Наборы реагентов для прибора преаналитической подготовки ПЦР-анализов Cobas AmpliPrep и анализаторов Cobas TaqMan 48, Cobas TaqMan, Cobas Amplicor — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
=== файл: Инструкция_руководство__dc602940_I.pdf === --- стр. 3 --- ВГС и РНК количественного стандарта (КС) ВГС. Реагент Мастермикс содержит праймфы, специфичные и для РНК ВГС, и для РНК КС ВГС. Мастермикс был разработан для одинаково эффективного количественного определения всех генотипов ВГС с 1 по 6. Вьывление амплифицированной ДНК производится с помощью мишень-специфичного и КС-специфичного олигонуклеотидных зондов, меченных каждый двумя красителями, что позволяет проводить независимое выявление ампликона ВГС и ампликона КС ВГС. Количественное определение РНК ВГС проводится с помощью КС ВГС, применение которого позволяет компенсировать ингибирование и контролировать процессы пробоподготовки и амплификации, что обеспечивает более точное определение РНК ВГС в каждом образце. КС ВГС является неинфекционной защищенной РНК, содержащей последовательность ВГС с сайтами посадки праймеров, идентичными РНК- мишени ВГС, и уникальным сайтом для зонда, благодаря которому ампликоны КС ВГС различаются от ампликонов мишени ВГС. КС ВГС добавляют в каждый образец в известном количестве копий, и он проходит все этапы пробоподготовки, обратногй транскрипции, ПЦР-амплификации и детекции. Анализатор COBAS TaqMan или анализатор COBAS TaqMan 48 рассчитывает концентрацию РНК ВГС в тестируемых образцах на основании сопоставления сигнала ВГС с сигналом КС ВГС в каждом образце и контроле. Выбор мишени Выбор последовательности-мишени РНК ВГС определяется наиболее консервативным участком генома среди разных генотипов ВГС ‘° ‘'. Для вьщеления РНК ВГС и РНК КС ВГС используется метод тотального выделения на кремниевом носителе, для амплификации РНК ВГС и РНК КС ВГС в качестве праймеров используются специфичные олигонуклеотиды. Применение мишень-специфичных и КС-специфичных олигонуклеотидных зондов, меченных двумя красителями каждый, позволяет независимое определение ампликонов ВГС и ампликонов КС ВГС. Соответственно, правильный выбор праймеров и олигонуклеотидных зондов крайне важен для нормального выявления всех субтипов ВГС. В тесте COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV для обратной транскрипции и амплификации используются праймеры к последовательности консервативной 5’- нетранслируемой области генома ВГС ‘^ . Нуклеотидная последовательность праймеров была оптимизирована таким образом, чтобы амплификация генотипов ВГС была одинаково эффективной. Подготовка образцов В тесте COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV подготовка образцов проводится автоматизировано в приборе СОВ AS AmpliPrep методом тотального выделения на кремниевых носителях. Выделение проводится из 850 мкл плазмы или сыворотки крови. Вирусные частицы ВГС лизируются при нагревании во время инкубации с протеазой и хаотропным лизирующим/связывающим буфером, высвобождающим нуклеиновые кислоты и защищающим РНК ВГС от действия РНКаз, содержащихся в плазме. Нротеаза и известное количество молекул защищенной РНК КС ВГС вносятся в каждый образец вместе с лизирующим буфером и магнитными стеклянными частицами. Затем смесь инкубируется и РНК ВГС и РНК КС ВГС связываются с поверхностью магнитных стеклянных частиц. Несвязавшийся материал - соли, белки, прочие клеточные компоненты, удаляются при отмывке магнитных стеклянных частиц. После отделения магнитных стеклянных частиц и завершения этапа отмывкми, сорбированные нуклеиновые кислоты элюируются при нагревании в водном растворе. Подготовленные образец, содержащий магнитные стеклянные частицы и свободную РНК ВГС и РНК КС ВГС, вносятся в амплификационную смесь и переносятся в анализатор СОВ AS TaqMan или анализатор СОВ AS TaqMan 48. Затем происходит обратная транскрипция РНК-мишени и РНК КС ВГС, их амплификация и одновременная детекция расщепляемых меченных олигонуклеотидных зондов, специфичных для мишени и КС. Обратная транскрипция и ЕЩР-амплификация Реакция обратной транскрипции и ПЦР-амплификации проводится с помощью термостабильного рекомбинантного фермента Thermus specie ДНК-полимеразы (Z05). В присутствии ионов марганца (Мп2+) и определенном составе буфера, Z05 обладает как активностью обратной транскриптазы, так и ДНК- полимеразы*^'*. Это позволяет проводить обратную транскрипцию и ПЦР-амплификацию одновременно с детекцией ампликонов в реальном времени. Обработанные образцы вносятся в амплификационную смесь в амплификационные пробирки (К-пробирки), в которых проводится обратная транскрипция и ПЦР-амплификация. Реакционная смесь нагревается, при этом обратный праймер специфично садится на РНК-мишень ВГС и РНК КС ВГС. В присутствии ионов М п^"" и избытке трифосфатов дезоксинуклеотидов (dNTPs) - трифосфатов дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезоксицитидина, дезоксиуридина и дезокситимидина, полимераза Z05 удлиняет севший на матрицу праймер, образуя ДЖ-цепь, комплементарную РНК-мишени. Амплификатшя мишени После обратной трансрипции РНК-мишени ВГС и РНК КС ВГС, термоциклер анализатора COBAS TaqMan или СОВ AS TaqMan 48 нагревает реакционную смесь для того, чтобы денатурировать гибрид РНК:кДНК и открыть --- стр. 4 --- сайты посадки праймеров. При охлаждении смеси праймеры гибридизуются с ДНК-мишенью. Термостабильная ДНК-полимераза Thermus specie Z05 (Z05) в присутствии ионов и избытке трифосфатов дезоксинуклеотидов (dNTPs) - трифосфатов дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезоксицитидина, дезоксиуридина и дезокситимидина, удлиняет присоединившиеся праймеры комплементарно матрице, в результате чего образуется молекула двуцепочечной ДНК, называемая ампликон. Анализатор СОВ AS TaqMan или СОВ AS TaqMan 48 автоматически повторяет эти этапы заданное количество циклов, в результате каждого цикла происходит удвоение числа ампликонов. Число циклов запрограммировано в анализаторе СОВ AS TaqMan или СОВ AS TaqMan 48. Амплифицируется только участок генома ВГС, ограниченный праймерами; полный геном ВГС не амплифицируется. Избирательная амплификация Избирательность амплификации нуклеиновой кислоты - мишени достигается в тесте СОВ AS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV за счет применения фермента AmpErase (урацил-Ы-гликозилазы) и трифосфата дезоксиуридина (dUTP). Фермент AmpErase распознает и катализирует разрушение цепей ДНК, содержащих дeзoкcиypидин^^ но не ДНК, содержащей дезокситимидин. Дезоксиуридин отсутствует в природной ДЬЖ, но всегда присутствует в ампликонах, поскольку трифосфат дезоксиуридина входит в состав смеси dNTPs в реагенте Мастермикс; поэтому дезоксиуридин содержится только в ампликонах. Дезоксиуридин делает контаминирующие ампликоны восприимчивыми к разрушению ферментом AmpErase до начала амплификации ДНК-мишени. Кроме того, фермент AmpErase разрушает любой неспецифический продукт, образовавашийся в результате первичной активации Мастермикса ионами марганца. Фермент AmpErase, входящий в состав реагента Мастермикс, катализирует расщепление содержащей дезоксиуридин ДНК по дезоксиуридиновому основанию, открывая дезоксирибозную цепь в позиции С1. При нагревании на первом этапе цикла, цепь ДНК ампликона разрывается в позиции дезоксиуридина и, следовательно, она не может в дальнейшем быть амплифицированной. Фермент AmpErase инактивируется при нагревании выше 55°С, т.е. на протяжении температурных циклов, и поэтому не разрушает ампликоны мишени, образовающиеся в процессе ППу. Детекция проду1стов ПЦР в тесте COBAS TaqMan В тесте СОВ AS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV используется метод ПЦР в реальном времени” ” . Применение зондов, меченных двумя флуоресцентными красителями, позволяет осуществлять в реальном времени детекцию накапливаемых продуктов ПЦР за счет мониторинга интенсивности эмиссии флуоресцентного красителя, высвобождающегося в процессе амплификации. Специфичные для ВГС и для КС ВГС олигонуклеотидные зонды мечены репортерным красителем и гасящим красителем. В тесте COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, для мечения зондов ВГС и КС ВГС использованы разные флуоресцентные репортерные красители. В интактных зондах репортерный краситель подавляется расположенным рядом гасящим красителем за счет эффекта переноса энергии Форстера. Во время ПЦР зонд гибридизуется с последовательностью-мишенью и разрушается из-за 5' — 3' нуклеазной активности ДНК-полимеразы ZD5. В результате репортерный и гасящий красители освобождаются и разделяются, гашение больше не происходит, и флуоресцентная активность репортерного красителя возрастает. Амплификация РНК ВГС и РНК КС ВГС измеряется независимо, на разных длинах волн. Этот процесс повторяется заданное число циклов, в каждом цикле происходит возрастание активности отдельных репортерных красителей, и происходит независимое определение РНК ВГС и РНК КС ВГС. Цикл ПЦР, при котором рост кривой накопления флуоресцентного сигнала становится экспоненциальным, определяется количеством исходного материала, внесенного в начале ПЦР. Основы количественного определения в тесте СОВ AS TaqMan Тест COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV является количественным в широком динамическом диапазоне, поскольку мониторинг ампликонов производится в экспоненциальной фазе амплификации. Чем выше титр ВГС, тем раньше флуоресцентный сигнал репортерного красителя зонда ВГС превысит пороговый уровень флуоресценции (Рисунок 1). Поскольку количество РНК КС ВГС одинаково во всех образцах, флуоресцентный сигнал репортерного красителя зонда КС ВГС должен появиться в одном и том же цикле для всех образцов (Рисунок 2). Для образцов, в которых значение флуоресценции КС не соответствует ожидаемому, концентрация рассчитывается с соответствующей поправкой. Появление специфичного флуоресцентного сигнала вьфажается как критическое пороговое значение (Ct), Ct определяется как дробный номер цикла, в котором флуоресцентный сигнал репортерного красителя превысил заданный порог (заданный уровень флуоресценции), и началась экспоненциальная фаза роста сигнала рисунок 3). Большее значение Ct указывает на меньший титр мишени ВГС в образце. Двукратное увеличение титра соответствует с уменьшением на 1 Ct для РНК-мишени ВГС, а 10-кратное увеличение титра соответствует уменьшению на 3.3 Ct. --- стр. 5 --- ф ф Т е с т C O B A S A m p l i P r e p / C O B A S T a q M a n H B V 48 Tests P/N: 03587819 190 Для диагностики IN VITRO, Тест C O BA S Am pliPrqj/COBAS TaqMan H B V H IM C A P Промывочный реагент для C O BA S AmpIiPrep/ C O BA S TaqMan PG W R 5.1 Liters P/N; 03587797 190 Назначение теста Тест C O BA S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V является in vitro тестом, основанным на амплификации нуклеиновых кислот, и предназначен для количественного определения Д Н К вируса гепатита В (В Г В ) в человеческой плазме путем автоматической подготовки образцов в приборе СО В AS Атр11Ргф и автоматической ампжфикации и детекции в анализаторе С О В AS TaqMan или C O BA S TaqMan 48. Тест предназначен для использования совместно с клиническими данными и другими лабораторными маркерами ВГВ-инфекции для оценки вирусного ответа на противовирусную терапию на основании определения изменений уровней Д Н К В Г В в плазме. Тест COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV не предназначен для скрининга на ВГВ крови и ее продукгов или для подтверясдающей диагностики ВГВ-инфекции. Введение Вирус гепатита В (В Г В ) является одним из нескольких вирусов, вызывающих гепатит. Более двух миллиардов человек в мире инфицированы или были инфицированы В Г В , более 350 миллионов из них являются хроническими носителями инфекции*. Для хронических носителей характерна высокая степень риска отдаленных осложнений инфекции, таких как Афонический гепатит, цирроз и гепатоцеллюлярная карцинома^'^ ^ Серологические м^зкеры В Г В широко используются для диагностики и прогноза острой и хронической инфекции В Г В . Основным маркером ВГВ-инфекции является выявление поверхностного антигена В Г В (HBsAg). Несмотря на то, что у носителей может исчезать HBsAg и появляться антитела к HBsAg, у них в дальнейшем остается высоким риск развития тяжелого поражения печени^'^. Е антиген В Г В (HBeAg) обычно используется как вторичный м^5кер активной репликации В Г В , связанной с прогрессирующим заболеванием печени. Продолжающаяся циркуляция HBeAg указывает на повышенный риск развития заключительной стадии заболевания печени’ ^ Некоторые варианты В Г В могут продуцировать HBeAg, не выявляемый в сыворотке крови, или могут утрачивать способность продуцировать HBeAg даже при активной инфекции’. Таким образом, применение данного маркера для мониторинга прогрессирования заболевания ограничено*". Показано, что выявление Д Н К В Г В в сыворотке крови имеет прогностическое значение с точки зрения исхода острой и хронической ВГВ-инфекции" ’'* . Современные методы позволяют выявлять Д Н К В Г В после исчезновения HBsAg или при ВГВ-инфекции, не имеющей серологических мapKфoв‘^ Однако взаимосвязь между серологическими маркерами и уровнями Д Н К В Г В в настоящее время не установлена. Эффективность антивирусной терапии, используемой для лечения пациентов с В Г Б , может оцениваться на основании серологических маркеров или активности печеночных ферментов. Однако наиболее надежным и прямым методом измерения вирусной репликации является количественное определение Д Н К В Г В в сьшоротке крови или плaзмe‘^ ’'^ ■ '^ Показано, что быстрое и устойчивое снижение уровней Д Н К В Г В у пациентов, получающих интерферон-альфа, ламивудин, ганцикловир или адефовир дипивоксил, является прогностическим фактором благоприятного результата терапйи‘°'^ '^ ^ '’. Мониторинг уровней Д Ж В Г В позволяет прогнозировать развитие устойчивости к ламивудину^*. Таким образом, количеетвенный тест для определения Д Н К В Г В является важным диагностическим инструментом, используемым совместно с опрделением серологических маркеров при ведении пациентов с ВГВ-инфекцией. Концентрация Д Н К В Г В в плазме может определяться методами амплификации нуклеиновых кислот, например, в полимеразной цепной реакции (П1ХР)” ‘“ . В тесте C O BA S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V метод ПЦР используется для достижения максимальных чувствительности и динамического диапазона при количественном определении ДИ К В Г В в образцах плазмы с ЭД ТА в качестве анти коагулянта. Принцип теста Тест С О В A S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V является тестом на основе амплификации нуклеиновых кислот, предназначенным для количественного определения Д Н К В Г В в человеческой плазме. Подготовка образцов проводится автоматизировано в приборе С О В AS AmpliPrep, амплификация и детекция проводятся автоматизировано в анализаторе C O BA S TaqMan или анализаторе C O BA S TaqMan 48. 1 --- стр. 6 --- в основе теста СО В A S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V лежат два основных процесса: (1) выделение ДНК В Г В из образца; (2) одновременная амплификация^^ в ПЦР ДНК-мишени и детекция расщепляемого олигонуклеотидного зонда, меченного двумя красителями, специфичного для выявляемой мишени. Тест СО В A S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V позволяет проводить автоматическую подготовку образцов с последующей автоматизированной ПЦР-амплификацией и детекцией мищени - ДЬЖ В Г В и ДНК количественного стандарта (К С ) В Г В . Реагент Мастер микс содержит праймеры и зонды, специфичные для ДНК В Г В , и для Д Н К К С В Г В . Мастермикс был разработан для одинаково эффективного количественного определения всех генотипов В Г В от А до G. Выявление ампжфицированпой Д Н К производится с помощью мишень-специфичного и КС-специфичного олигонуклеотидных зондов, меченных каждый двумя красителями, что позволяет проводить независимое выявление ампликона В Г В и ампликона К С В Г В . Количественное определение Д Н К В Г В проводится с помощью К С В Г В , применение которого позволяет компенсировать ингибирование и контролировать процессы пробоподготовки и амплификации, что обеспечивает более точное определение Д Ж В Г В в каждом образце. К С В Г В является неинфекционной Д Ш - конструкцией, содержащей последовательность В Г В с сайтами посадки праймеров, идентичными ДНК-мишени В Г В , и уникальным сайтом для зонда, благодаря которому ампликоны К С В Г В различаются от ампликонов мишени В Г В . КС В Г В добавляют в каждый образец в известном количестве копий, и он проходит все этапы пробоподготовки, ПЦР-амплификации и детекции. Анализатор C O BA S TaqMan или анализатор C O BA S TaqMan 48 рассчитьшает концентрацию Д Н К В Г В в тестируемых образцах на основании сопоставления сигнала В Г В с сигнапом КС В Г В в каждом образце и контроле. Выбор мишени Выбор последовательности-мищени Д Н К В Г В определяется наиболее консервативным участком генома среди разных генотипов В Г В . Для выделения Д Н К В Г В и Д Н К К С В Г В используется метод тотального выделения на кремниевом носителе, для амплификации Д Н К В Г В и Д Н К К С В Г В в качестве праймеров используются специфичные олигонуклеотиды. Применение мишень-специфичных и КС-специфичных олигонуклеотидных зондов, меченных двумя красителями каждый, позволяет независимое определение ампликонов В Г В и ампликонов К С В Г В . Соответственно, правильный выбор праймеров и олигонуклеотидных зондов крайне важен для нормального выявления всех генотипов В Г В . В тесте C O BA S AmpliPrep/COBAS TaqMan H BV для амплификации в П Ц Р используются три праймера. Генерирующий флуоресцентный сигнал зонд, меченый двумя красителями, гибридизуется с минус-цепью и разрушается ДНК-полимеразой Z05 при удлинении праймеров. Ампликон генотипов A-F состоит из 145 нуклеотидов. Ампликон генотипа G, однако, состоит из 181 нуклеотидов. Вставка величиной 36 нуклеотидов в высококонсервативном участке pre-Core/Core генома В Г В является причиной большего ампликона генотипа Подготовка образцов В тесте C O BA S Am pliPrep/COBAS TaqMan H B V подготовка образцов проводится автоматизировано в приборе СО В AS AmpliPrep методом тотального выделения на кремниевых носителях. Выделение проводится из 850 мкл плазмы. Вирусные частицы В Г В лизируются при нагревании во время инкубации с протеазой и хаотропным лизирующим/связывающим буфером, высвобождающим нуклеиновые кислоты и защищающим ДНК В Г В от действия ДНКаз, содержащихся в плазме. Протеаза и известное количество молекул защищенной ДНК КС В Г В вносятся в каждый образец вместе с лизирующим буфером и магнитными стеклянными частицами. Затем смесь инкубируется и Д Н К В Г В и Д Н К К С В Г В связываются с поверхностью магнитных стеклянных частиц. Несвязавшийся материал - соли, белки, прочие клеточные компоненты, удаляются при отмывке магнитных стеклянных частиц. После отделения магнитных стеклянных частиц и завершения этапа отмывкми, сорбированные нуклеиновые кислоты элюируются при нагревании в водном растворе. Подготовленные образец, содержащий магнитные стеклянные частицы и сюбодную Д Н К В Г В и Д Н К КС В Г В , вносятся в амплификационную смесь и переносятся в анализатор С О В AS TaqMan или анализатор СО В AS TaqMan 48. Затем происходит амплификация РНК-мишепи и РН К КС В Г В и одновременная детекция расщепляемых меченных олигонуклеотидных зондов, специфичных для мишени и КС. ПЦР-амллификация Реакция ПЦР-амплификации проводится с помощью термостабильного рекомбинантного фермента Thermus specie ДНК-полимеразы (Z05). В присутствии ионов марганца (Мп2+) и определенном составе буфера, Z05 обладает активностью ДНК-полимеразы” ” . Это позволяет проводить ПЦР-амплификацию одновременно с детекцией ампликонов в реальном времени. Обработанные образцы вносятся в амплификационную смесь в амплификационные пробирки (К-пробирки), в которых проводится ПЦР-амплификация. Термостабильная ДНК-полимераза Thermus specie Z05 (Z05) в присутствии ионов М п^"^ и избытке трифосфатов дезоксинуклеотидов (dNTPs) - трифосфатов дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезоксицитидина и дезоксиуридина удлиняет присоединившиеся праймеры, образуя цепь ДНК. --- стр. 7 --- ф Амплификация мишени Обработанные образцы вносятся в амплификационную смесь в амплификационные пробирки (К-пробирки), в которых проводится ГЩР-амплификация. Термоциклер анализатора СО В A S TaqMan или СОВ AS TaqMan 48 нагревает реакционную смесь для того, чтобы денатурировать двуцепочечную Д Н К и открыть сайты посадки праймеров. При охлаждении смеси праймеры гибридизуются с ДНК-мишенью. Термостабильная ДНК- полимфаза Thermus specie Z05 (Z05) в присутствии ионов и избытке трифосфатов дезоксинуклеотидов (dNTPs) - трифосфатов дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезоксицитидина и дезоксиуридина (вместо тимидина) удлиняет присоединившиеся праймеры комплементарно матрице, в результате чего образуется молекула двуцепочечной ДЬЖ , называемая амнликон. Анализатор C O BA S TaqMan или C O BA S TaqMan 48 автоматически повторяет эти этапы заданное количество циклов, в результате каждого цикла происходит удвоение числа ампликонов. Число циклов запрограммировано в анализаторе C O BA S TaqMan или CO BAS TaqMan 48. Амплифицируется только участок генома В Г В , ограниченный праймерами; полный геном В Г В не амплифицируется. Избирательная амплификация Избирательность амплификации нуклеиновой кислоты - мишени достигается в тесте C O BA S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V за счет применения фермента AmpErase (урацил-К-гликозилазы) и -фифосфата дезоксиуридина (dUTP). Фермент AmpErase распознает и катализирует разрушение цепей Д НК, содержаших дезоксиуридин^^, но не ДНК, содержащей дезокситимидин. Дезоксиуридин отсутствует в природной Д НК, но всегда присутствует в ампликонах, поскольку трифосфат дезоксиуридина входит в состав смеси dNTPs в реагенте Мастер микс; поэтому дезоксиуридин содержится только в ампликонах. Дезоксиуридин делает контаминирующие амплвдсоны восприимчивыми к разрушению ферментом AmpErase до начала амплификации ДНК-мишени. Кроме того, фермент AmpErase разрушает любой неспецифический продукт, образовавашийся в результате первичной активации Мастермикса ионами марганца. Фермент AmpErase, входящий в состав реагента Мастермикс, катализирует расщепление содержащей дезоксиуридин ДНК по дезоксиуридиновому основанию, открьшая дезоксирибозную цепь в позиции С1. При нагревании на первом этапе цикла, цепь /Щ К ампликона разрывается в позиции дезоксиуридина и, следовательно, она не может в дальнейшем быть амплифицированной. Фермент AmpErase инактивируется при нагревании вьшге 55°С, т.е. на протяжении температурных циклов, и поэтому не разрушает ампликоны мишени, образовающиеся в процессе П1^, Детекция продуктов ПЦР в тесте COBAS TaqMan В тесте C O BA S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V используется метод П Ц Р в реальном вpeмeни^^•^^ Применение зондов, меченных двумя флуоресцентными красителями, позволяет осуществлять в реальном времени детекцию накапливаемых продуктов П Ц Р за счег мониторинга интенсивности эмиссии флуоресцентного красителя, высвобождающегося в процессе амплификации. Специфичные для В Г В и для КС В Г В олигонуклеотидные зонды мечены репортерным красителем и гасящим красителем. В тесте С О В A S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V , для мечения зондов В Г В и КС В Г В использованы разные флуоресцентные репортерные красители. В интактных зондах репортерный краситель подавляется расположенным рядом гасящим красителем за счет эффекта переноса энергии Форстера. Во время ПЦР зонд гибридизуется с последовательностью-мишенью и разрушается из-за 5' 3' нуклеазной активности ДНК-полимеразы Z05. В результате репортерный и гасящий красители освобождаются и разделяются, гашение больше не происходит, и флуоресцентная активность репортерного красителя возрастает. Амплификация Д Н К В Г В и Д Н К К С В Г В измеряется независимо, на разных длинах волн. Этот процесс повторяется заданное число циклов, в каждом цикле происходит возрастание активности отдельных репортерных красителей, и происходит независимое определение ДЬЖ В Г В и Д Н К КС В Г В . Цикл ПЦ Р, при котором рост кривой накопления флуоресцентного сигнала становится экспоненциальным, определяегся количеством исходного материала, внесенного в начале ПЦР. Основы количественного определения в тесте СОВ AS TaqMan Тест C O BA S AmpliPrep/COBAS TaqMan H B V являегся количественным в широком динамическом диапазоне, поскольку мониторинг ампликонов производится в экспоненциальной фазе амплификации. Чем выше титр В Г В , тем раньше флуоресцентный сигнал репортерного красителя зонда В Г В превысит пороговый уровень флуоресценции (Рисунок 1). Поскольку количество Д Н К К С В Г В одинаково во всех образцах, флуоресцентный сигнал репортерного красителя зонда КС В Г В должен появиться в одном и том же цикле для всех образцов (Рисунок 2). Для образцов, в которых значение флуоресценции К С не соответствует ожидаемому, концентрация рассчитывается с соответствующей поправкой. Появление специфичного флуоресцентного сигнала выражается как критическое пороговое значение (Ct). Ct определяется как дробный номер цикла, в котором флуоресцентный сигнал репортерного красителя превысил заданный порог (заданный уровень флуоресценции), и началась экспоненциальная фаза роста сигнала рисунок 3). Большее значение Ct указывает на меньший титр мишени В Г В в образце. Двукратное увеличение титра соответствует с уменьшением на 1 Ct для ДНК-мишени В Г В , а 10-кратное увеличение титра соответствует уменьшению на 3.3 Ct. --- стр. 8 --- ф о о в ю ,4N 1PI.КХ Ж ™ CN4 AMPLICOR AVIDIN-HRP CONJUGATE 3 х 100 тестов Ампликор авидин-пероксидазный (HRP) коньюгат. авидин- пероксидазный коньюгат в буф ерном растворе, содержащий 1% ПроКлин (150) (консервант), эмульгатор, бычий гамма глобулин и 0,1% ф енол SB3 Substrat А 5 X 75 тестов Ампликор субстрат А, раствор цитрата, содежащий 0,01% перекиси водорода и 0,0% ПроКлин 150 SB Substrat А Ампликор субстрат В содержит 0,1% 3,3' 5,5-тетраметилбензидин (ТМБ) 5 X 5 м л 4( Toxic В 40% диметилф ормамиде (ДМФ) Внимание! ТМБ и ДМФ являются токсичными веществами, которые могут вьпвать поврежждение плода, кожи и глаз» Чтобы избежать повреждений, знакомьтесть с инструкциями ио работе с токсичными веществами перед исследованием. В случае несчастного случая, если Вы почувствовали недомогание, то немедленно обратитесь за медицинской помощью (промаркируйте специально реагенты содержащие токсичные вещества). COBAS AMPLICOR Wash Buffer WB (lOX- Wash concentrate) Ампликор lOx отмывающий концентрат. 2 x 250 тестов Фосф ат натрия и солевой раствор с ЭДТА, содержащий <2% детергента и 0,5% ПроКлин 300 2 /2 0 0 3 , R e v is io n 4 .0 C O B A S A M P L IC O R H IV -1 M O N IT O R T e s t , v e rs io n 1 .5