Наборы диагностические CINtec для качественного определения антигенов p16INK4a и Ki-67 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- C IN tec H I S T O L O G Y Инструкция no применению Набор реагентов CINtec Histology Набор реагентов CINtec H istology предназначен для качественного определения антигена1 ✓'1 Ы 1 С 4 ар1о иммуногистохимическим методом на гистологических срезах, приготовленных из фиксированных в формалине и залитых в парафин биоптатов шейки матки. Анализ срезов, окрашенных с использованием этого набора реагентов, должен осуществляться одновременно с анализом срезов, приготовленных из того же образца тканей шейки матки и окрашенных гематоксилином и эозином, что позволит унифицировать интерпретацию результатов исследования и увеличить точность диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени и рака шейки матки. АО «МТМ Лабораториз» Им Неуенхеймер Фелд 583 D-69120 Гейдельберг Германия Тел.: 00800 168 652 27 Факс: +49 (0) 6221/64966-10 e-mail: info@mtmlabs.com www.mtmlabs.com REF V i 9511 50 2 - 8 ” С С€ 1 V D --- стр. 3 --- I. Название продукта.......................................................................................................................... 4 II. Сфера применения.........................................................................................................................4 III. Описание....................................................................................................................................... 4 Краткая характеристика................................................................................................................ 4 Клиническая значим ость...............................................................................................................5 Принцип процедуры.......................................................................................................................6 IV . Реагенты........................................................................................................................................ 6 Реагенты, входящие в набор......................................................................................................... 6 Условия хранения........................................................................................................................... 8 Материалы и реагенты, необходимые для исследования, но не входящие в набор ............8 Необходимое оборудование......................................................................................................... 9 V. Особые указания и меры предосторожности ........................................................................... 9 Меры предосторожности.............................................................................................................. 9 Особые указания......................................................................................................................... 10 V I. Процедура................................................................................................................................. 11 Подготовка образцов..................................................................................................................11 Залитые в парафин образцы тканей.........................................................................................11 Демаскировка антигена путем нагревания............................................................................ 11 Процедура окрашивания..............................................................................................................12 1. Подготовка реагентов...........................................................................................................12 1.1 Раствор для демаскировки антигена................................................................................12 1.2 Промывочный буфер..........................................................................................................12 1.3 Раствор субстрата-хромогена (Д А Б)................................................................................12 1.4 Реагент для дополнительного окрашивания.................................................................. 13 1.5 Среда для заключения........................................................................................................13 2. Процедура окрашивания на автоматических иммуногистостейнерах......................... 13 Содержание Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 2 --- стр. 4 --- ф 2.1 Депарафинизация и регидратация....................................................................................13 2.2 Протокол окрашивания на автоматических иммуногистостейнерах ........................14 3. Процедура окрашивания, выполняемая вручную .......................................................... 17 3.1 Депарафинизация и регидратация ................................................................................... 17 3.2 Протокол окрашивания для процедуры, выполняемой в р уч н ую ..............................18 V II. Контроль качества................................................................................................................... 20 V III. Интерпретация результатов................................................................................................... 21 IX . О граничения............................................................................................................................. 22 X. Рабочие характеристики............................................................................................................ 23 X I. Устранение недостатков...........................................................................................................28 X II. Обозначения..............................................................................................................................30 X III. Производитель........................................................................................................................ 30 X IV . Информация о внесенных изменениях...............................................................................30 X V . Информация о правообладателях......................................................................................... 30 Приложение 1. Список литературы...............................................................................................31 Приложение 2 ................................................................................................................................... 33 Каталожный номер; 951 1 2007-9511 -001EU, версия 2.3 --- стр. 5 --- I. Название продукта Набор реагентов CINtec® H istology II. Сфера применения Для in v i t r o диагностики. Набор реагентов CINtec® H istology предназначен для качественного определения антигена1 /rIN l4.4aр1о иммуногистохимическим методом на гистологических срезах, приготовленных из фиксированных в формалине и залитых в парафин биоптатов шейки матки. Анализ срезов, окрашенных с использованием этого набора реагентов, должен осуществляться одновременно с анализом срезов, приготовленных из того же образца тканей шейки матки и окрашенных гематоксилином и эозином, что позволит унифицировать интерпретацию результатов исследования и увеличить точность диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени и рака шейки матки. К4а III. Описание Краткая характеристика Основным компонентом набора реагентов CINtec® H istology являются мышиные моноклональные антитела (клон Е6Н4®) к человеческому белку р1б'^*^‘’® . Белок представляет собой ингибитор циклин-зависимых киназ, который играет важную роль в регуляции клеточного цикла эукариот. Этот белок участвует в опосредованном белком ретинобластомы (pRB) контроле перехода клетки из фазыО! в фазу S и запускает остановку клеточного цикла в процессе дифференцировки клеток. В окончательно дифференцированных эпителиальных клетках р1б'^ экспрессируется в количестве, которое обычно не позволяет выявить этот белок иммуногистохимическим методом. В опухолях различных типов ген р1б"^'^'’® функционально инактивирован в результате генной мутации или гиперметилирования промотера. Показано, что инактивация гена pj^iNK4a^ подавляюшего опухолевый рост, приводит к нарушению регуляции клеточного цикла и бесконтрольной пролиферации клеток. В то же время в клетках эпителия шейки матки, в которых в результате репликации вирусов папилломы человека (В Н Ч ) высокого онкогенного риска образуются онкобелки, запускающие гшоцесс трансформации клеток, обнаружено значительное усиление экспрессии р1б' [1; 2]. Усиленная экспрессия на молекулярном уровне тесно связана с активностью онкобелка Е7 ВПЧ высокого онкогенного риска. Показано, что усиленная экспрессия р1б'^'^'*® обусловлена опосредованной онкобелком Е7 инактивацией функционального комплекса, образованного pRB и транскрипционным фактором E2F, которая является одним из ключевых механизмов трансформации клеток, индуцированной ВПЧ высокого онкогенного риска [3]. Каталожный номер: 9511 2007-9511 -001EU, версия 2.3 --- стр. 6 --- ф в научной литературе опубликованы результаты многочисленных исследований, в ходе которых усиленная экспрессия белка р1б"^’^'’® была обнаружена с использованием иммуногистохимического метода в очень большом количестве случаев предраковой дисплазии высокой степени (в 80-100% случаев ЦИН2 и практически во всех случаях ЦИНЗ) и инвазивного рака шейки матки. Частота обнаружения усиленной экспрессии1 /'IN 1 C 4 3р16 при цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени (ЦИН1) варьируется и обычно составляет от 30 до 60% [1; 2; 4 -1 6]. При интерпретации результатов необходимо учитывать, что р1б'^'^‘* ® представляет собой клеточный белок, который может экспрессироваться в определяемом количестве при дисплазии высокой степени и раке шейки матки, а также при некоторых состояниях, не связанных с дисплазией шейки матки, хотя характер экспрессии и экспрессируемое количество могут варьироваться. Гистологические препараты тканей с нормальной морфологической структурой помогают интерпретировать положительные результаты окрашивания на р1б' срезов, приготовленных из биоптатов шейки матки. Диффузное окрашивание, т.е. непрерывное окрашивание клеток базального и парабазального слоев, которое может сопровождаться или не сопровождаться окрашиванием клеток поверхностного слоя, расценивается как положительный результат теста на усиленную экспрессию р1б’’^’^'^‘*. Показано, что такой характер окрашивания обеспечивает максимальный уровень чувствительности и специфичности диагностики ЦИН высокой степени [1; 4; 5]. В то же время очаговое окрашивание (окрашивание отдельных клеток или небольших групп клеток, т.е. прерывистое окрашивание, особенно клеток, расположенных за пределами базального и парабазального слоев), а также отсутствие признаков иммуногистохимической реакции расцениваются как отрицательный результат теста на усиленную экспрессию р1б'^'^‘’® [1; 4; 5]. Анализ срезов, окрашенных на р1б"^'^'*® с использованием набора реагентов CINtec® Histology, должен осуществляться одновременно с анализом срезов, приготовленных из того же образца тканей шейки матки и окрашенных гематоксилином и эозином. Дополнительная информация, полученная при анализе окрашенных CINtec® срезов, в сочетании с предварительным морфологическим диагнозом, установленным при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, позволит установить окончательный диагноз. К линическая значим ость Показано, что анализ серийных срезов, приготовленных из одного биоптата шейки матки и окрашенных гематоксилином и эозином и реагентами для иммуногистохимического выявления р1б'’^'^''®, позволяет унифицировать интерпретацию результатов исследования и увеличить точность диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени (Ц ИН2+). Патоморфологический диагноз, установленный при анализе срезов, приготовленных из биоптатов шейки матки и окрашенных гематоксилином и эозином, служит основанием для принятия решения относительно тактики ведения пациентки. Поэтому ошибочный диагноз может привести к принятию неправильного решения, т.е. к интенсивной терапии у практически здоровых женщин или к недостаточной терапии у женщин с дисплазией высокой степени, что может негативно сказаться на здоровье пациенток. Для интерпретации результатов анализа гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, характерна высокая частота расхождений диагнозов, установленных патоморфологами. Результаты многочисленных исследований Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 --- стр. 15 --- • повторите этот этап еще раз в кювете со свежим этанолом; • удалите избыток жидкости; • 3 (±1) минуты в кювете с 70% этанолом; • повторите этот этап еще раз в кювете со свежим этанолом; • удалите избыток жидкости; • минимум 30 секунд в кювете с дистиллированной или деионизированной водой. Приступайте к процедуре окрашивания, как описано в разделе 2.2, Этап 1: Демаскировка антигена. Ксилол и растворы этанола следует использовать не более чем для 40 стекол. ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны помнить о том, что отклонения от рекомендованной температуры и продолжительности воздействия во время преаналитической подготовки образцов с использованием соответствующего оборудования могут привести к неполному удалению парафина из срезов. Оставшийся парафин может стать причиной неполного окрашивания при использовании любого гистологического красителя, включая реагенты из набора CINtec® Histology. В гистопатологических лабораториях необходимо регулярно контролировать состояние оборудования, чтобы уменьшить вероятность отклонений при подготовке образцов перед окрашиванием. Наличие резко очерченных границ в пределах окрашенных участков среза или противоречивые результаты окрашивания в пределах среза могут свидетельствовать о неадекватной или неполной преаналитической подготовке образца при использовании любого протокола иммуногистохимической реакции. При выявлении противоречивых результатов окрашивания необходимо проверить состояние оборудования и методы, используемые для преаналитической подготовки образцов. 2.2 Протокол окрашивания на автоматических иммуногистостейнерах Этап 1: Демаскировка антигена • Наполните лабораторные стаканчики, например, пластиковые стаканчики СорИп, разведенным раствором для демаскировки антигена (см. «Процедура окрашивания», раздел 1.1). • Поместите стаканчики с раствором для демаскировки антигена в водяную баню и нагрейте водяную баню и раствор для демаскировки антигена до температуры 95- 99°С. Обратите внимание на то, что уровень воды в водяной бане необходимо отрегулировать таким образом, чтобы стаканчики были погружены в воду на 80% (по высоте). Чтобы стабилизировать температуру и избежать испарения раствора, закройте стаканчики крышками. • Поместите стекла с депарафинизированными срезами в стаканчики с предварительно нагретым раствором для демаскировки антигена; при этом температура раствора в стаканчиках обычно понижается до менее чем 90°С. Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 14 --- стр. 16 --- с » • Доведите температуру воды в водяной бане и раствора для демаскировки антигена в стаканчиках до 95-99°С; проверьте температуру раствора для демаскировки антигена в стаканчиках. • Инкубируйте срезы в растворе для демаскировки антигена в течение 10 (±1) минут при температуре 95-99°С; отсчет времени начинайте только после того, как температура раствора для демаскировки антигена в стаканчиках достигнет 95- 99°С. • Извлеките стаканчики со стеклами из водяной бани. • Оставьте стаканчики с раствором для демаскировки антигена и погруженными в него стеклами на 20 (±1) минут, чтобы они могли охладиться до комнатной температуры. • Слейте раствор для демаскировки антигена и промойте стекла в промывочном буфере (см. «Процедура окрашивания», раздел 1.2). • Для получения оптимальных результатов после демаскировки антигена погрузите стекла в промывочный буфер на 5 минут перед окрашиванием. ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для демаскировки антигена предназначен для однократного использования, не используйте его повторно. Этап 2: Программирование прибора Перед первым применением набора реагентов CINtec® Histology для окрашивания на автоматическом иммуногистостейнере необходимо соответствующим образом перепрограммировать прибор. Следуйте инструкциям по применению используемого автоматического иммуногистостейнера. Этап 3: Процедура окрашивания на автоматическом иммуногистостейнере • Перенесите реагенты из флаконов в градуированные контейнеры для реагентов автоматического иммуногистостейнера. Используйте предложенную прибором форму, чтобы запрограммировать объемы реагентов и продолжительность инкубации (см. пункт 4, в котором указаны соответствующие значения). • Поместите контейнеры с реагентами в держатель для реагентов автоматического иммуногистостейнера в соответствии с предложенной компьютером схемой расположения реагентов. • Загрузите стекла в автоматический иммуногистостейнер в соответствии с предложенной компьютером схемой расположения стекол. • Чтобы предотвратить высыхание срезов, покройте их промывочным буфером после загрузки стекол в автоматический иммуногистостейнер. Запрограммируйте следующие параметры процедуры окрашивания: о промывание* о 200 мкл реагента, блокирующего пероксидазу - 5 минут Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 15 --- стр. 17 --- о п р о м ы в а н и е * о 200 мкл первичных антител к или реагента для негативного контроля - 30 минут о промывание* о 200 мкл реагента для визуализации - 30 минут о промывание* о промывание* о промывание* о переключение о 200 мкл раствора субстрата-хромогена (ДАБ) - 10 минут о промывание* о промывание деионизированной водой после этапа инкубации с раствором субстрата-хромогена *Для соответствующих этапов промывания используйте промывочный буфер. ПРИМЕЧАНИЕ: Если в автоматическом иммуногистостейнере для промывания стекол используется только промывочный буфер, после извлечения стекол из иммуногистостейнера их необходимо промыть в деионизированной воде. Этап 4, Дополнительное окрашивание (инструкции для гематоксилина) • Погрузите стекла в кювету с гематоксилином. Инкубируйте в течение 2-5 минут в зависимости от концентрации используемого раствора гематоксилина. • Поместите стекла в кювету с водопроводной водой и аккуратно промойте под струей водопроводной воды. Убедитесь в полном вымывании гематоксилина. • Быстро промойте стекла в кювете с дистиллированной или деионизированной водой. • Дополнительное окрашивание может осуществляться непосредственно на автоматическом иммуногистостейнере. ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от продолжительности инкубации и концентрации используемого раствора гематоксилина в результате дополнительного окрашивания ядра клеток приобретают синий цвет, от бледно-голубого до темно-синего. Чрезмерное или неполное дополнительное окрашивание может помешать правильной интерпретации результатов теста. Этап 5. Заключение срезов Для заключения срезов после окрашивания рекомендуется использовать безводную среду для заключения, позволяющую хранить окрашенные препараты в течение длительного времени. Также допускается использование водной среды для заключения препаратов. Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 16 --- стр. 24 --- могут привести к тому, что полученные результаты будут отличаться от ожидаемых или окажутся ошибочными, поэтому необходимо дополнить тест соответствующими контрольными реакциями, которые должны быть отражены в протоколе исследования. Пользователи, допускающие отклонения от рекомендуемых процедур, должны взять на себя ответственность за интерпретацию результатов теста в таких обстоятельствах. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены неспецифическим связыванием белков или продуктов реакции с субстратом, а также псевдопероксидазной активностью (эритроциты) и активностью эндогенной пероксидазы (цитохром С). • При применении реагентов для исследования ранее не изученных тканей могут быть получены непредвиденные результаты. Вероятность получения непредвиденных результатов даже при исследовании изученных тканей полностью исключить нельзя в связи с биологической вариабельностью экспрессии антигена в новообразованиях или других тканях с измененной структурой. При получении непредвиденных результатов необходимо связаться с АО «МТМ Лабораториз» по телефону 00800 168 652 27. Не рекомендуется заменять реагенты, входящие в состав данного набора, на реагенты с другими номерами серий. X . Р а б о ч и е х а р а к т е р и с т и к и Клиническое применение Клиническое применение набора реагентов CINtec® Histology было изучено в ходе контролируемого клинического исследования, проведенного с использованием фиксированных в формалине и залитых в парафин образцов тканей шейки матки [21]. Исследование было направлено на подтверждение того, что применение набора реагентов CINtec® Histology позволяет унифицировать интерпретацию результатов исследования и увеличить точность диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени (ЦИН2+). В ходе этого клинического исследования использовались отобранные ретроспективно образцы тканей, которые были получены при пункционной биопсии или конизации шейки матки. Из 500 образцов тканей шейки матки, отобранных в двух независимых европейских патоморфологических лабораториях, при первоначальном исследовании которых была выявлена дисплазия высокой степени, были приготовлены серийные срезы, которые были окрашены гематоксилином и эозином и реагентами из набора CINtec® Histology в соответствии с инструкциями производителя. Каждый препарат, окрашенный гематоксилином и эозином, анализировали три европейских эксперта-патоморфолога, специализирующихся в онкогинекологии, которые давали независимое заключение по препарату. При расхождении диагнозов препараты анализировались повторно одновременно тремя экспертами, и заключение, сделанное большинством экспертов (согласованный диагноз, установленный двумя из трех экспертов), использовали в ходе исследования в качестве золотого стандарта (диагноз сравнения). Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 23 --- стр. 25 --- ф в группу участвовавших в исследовании патоморфологов были включены 12 исследователей (сертифицированные патоморфологи, регулярно анализирующие гистологические препараты, приготовленные из биоптатов шейки матки) из 4 европейских стран (Франции, Италии, Испании и Германии). На первом этапе анализа препаратов все патоморфологи давали независимое заключение по каждому случаю на основании анализа препаратов, окрашенных только гематоксилином и эозином. На протяжении всего исследования патоморфологи не знали о первоначальном диагнозе и диагнозе, который был установлен экспертами и использовался в качестве золотого стандарта. После перерыва продолжительностью более 4 недель, тот же комплект окрашенных гематоксилином и эозином препаратов (с измененной маркировкой) анализировался повторно всеми двенадцатью патоморфологами одновременно с серийными срезами, приготовленными из тех же самых образцов и окрашенными реагентами из набора CINtec® Histology. Для оценки увеличения точности диагностики при одновременном анализе серийных срезов, окрашенных CINtec® и гематоксилином и эозином, по сравнению с анализом срезов, окрашенных только гематоксилином и эозином, заключения, данные каждым из патоморфологов в том и другом случае, сопоставляли с согласованным диагнозом, установленным тремя экспертами. Результаты В выборку для анализа данных было включено 482 образца, для которых были получены парные заключения у всех патоморфологов, участвовавших в исследовании, в том числе 194 образца с отсутствием признаков дисплазии, 96 образцов с ЦИН1, 69 образцов с ЦИН2 и 123 образца с ЦИНЗ, исходя из согласованных диагнозов, установленных тремя экспертами. Точность диагностики ЦИН2+ Общая чувствительность метода диагностики ЦИН2+ увеличилась с 1787 (гематоксилин и эозин) до 2018 (гематоксилин и эозин в сочетании с CINtec®) заключений с истинно положительными результатами (ЦИН2+), при этом общая специфичность метода слегка уменьшилась с 3088 (гематоксилин и эозин) до 3051 (гематоксилин и эозин в сочетании с CINtec®) заключений с истинно отрицательными результатами (<ЦИН1). Т а б л и ц а I . Увеличение точности диагностики ЦИН высокой степени при одновременном анализе серийных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и CINtec , по сравнению с анализом срезов, окрашенных только гематоксилином и эозином; количество заключений с истинно положительными, истинно отрицательными, ложноотрицательными и ложноположительными результатами по сравнению с согласованными диагнозами, установленными экспертами (примечание: общее количество заключений патоморфологов, совпавших с согласованными диагнозами экспертов, составило 2304 заключения (192 образца с ЦИН2+ х 12 патоморфологов) с истинно положительными результатами) Истинно положительные результаты Ложно отрицательные результаты Ложно положительные результаты Истинно отрицательные результаты Гематоксилин и эозин, общее количество заключений 1787 517 392 3088 Гематоксилин и эозин + CINtec®, общее количество заключений 2018 286 429 3051 Каталожный номер: 9511 2 4 2007-9511-001EU, версия 2.3 --- стр. 26 --- Для оценки влияния теста CINtec Histology на точность диагностики использовали модель смешанных эффектов ANOVA для анализа псевдозначений методом «складного ножа», известного как метод Dorfman-Berbaum-Metz (DBM). Нулевая гипотеза о том, что точность диагностики ЦИН2+ при анализе срезов, окрашенных только гематоксилином и эозином, сопоставима с точностью диагностики ЦИН2+ при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и CINtec®, была отвергнута при р = 0,0004 (AUC для гематоксилина и эозина = 0,877; AUC для гематоксилина и эозина в сочетании с CINtec® = 0,925). Т а б л и ц а ! . Увеличение чувствительности метода диагностики ЦИН высокой степени при одновременном анализе серийных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и CINtec®, по сравнению с анализом срезов, окрашенных только гематоксилином и эозином; согласованные диагнозы, установленные тремя экспертами при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, использовались в качестве золотого стандарта • Диагноз Чувствительность метода диагностики при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином Чувствительность метода диагностики при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и CINtec® Увеличение чувствительности ЦИН2+ 77% 87% 13% Только ЦИН2 62% 75% 21% Только ЦИНЗ 86% 95% 11% При использовании согласованных диагнозов, установленных тремя экспертами, в качестве диагнозов сравнения было показано, что чувствительность метода диагностики ЦИН2+ увеличилась на 13% (чувствительность метода диагностики при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, составила 77% и увеличилась до 87% при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и CINtec®). Увеличение точности диагностики ЦИН2+ оказалось статистически достоверным как при анализе образцов, полученных при пункционной биопсии шейки матки (п = 249; AUC для гематоксилина и эозина = 0,895; AUC для гематоксилина и эозина в сочетании с CINtec® = 0,929; р = 0,0053), так и при анализе образцов, полученных при конизации шейки матки (п= 233; AUC для гематоксилина и эозина = 0,887; AUC для гематоксилина и эозина в сочетании с CINtec® = 0,948; р = 0,0009). Частота совпадений диагнозов ЦИН2+, установленных разными патоморфологсши Для оценки увеличения частоты совпадения диагнозов ЦИН2+, установленных участвовавшими в исследовании патоморфологами, использовали форму множественной оценки для меры согласия каппа между диагнозами, установленными при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и диагнозами, установленными при анализе срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и CINtec®. Каталожный номер: 9511 2007-9511-001EU, версия 2.3 25