ф Kc: 8(812) 234-94-89 fax: 7(812) 234-94-89
E-mail: igorekl981@yandex.ru E-mail: igorekl98l@yandex.ru
Образец цитирования: For citation:
И.В. Кудрявцев, A.И. Субботовск я, «Опыт измерения I.V. Kudryavtsev, A.I. Subbotovskaya, 'Application
n p метров иммунного cm myc с использов ние.м of six-color flow cytometric analysis for immune profile
шестицветного цитофлуоримерического н лиз » / / monitoring”. Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya
Медицинск я иммунология, 2015. Т. 17, N° 1. С. 19-26. Immunologiya, 2015, Vol. 17, по. 1, pp. 19-26.
doi: 10.15789/1563-0625-2015-1-19-26 dot: 10.15789/1563-0625-2015-1-19-26
©Кудрявцев И. В., и со вт., 2015 DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2015-1-19-26
19
--- стр. 16 ---
Кудрявцев И.В., Субботовская Л.И.
Kudiyavtsev I. V., Subbotovskaya А. I.
Медицинская Иммунология
Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Jmmunologiya
antibodies, i.e., HLA-DR-FITC, CD16^56-PE, CD4-ECD, CD19-ECD. CD8-PC5.5, CD3-PC7,
CD45-APC (Beckman Coulter, USA) using a “no-wash” technology. To adjust the photomultiplier (PMT)
voltage, we used the tubes with each of the tested monoclonal antibodies, PMT voltage was considered
optimal when the negative population was located in the middle of the first decade at the logarithmic scale.
The compensatory adjustment was performed in automatic mode, using Navios software (Beckman Coulter,
USA). We discuss an optimal gating strategy in order to assess the populations of interest; total T cells
(CD3^CD19-), T helper cells (CD3"CD4^, cytotoxic T lymphocytes (CD3XD8^, В cells (CD3-CD19^,
NKcells(CD3-CDl6XD56^,NKTcells(CD3^CD16^CD56^, activatedT lymphocytes (CD3^HLA-DR^.
Keywords: flow cytometry, multicolor analysis, immunophenotyping
Поддержано Министерством образования и науки РФ, проект № 1326.
Введение
В настоящее время метод проточной цито
метрии широко применяется для анализа кле
точного состава периферической крови, Суще
ственными преимуществами данного метода
перед микроскопией является высокая скорость
и точность проводимых исследований, а также
статистическая достоверность получаемых ре
зультатов. Первые исследования, проведенные
на проточных цитофлуориметрах с использо
ванием препаратов моноклональных антител,
датируются началом 70-х годов XX века, когда
появились первые цитофлуориметры, оснащен
ные аргоновыми и криптоновыми лазерами, что
позволило одновременно детектировать краси
тели, содержащие флуоресцеин и родамин [17].
Однако уже в начале 80-х годов с появлением
твердотельных лазеров к спектру применяемых
флуорохромов был добавлен абсолютно новый
класс соединений — фикобилины [18]. К этой
группе соединений относятся фикоэритрин (РЕ)
и аллофикоцианин (АРС). Уже в конце 80-х го
дов на основе РЕ были созданы новые краси
тели, состоящие из двух соединенных вместе
флуоресцентных молекул и получившие наи
менование «тандемных» красителей. К их чис
лу относятся PE-Texas Red, РЕ-Су5, РЕ-Су5.5,
РЕ-Су7 и некоторые другие [9]. Появление этих
красителей позволило на приборах, оснащен
ных только голубым лазером, анализировать
до 5 флуоресцентных параметров одновременно.
В 90-е годы появляются новые тандемные кра
сители для красного лазера, синтезированные
на основе АРС, и первые синтетические краси
тели семейства Alexa Fluor [14]. Благодаря этому
широкому кругу исследователей становится до
ступным многоцветный анализ с использовани
ем антител, конъюгированных с флуорохрома-
ми, для которых применяются лазеры с длинами
волн 407, 488 и 595 нм [13], что позволяет, по
мимо параметров прямого и бокового светорас
сеяния, оценивать уровень связывания восьми
антител в одной пробирке. Дальнейшее развитие
технологий привело к появлению работ, в кото
рых число одновременно оцениваемых параме
тров флуоресценции достигло одиннадцати [7].
Следующим шагом стало изобретение красите
лей на основе флуоресцентных полупроводни
ковых нанокристаллов, или «квантовых точек»
(Qdots или Quantum Dots), а также сравнительно
недавно появившихся на рынке флуорохромов
семейства Brilliant Violet^'^, первые упоминания
о которых влитературе датируются началом 2012
года 116[. Развитие приборной базы и появление
широкого спектра новых синтетических флу
оресцентных красителей привели к тому, что
в научно-исследовательской практике появил
ся 18-ц-ветный анализ, позволяющий не только
детально описать фенотип клеток интереса, но
исследовать их функциональную активность —
например, способность к пролиферации, син
тезу различных цитокинов и экспрессии сра
зу нескольких активационных маркеров [5, 6].
Именно подобного рода исследования в насто
ящее время считаются апогеем развития про
точной цитометрии, так как для дальнейшего
развития необходимы принципиальные измене
ния как в самих проточных цитофлуориметрах
(например, развитие «масс-цитометрии»), так и
в флуорохромах, применяемых для мечения мо
ноклональных антител [4]. Вместе с тем, в нашей
стране самыми распространенными остаются
проточные цитофлуориметры, предназначенные
для определения четырех, пяти или шести флуо
ресцентных красителей одновременно. Именно
поэтому целью данного исследования была разра
ботка стандартных подходов для решения задачи
по оценке иммунного статуса на одном из таких
приборов.
М атериалы и методы
В рамках проведения данного исследования
использовали периферическую кровь условно
здоровых доноров, полученную путем пункции
локтевой вены. 50 мкл цельной ЭДТА-стаби-
20
--- стр. 17 ---
2015, Т. 17, № 1
2015, Vol. 17, No]
Применение шестицветного цитофлуориметрического анализа
Multi-colour fluorimetry for immune profiling
лизированной крови окрашивали следующими
моноклональными антителами (все антитела
производства Beckman Coulter, США) в соответ
ствии с рекомендациями производителя: HLA-
DR-FITC (кат. № IM1638U), CD16-PE (кат.
№ А07766), CD56-PE (кат. № А07788), CD4-ECD
(кат. № 6604727), CD19-ECD (кат. № А07770),
CD8-PC5.5 (кат. № А07758), CD3-PC7 (кат.
№ 737657), CD45-APC (кат. № 1М2473). По
сле внесения антител образцы тщательно пере
мешивали, затем инкубировали при комнатной
температуре 15 минут в защищенно.м от света ме
сте. По завершении инкубации при постоянном
перемешивании добавляли 500 мкл лизирующе-
го раствора VersaLyse Lysing Solution (Beckman
Coulter, США), инкубировали еще 10 минут при
комнатной температуре в защищенном от света
месте. Анализ образцов проводили на проточ
ном цитометре Navios™ (Beckman Coulter, США).
Для каждого из образцов набирали не менее 5000
лимфоцитов.
Для настройки напряжения по каналам флуо
ресценции использовали образцы крови, окра
шенные каждым из антител по отдельности.
Напряжение выставляли таким образом, чтобы
популяции лимфоцитов, не связавшие то или
иное антитело, находились ровно по центру пер
вой декады логарифмической шкалы (рис. 1,
А-Д). Напряжение по АРС — флуорохрому, с ко
торым были конъюгированы антитела против
CD45 — выставляли так, чтобы лимфоциты, об
ладающие самой высокой среди всех лейкоцитов
периферической крови плотность CD45 на своей
поверхности, находились по центру третьей де
кады логарифмической шкалы (рис. 1Е). По за
вершении настройки напряжения на каналах
флуоресценции проводили настройку цветовой
компенсации. Для данной процедуры также ис
пользовали указанные выше образцы перифе
рической крови, окрашенные каждым из анти
тел по отдельности, и частицы Flow Set Pro (кат.
№ А63492, Beckman Coulter, США). Настройку
проводили в автоматическом режиме с исполь
[Ungated] [Ungated] [Ungated]
В
10 ° 10 ' 102 10 °
HLA-DR-FITC
[Ungated]
10 ° 10 ' 102 10 °
С016-Ю056-РЕ
[Ungated]
10 ° 10 ' 102 10 °
CD4+CD19-ECD
[Ungated]
1 0 ° 10' 1 0 2
CD8-PC5.5
1 0' 1 0 2
CD3-PC7
10 ° 10 ' 102 10 °
CD45-APC
Рисунок 1. Настройка напряжения по каналам флуоресценции
Примечание. По оси абсцисс - боковое светорассеяние (SS), по оси ординат - интенсивность флуоресценции антител против
HLA-DR, конъюгированных с ФИТЦ (гистограмма А), против CD16 и CD56, конъюгированных с РЕ (гистограмма Б), против CD4 и CD19,
конъюгированных с ECD (гистограмма В), против CD8, конъюгированных с РС5.5 (гистограмма Г), против CD3, конъюгированных с РС7
(гистограмма Д), и против CD45, конъюгированных с АРС (гистограмма Е). На гистограммах А-Д напряжение выставлено таким образом,
чтобы лимфоциты, не несущие соответствующих антигенов, находились в пределах первой декады логарифмической шкалы;
для CD45-APC напряжение установлено так, чтобы популяция лимфоцитов - клеток, обладающих слабым боковым светорассеянием
и имеющих высокую плотность CD45 - находилась в третьей декаде логарифмической шкалы флуоресценции.
21
--- стр. 18 ---
Кудрявцев И. В., Субботовская Л.И.
Kudfyavtsev I. V., Subbotovskaya A.I.
Медицинская Иммунология
Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiyo
зованием приложения «AutoSetup Application
Definition...» программного обеспечения Navios™
Software vl.2. Проверку корректности настройки
параметров цветовой компенсации осуществля
ли по образцам периферической крови услов
но здоровых доноров и реагентам Imrnuno-Trol
Cells (кат. № 6607077, Beckman Coulter, США),
окрашенными всеми антителами одновременно.
Анализ полученные результатов проводили при
помощи программного обеспечения Navios™
Software vl.2 и Kaluza™ vl.2 (Beckman Coulter,
США).
Р езультаты и обсуж дение
В понятие оценки «иммунного статуса»
или «исследования субпопуляционного соста
ва лимфоцитов периферической крови» [1] при
помощи проточной цитофлуориметрии включе
но определение абсолютного и относительного
количества Т-клеток (CD3^CD19“), Т-хелперов
(CD3"^CD4^), цитотоксических Т-лимфоцитов
(С03^С08Э, В-клеток (CD3-CD19^), NK-клеток
(CD3-CD56^, NKT-клеток (CD3-^CD56^).
Однако, любой протокол измерения в проточ
ной цитометрии начинается с выделения попу
ляции «интереса», в нашем случае ~ это лимфо
циты. Существует несколько способов выделить
популяцию лимфоцитов. Во-первых, при помо
щи параметров светорассеяния. Преимуществом
данного метода является то, чтолюбой проточный
цитометр оснащен детекторами для регистрации
параметров прямого и бокового светорассеива-
ния, и подобного рода выделение лимфоцитов
не требует дополнительных финансовых затрат.
В то же время существует ряд ограничений по ис
пользованию данного метода - при некачествен
ном лизисе эритроцитов существуют сложности
с отделением популяции лимфоцитов от популя
ции дебриса |2|. Во-вторых, это применение ан
тител против молекулы CD45, которая является
«пан-лейкоцитарным» маркером и представлена
на всех лейкоцитах, но с разной интенсивностью
мембранной экспрессии. При использовании
этой стратегии по гистограмме «боковое свето
рассеяние против флуоресценции CD45» лимфо
цитами является популяция клеток, обладающая
самой яркой экспрессией CD45 и наименьшими
параметрами бокового светорассеивания. Ос
новным недостатком этого метода является не
обходимость использования дополнительного
моноклонального антитела, что в целом способ
но увеличить стоимость исследования. Кроме
того, это требует задействовать отдельный флуо
ресцентный канал для измерения интенсивности
флуоресценции CD45, что накладывает опреде
ленные ограничения в случае работы приборов
с малым количеством одновременно анализируе
мых флуоресцентных сигналов. Преимуществом
же является независимость от качества лизиса,
так как практически всегда можно выделить по
пуляцию интереса, что и послужило причиной
внесения данного подхода выделения лимфоци
тов в международные рекомендации по клеточ
ному анализу [12].
Отдельного внимания заслуживает возмож
ность применения антител против CD45 для ис
ключения примеси моноцитов из зоны анализа.
Появление в периферической крови большого
количества «провоспалительных» моноцитов
способно существенно влиять на качество выяв
ления популяции лимфоцитов. Для исключения
моноцитов из популяции лимфоцитов необходи
мо использовать дополнительные моноцитарные
маркеры, такие как CD 14. Для решения этой про
блемы проводилось выделение лимфоцитов в два
этапа. Первым этапом было выделение области
«CD45"^’ ^» на диаграмме «боковое светорассе
яние против флуоресценции CD45» (рис. 2А).
Второй этап заключался в удалении моноци
тов из зоны анализа по двухпараметрической
диаграмме «флуоресценция CD16"CD56 против
флуоресценции CD4^CD19». Данный способ
основан на том, что на поверхности моноцитов,
как «классических», так и «провоспалительных».
представлен CD4, а в случае последних — еще и
CD 16, тогда как среди лимфоцитов не встреча
ются клетки, способные одновременно экспрес
сировать оба этих маркера. В дальнейшем был
сделан «логический» гейт, включающий в себя
клетки, наиболее ярко экспрессирующие CD45
и при этом не экспрессирующие на своей поверх
ности CD4 и CD16 одновременно. В стандартном
программном обеспечении цитометра Navios это
выглядит следующим образом: «LY = CD45"^^
AND Lymphocyte AND (NOT Mono)». В дальней
шем клетки, отвечающие указанным выше ус
ловиям, рассматриваются в качестве популяции
лимфоцитов (рис. 2, А-В).
После того, как популяция клеток интере
са — лимфоцитов — получена, имеет смысл пере
ходить к ее анализу. На качество анализа или чи
стоту выделения популяций лимфоцитов в этом
случае существенное влияние может оказывать
выбор флуорохромов, с которыми конъюгирова
ны антитела. На сайтах производителей антител
и в зарубежной литературе приведены основные
принципы формирования панелей для иссле
дований [10, 11], на основании которых и была
сформирована приводимая в данной статье ком
бинация антител. Во-первых, антитела для «пан-
лекоцитарных» маркеров (CD45) и маркеров,
применяемых для выделения отдельных субпо
пуляций клеток (CD3), были конъюгированы
с флуорохромами (АРС и РС7 соответственно).
22
--- стр. 19 ---
2015, Т. 17, N9 I
2015, Vol. 17, No 1
Применение шестицветного цитофлуориметрического анализа
Multi-colour fluorimetry for immune profiling
которые не обладают какой-либо значимой за
светкой на остальные каналы флуоресценции,
то есть коэффициенты компенсации равны нулю
(рис. 2Г). Во-вторых, пары взаимоисключаю
щих маркеров, ко-экспрессия которых в норме
на клетках не наблюдается или крайне незначи
тельна (например, CD56 и CDI9 или CD4 и CD8),
помещены на соседние каналы с сильной пере
крестной засветкой (РЕ и ECD или ECD и РС5.5
соотвественно). В-третьих, активационный мар
кер с низким и к тому же переменным уровнем
экспрессии, как это характерно для HLA-DR
на Т-клетках, помещен на канал (FL1 для реги
страции флуоресценции ФИТЦ), который не
подвергается неспецифическому влиянию со
стороны флуорохромов с других каналов. Дан
ное обстоятельство позволяет получать наиболее
адекватные данные об уровне экспрессии дан
ного маркера на клетках интереса вне зависимо
сти от настроек цветовой компенсации и уровня
экспрессии антигенов, расположенных на со
седних каналах. Кроме того, для FL1 (антитела
против HLA-DR, конъюгированные с ФИТЦ)
и FL2 (антитела против CD16 и CD56, конъюги
рованные с РЕ) также учитывается принцип вза
имоисключающей экспрессии маркеров, детек
тируемых на соседних каналах флуоресценции.
Соблюдение указанных выше принципов созда
ния комбинаций антител для анализа позволяет
существенно упростить как настройку цветовой
компенсации, так и дальнейший контроль за ста
бильностью данных параметров настройки при
бора при проведении серий исследований.
Для выделения основных популяций лимфо
цитов периферической крови был использован
следующий алгоритм («тактика гейтирования»),
основанный на применении двухпараметриче
ских гистограмм «флуоресценция-против-флу-
1 0 ° 10’
CD45-APC
Ш И ) :
FL1
О 200 400 600 800 1000
SSINT
FL1 1,30 0,00 0,00 0,30 0,00
jFL2 10,00 6,00 1,00 1,80 0,00
|FL3 3,00 40,00 0,00 0,60 0,00
|f L4 0,50 6,00 25,00 0,00 0,00
FL5 0,00 0,00 3,00 24,50
_______ 0,00
FL6 0,00 0,00 0,00 0 ,0 0 Н Я
1 0 ° 10’ 1 0 2 1 0 ^
CD4-K:D19-ECD
Рисунок 2. «Тактика гейтирования» лимфоцитов и пример матрицы цветовой компенсации
Примечание. Гистофамма А; выделение популяции лимфоцитов по параметрам бокового светорассеяния (ось ординат) и уровню
экспрессии CD45 (ось абсцисс), выделенная область «CD45""» содержит лимфоциты. Гистограмма Б; по оси абсцисс - боковое
светорассеяние, по оси ординат - прямое светорассеяние; показаны только клетки из области «CD45*"» гистограммы А; в области
«Lymph» находятся клетки с низкой интенсивностью флуоресценции по FS и SS (при помощи этого региона из зоны анализа
исключаются разрушенные и слипшиеся лимфоциты, а также большинство моноцитов). Гистограмма В: по оси абсцисс - интенсивность
флуоресценции антител против CD4 и CD19, по оси ординат - интенсивность флуоресценции антител против CD16 и CD56;
на гистограммы показаны клетки, находящиеся в областях «С045*^» гистограммы А и области «Lymph» гистограммы Б; область
«Мопо» - «провоспалительные» моноциты с фенотипом CD4‘°"CD16*, которые не удалось исключить из зоны анализа при помощи
последовательного иммунологического гейтирования, показанного на гистограммах А и Б. Г - пример матрицы цветовой компенсации,
полученной при настройке проточного цитофлуориметра: каналы FL1, FL2, FL3, FL4, FL5 и FL6 предназначены для регистрации
флуоресценции антител, конъюгированных с ФИТЦ, РЕ, ECD, РС5.5,, РС7 и АРС соответственно, По горизонтали в процентах показаны
коэффициенты компенсации засветки флуорохромов из вертикальных столбцов в данный канал.
23
--- стр. 20 ---
/
Кудрявцев И. В., Субботовская А.И.
Kudiyavtsev /. V., Subbotovskaya A.I.
Медицинская Иммунология
Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya fmmunologiya
оресценции». В первую очередь была построена
диаграмма, где по оси абсцисс приведена флуо
ресценция антител против CD3, а по оси ор
динат — флуоресценция антител против CD 19
и CD4 (рис. ЗА). Использование данной гисто
граммы позволяет идентифицировать популя
ции В-лимфоцитов как CD3 негативные, но
позитивные по CD4^19 клетки (12,32% от обще
го числа лимфоцитов в приведенном примере
исследования), а также популяцию Т-хелперов
как дважды позитивные клетки (51,94% от об
щего числа лимфоцитов). Использование анти
тел против поверхностных антигенов, харак
терных для разных популяций клеток (никогда
не ко-экспрессирующихся ни в норме, ни при
большинстве патологических состояний — CD4
для Т-хелперов и CD19 для В-лимфоцитов), но
конъюгированных с одним и тем же флуорохро
мом (в нашем случае — ECD, для регистрации ко
торого используется канал FL3), возможно лишь
в том случае, когда для разделения данных по
пуляций клеток применяется как минимум еще
одно антитело (CD3 как маркер для выделения
популяции Т-хелперов). Причем для детектиро
вания последнего используется отдельный канал
флуоресценции (в нашем случае — канал FL5
для регистрации флуоресценции РС7). Примеры
подобного рода исследований встречаются как на
старых «малоцветных» приборах [8], для кото
рых они, собственно, и были разработаны, так и
не потеряли своей актуальности и в настоящее
время при десяти- и более многоцветном анализе
[3J. Хотя в нашей стране такой подход не получил
должного распространения, особенно если при
нять во внимание приборную базу отечественных
лабораторий. Особое внимание следует уделить
тому, что при использовании на одном флуо
ресцентном канале антител против CD4 и CD19
крайне важно провести «логическое» гейтирова-
ние лимфоцитов с исключением примеси попу
ляции моноцитов. Если этого сделано не будет,
то примесь моноцитов, которые слабо позитив
ны по CD4 и не несут CD3, будет ложно отнесена
к В-клеткам, что скажется на качестве получае
мых результатов.
На рисунке 3 также приведены примеры
остальных гистограмм, которые используются
для выделения основных популяций лимфоцитов
периферической крови. На гистограмме Б (флуо
ресценция CD3 против флуоресценции CD8)
выделяются цитотоксические Т-клетки с фено
типом CD3‘ '‘CD8‘ '', содержание которых в дан
ном образце составляет 16,69% от общего числа
лимфоцитов. Далее на гистограмме В выделяют
популяции натуральных киллеров (14,46% от об
щего числа лимфоцитов), негативных по CD3
и позитивных по CD16 и CD56, а также NKT-
клетки, экспрессирующие одновременно CD3
’ CD3-
CD19+:
о 10^12,32%
CD3-K:D4-^: 51,94%
А
[LY]
П С О З + С О б -^ :
16,69%
[LY]
10 ° 10 '
CD3-PC7
[LY]_CD3-PC7
1 0 ° 1 0 ' 1 0 °
CD3-PC7
CD3+
INK-
■ клетки:
Л4,46%
1
NKT-клетки: 0,78%
В
\ тi
‘ - ф
10° 10' 102 10°
CD3-PC7
[ T h ]
Th HLA-DR+: 7,15%
Ж
1 0 '' 1 0 ^
CD3-PC7 CD4+CD19-ECD
1 0 ° 1 0 ’ 1 0 2
....1 о °
HLA-DR-FITC
150
jlOO
>
50
О
[LY]
CD3+HLA-DR+:
2,67%
1 0° 10' iF'"To°
CD3-PC7
[Tcyt]
Tcyt HU\-DR+: 2,22%
3
HLA-DR-FITC
Рисунок 3. гистограммы, необходимые для выделения основных популяций лимфоцитов периферической крови
Примечание. На гистограммах А-Д в про1(ентах приведено содержание основных популяций лимфоцитов периферической крови
от общего числа лимфоцитов, выделенных при помощи последовательного гейтирования, приведенного на рисунке 2 (гистограммы А-В).
Гистограмма Е - распределение Т-лимфоцитов (показаны только СОЗ-позитивные клетки, выделенные на гистограмме Д) по уровню
экспрессии CD4 и CD8, Гистограммы Ж и 3 - экспрессия HLA-DR Т-хелперами (область «ТЬ» гистограммы Е) и цитотоксическими
Т-клетками (область «Tcyt» гистограммы Е) соответственно. Комментарии в тексте.
24
--- стр. 21 ---
t
2015, Т. 17, № 1
2015, Vol. 17, No!
Применение шестицветного цитофлуориметринеского анализа
Multi-colourfJuorimetry for immune profiling
и маркеры, характерные для NK-клеток. Кроме
того, наличие в составе панели антител против
HLA-DR, рассматриваемого в качестве маркера
«поздней активации» Т-лимфоцитов, позволяет
определить процент активированных Т-клеток,
который в данном образце равен 2,67% от обще
го числа лимфоцитов. Для определения общего
числа Т-клеток в проанализированном образце
можно использовать однопараметрическую ги
стограмму (рис. ЗД), где по оси абсцисс — интен
сивность флуоресценции антител против CD3,
а на оси ординат — количество клеток, облада
ющих тем или иным уровнем экспрессии CD3.
Как уже отмечалось выше, при настройке напря
жения негативные клетки помещались в пределы
первой декады логарифмической шкалы, поэтому
особого труда выделить СОЗ-позитивные клетки
не составляет (73,09% от лимфоцитов).
Особое внимание при проведении имму-
нофенотипирования следует уделить подсчету
контрольных сумм, характеризующих качество
и достоверность проведенного исследования.
Пожалуй, главной из них является сумма Т-,
В- и NK-клеток [15], которая должна находить
ся в пределах 100% (100%±5%). В приведенном
на рисунке 3 примере Т-лимфоциты составляют
73,09%, В-лимфоциты — 12,32%, натуральные
киллеры — 14,46%. При помощи нехитрых под
счетов контрольная сумма будет равна 99,87%,
что полностью соответствует нормативным
значениям. Еще одним «внутренним» контро
лем может являться то положение, что сум
ма Т-хелперов, выделенных при помощи CD3
и CD4, и цитотоксических Т-клеток с феноти
пом CD3"CD8^ должна равняться общему чис
лу СОЗ-позитивных клеток ±5% [12]. Хотя даже
в рамках приведенных выше рекомендаций до
пускается расхождение не более 10% из-за при
сутствия в образце у5Т-клеток (увеличение числа
дважды-негативных клеток в образце, что сопро
вождается уменьшением суммарного показате
ля Т-лимфоцитов) или наличия большого числа
клеток, одновременно экспрессирующих CD4
и CD8. В последнем случае сумма CD3^CD4^
и CD3^CD8^ может существенно превосходить
общее число CD3^ клеток и выходить за пропи
санные в рекомендациях нормативы. Поэтому
при помощи дополнительной гистограммы рас
пределения Т-клеток по уровню экспрессии CD4
и CD8 можно более точно выделить не только
Т-хелперы (рис. ЗЕ, область «ТЕ») и цитоток-
сические Т-клетки (рис. ЗЕ, область «Tcyt»), но
и популяции Т-лимфоцитов, несущие как оба
антигена одновременно (область «CD4^CD8^»),
так и лишенные их обоих (область «DN»). Клини
ческая значимость этих параметров в настоящее
время обсуждается при широком круге патоло
гических состояний [2]. Кроме того, с исполь
зованием гистограмм распределения Т-хелперов
и цитотоксических Т-клеток по уровню экспрес
сии HLA-DR (рис. ЗЖ и 3 соответственно) мож
но оценить процент активированных клеток сре
ди данных популяций Т-лимфоцитов.
Таким образом, применение шестицветно
го цитофлуориметрического анализа не только
способно сократить время и себестоимость по
становки реакции, увеличить пропускную спо
собность прибора, но и существенно расширить
спектр результатов, получаемых при анали
зе одного образца. При этом в данной работе
не рассматриваются такие показатели, как экс
прессия CD56 на Т-хелперах и цитотоксических
Т-клетках, равно как и экспрессия CD8 нату
ральными киллерами, имеюшще в настоящее
время больше научное, чем клинико-диагности
ческое значение.
Спи сок литературы / References
1. Байдун Л .А., Зурочка А.В., Тотолян Арег А., Хайдуков С.В. Стандартизованная технология «исследо
вание субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитоф-
люориметров-анализаторов» (проект) // Медицинская иммунология, 2012. Т. 14, № 3. С.255-268.[Ba’ dun L.A.,
Zurochka A.V., Totolian Areg A., Khaidukov S.V. Stadartizovannaya tekhiiologiya "issledovanie subpopuliasionnogo
soslava limphocytov pirifericheskoy krovi s primenemiem protochnih cytophluorimetrov-analizatorov" (proekt).
Meditsinskaya immunologia = Medical Immunology (Russia), 2012, Vol. 14, no.3. pp. 255-268. (In Russ.)]
2. Зурочка A.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А.. Проточная цитометрия в медици
не и биологии. Екатеринбург: РИО УрОРАН, 2013. 552 с. [Zurochka A.V.. Khaidukov S.V., Kudryavtsev I.V.,
Chereshnev V.A. Flow cytometry in medicine and biology]. Ekaterinburg: RIO UrORAN, 2013. 552 p.
3. Autissier P.. Soulas C., Burdo Т.Н., Williams K.C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study
lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry A, 2010, Vol. 77. pp. 410-419.
4. Bendall S.C., Nolan G.P., Roederer М., Chattopadhyay P.K. A deep profiler’ s guide to cytometry. Trends
Im m unol, 2012, Vol 33, pp. 323-332.
5. Chattopadhyay P.K., Price D.A., Harper T.F., Betts M.R., Yu J., GostickE., Perfetto S.P., Goepfert P., Koup R.A.,
De Rosa S.C., Bruchez M.P, Roederer M. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by
polychromatic flow cytometry. Nat. Med., 2006, Vol. 12, pp. 972-977.
25
--- стр. 22 ---
Кудрявцев И. В., Субботовская А.И.
Kudiyavtsev I. V., Subbotovskaya А. I.
Медицинская Иммунология
Medical Immunology (Russia)/Meditsinskayo Immunologiya
6. Chattopadhyay P.K., Roederer M. Cytometry; today’ s technology and tomorrows horizons. Methods, 2012,
Vol. 57, pp. 251-258.
7. De Rosa S.C., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A., Roederer M. 11-color, 13-parameter flow cytometry:
identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat. Med., 2001, Vol. 7,
pp. 245-248.
8. Horvatinovich J.M., Sparks S.D., Mann K.R Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow
cytometry Cytometry, 1996, Vol. 26, pp. 172-177.
9. Lansdorp RM., Smith C., Safford М., Terstappen L.W., Thomas ТЕ. Single laser three color
immunofluorescence staining procedures based on energy transfer between phycoerythrin and cyanine 5.
Cytometry, 1991, Vol. 12, pp. 723-730.
10. Maecker H.T., Frey T, Nomura L.E., Trotter J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.
Cytometry A, 2004, Vol. 62, pp. 169-173.
11. Mahnke Y.D., Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin. Lab. Med., 2007,
Vol. 27, pp. 469-485.
12. Mandy RR, Nicholson J.K., McDougal J.S.; CDC. Guidelines for performing single-platform absolute CD4"
T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. Centers for
Disease Control and Prevention. M M W R Recomm. Rep., 2003, Vol. 52, RR-2, pp. 1-13.
13. Roederer М., De Rosa S., Gerstein R., Anderson М., Bigos М., Stovel R., Nozaki T, Parks D., Herzenberg L.,
Herzenberg L. 8 color, 10-parameter flow cytometry to elucidate complex leukocyte heterogeneity. Cytometry, 1997,
Vol. 29, pp. 328-339.
14. Roederer М., Kantor A.B., Parks D.R., Herzenberg L.A. Cy7PE and Cy7APC: bright new probes for
immunofluorescence. Cytometry, 1996, Vol. 24, pp. 191-197.
15. Schenker E.L., Hultin I.E., Bauer K.D., Ferbas J., Margolick J.B., Giorgi J.V. Evaluation of a dual-color
flow cytometry immunophenotyping panel in a multicenter quality assurance program. Cytometry, 1993, Vol. 14,
pp. 307-317.
16. Soghoian D.Z., Jessen H., Flanders М., Sierra-Davidson K„ Cutler S., Pertel T, Ranasinghe S., Lindqvist М.,
Davis I., Lane K., Rychert J., Rosenberg E.S., Piechocka-Trocha A., Brass A.L., Brenchley J.M., Walker B.D., Streeck
H. HIV-specific cytolytic CD4 T cell responses during acute HIV infection predict disease outcome. Sci. Transl.
Med., 2012, Vol. 4, pp. 123-125.
17. Steinkamp J.A., Orlicky D.A., Crissman H.A. Dual-laser flow cytometry of single mammalian cells.
/. Histochem. Cytochem., 1979, Vol. 27, pp. 273-276.
18. Telford W.G. Lasers in flow cytometry. Methods Cell. Biol.,.2011, Vol. 102, pp. 375-409.
Авторы:
Кудрявцев И.В. — К.6.Н., cm ршии н учный сотрудник,
отдел иммунологии, ФГБУ«Н учно-исследов твльский
институт эксперимент льнои медицины» СЗО РАМН,
С нкт-Петербург; доцент школы биомедицины,
Д льневосточный федер льный университет,
г. Вл дивосток, Россия
Субботовская А.И. — к.м.н., мл дший н учный сотрудник,
ФГБУ «Новосибирский н учно-исследов тельский
институт п тологии кровообр щения имени к демик
Е.П. Меш лкин » Министерств здр воохр нения IN>,
г. Новосибирск, Россия
Authors:
Kudryavtsev I. К, PhD (Biology), Senior Research Associate,
Department of Immunology, Institute of Experimental
Medicine, North-West Branch of the Russian Academy
of Medical Sciences, St. Petersburg; Associate Professor,
School of Biomedicine, Far Eastern Federal University,
Vladivostok, Russian Federation
Subbotovskaya A.I., PhD (Medicine), Junior Research
Associate, E.N. Meshalkin Research Institute of Circulation
Pathology, Russian Ministry of Health Care, Novosibirsk,
Russian Federation
Поступил 29.04.2014
Принят кпеч mu 10.06.2014
Received 29.04.2014
Accepted 10.06.2014
26