Реагенты для лабораторной диагностики in vitro кардиологических заболеваний (см. Приложение на 1 листе) — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
=== файл: Инструкция_руководство__o38411_I.pdf ===
--- стр. 1 ---
MONOBIND, INC.
Costa Mesa, CA 92627 (USA)
Инструкция no применению
Реагенты лабораторные для in vitro диагностики кардиологических заболеваний
/
и . .
--- стр. 2 ---
MONOBIND, INC.
Costa Mesa, CA 92627 (USA)
МИОГЛОБИН
AccuBInd^'^ ELISA Microwellsi
Хемилюминесцентные тесты CIA
Код товара: 2225-300
Назначение:
Количественное определение концентрации циркулирующего
миоглобина в человеческой сыворотке, плазме или моче при помощи
иммуноферментного теста.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Миоглобин - фермент, находящийся преимущественно в сердечной и скелетных
мышцах. Он представляет собой белок, связывающий кислород, и является
мономерной формой гемоглобина. Как мономер гемоглобина (тетрамера) миоглобин
имеет одну четвертую молекулярного веса гемоглобина (18 кО). Поскольку
миоглобин, как и FABP (белок, связывающийся с жирными кислотами) - это
цитоплазматический протеин, присутствующий не только в сердце, но и в мышцах
скелета, его концентрацию в плазме сложно использовать в качестве маркера
состояния мышц из-за трудностей в дифференцировке травмы сердца от травмы
скелетных мышц. Однако содержание миоглобина в человеческом сердце ниже, чем
в мышцах скелета.
Во всем мире для подтверждения диагноза острого инфаркта миокарда проводится
серийное измерение биохимических маркеров. Миоглобин - один из важнейших
сердечных маркеров, позволяющий исключить острый инфаркт миокарда через 2
часа после появления боли в груди. При инфаркте повреждаются мембраны клеток
сердца, и белки высвобождаются в сосудистую систему. Измерение некоторых
белков, включая миоглобин, креатинкиназу-МВ (СК-МВ), лакт ат -дегидрогеназу -1
(LD1) и сердечный тропонин (ТЫ и ТпТ), полезно при диагностике острого инфаркта
миокарда. Клиническая полезность каждого маркера зависит от специфических
характеристик белка. Миоглобин, самый малый из этих маркеров, быстро
распространяется по сосудистой системе и позволяет рано диагностировать
инфаркт. Уровень миоглобина повышается через 0.5 - 2.0 часа после появления
болей в груди и достигает пика через 5-12 часов. Почки быстро выводят миоглобин
из системы, восстанавливая нормальную концентрацию за 16-36 часов. Поскольку
скорость выведения белка из организма высока, измерение уровня миоглобина
позволяет надежно диагностировать повторный инфаркт. Также определение
концентрации миоглобина позволяет исключить инфаркт миокарда. Согласно модели
программы неотложной помощи при заболеваниях сердца два последовательных
измерения: первое - после приема пациента и второе - 2 часа спустя позволяют
верно исключить инфаркт миокарда в почти 100% случаев. Миоглобин участвует в
аэробном метаболизме в сердечной мышце и мышцах скелета, поэтому его
концентрация становится очень высокой при травмах мышц. Почечная
недостаточность и другие заболевания почек тоже приводят к повышению уровня
миоглобина. Большинство подобных осложнений сопровождается четкими
клиническими симптомами, которые позволяют поставить диагноз. Серийное
измерение миоглобина и изофермента креатинкиназы-МВ при приеме пациента и
через 3, 6 и 9 часов у людей с симптомами предполагаемой острого ишемического
коронарного синдрома с недиагностической ЭКГ более эффективно, чем
последовательное снятие электрокардиограмм, эхокардиография и поэтапное
выполнением нагрузочных проб. (M onobind предст авляет от личн ы й т ест E lisa
- СаШ 2925-300 - д л я определения ур о вн я циркулирую щ ей креат инкиназы -М В
в человеческой сы ворот ке или плазме).
Калибраторы миоглобина, препарат пациента и контроли добавляют в лунку,
покрытую стрептавидином. Добавляют биотинилированное моноклональное
антитело и антитела, меченые ферментами (направленные против различных
участков эпитопа миоглобина) и реагенты смешивают. В результате реакции между
различными антителами миоглобина и нативным миоглобином формируется
сандвичевый комплекс, который не отделяется от лунки.
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитепа с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител миоглобина при помощи
декантации или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности
лунки добавляют подходящий субстрат.
Используя несколько известных различных контрольных показателей миоглобина в
сыворотке, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию миоглобина в препарате.
--- стр. 3 ---
ПРИНЦИП
Иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке, и
нативный антиген. При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста
на поверхности лунки микропланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и
добавления извне моноклонального антитела к миоглобину (АЬ).
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стерического несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сэндвичевый комплекс.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
A O mY O + ^A blm l
а
^^Abimi-A q i m -n i-^ A b im i
- моноклональное антитело1т)
Ап МУР - нативный антиген (переменное количество)
- антитело, помеченное ферментами (в избытке)
Enz,. . Bti., - сэндвичевый комплекс антиген-антитело
АР|т 1-Адиуп- АЦгп)
•<а .постоянная скорость ассоциации
-а - постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрептавидином и биотинилированным антителом.
Эта реакция показана ниже:
^'^Ab„"-AaizYn-^^ im>+Stfeptr w=»immobilized complex
Streplavidirt w - иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки.
Imirabilized complex ' сэндвичевый комплекс на сплошной поверхности.
После достижения равновесия, фракцию антиген-антитело отделяют от несвязанных
антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность ферментов в фракции
связанных антител прямо пропорциональна концентрации нативного антигена.
Используя несколько различных известных контрольных показателей антигена.
можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью неизвестную
концентрацию антигена.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики 1п Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более двух (2) дней или
при температуре минус 20°С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
РЕАГЕНТЫ:
А. Калибраторы миоглобина 2.0 ml/пробирка [Обозначения А - F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением антигена миоглобина для уровней
антигена 0(A), 10(B), 25(C), 50(D), 150(E), и 400(F) ng/ml. Добавьте в каждую пробирку
2 мл дистиллированной или деионизированной воды. Не замораживайте и не
размораживайте более 1 раза. Восстановленные калибраторы стабильны в течение
30 дней при температуре 2-8°С. Для более длительного хранения поместите
калибраторы в специальные пробирки и держите при температуре - ЮС.
Консервирующее вещество добавлено.
--- стр. 4 ---
Примечание: калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
по гравиметрическому весу белка от >99% препарата.
B. Конъюгат ферментов миоглобина —13 т1/про6ирка
Одна (1) пробирка, содержащая очищенное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиной IgG в буфере с красителем и
консервантом
Хранить при температуре 2-8°С.
C. Лунки со Стрептавидином - 96 лунок - Значок U
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-8°С.
D. Концентрат промывающего раствора — 20т1 - значок V
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30°С (см. Раздел по подготовке реагентов).
сАE. Сигнальный реагент А — 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с тетраметилбензидином в буфере. Хранить при температуре 2-8“С.
(см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8°С (см. Раздел по подготовке реагентов).
G. Стоп-реагент - 8.0т1/пробирка - обозначение
Одна бутыль с сильной кислотой (1N НС1). Хранить при 2-30°С.
H. Вкладыш в упаковку.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 25, 50 и 100 р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 450 и
620 пт (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Диспенсер для многократного распределения объема 200-1000 р1.
10. Контейнер для хранения буфера для промывания.
11. Дистиллированная или деионизированная вода.
12. Материалы для контроля качества.
13. Контейнер для смешивания реагентов (см. ниже)
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°С) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор субстрата
Перелейте содержимое пробирки ‘А’ в пробирку 'В’. Смешайте и храните при
температуре 2-8°С. Используйте в течение 60 дней.
Определите необходимое количество реагента и подготовьте его, смешав равные
порции субстрата А и субстрата В в подходящем контейнере. Например, добавьте 1
МП А и 1 мл В в два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток
раствора. Выбросьте неиспользованную долю раствора).
Примечание: не используйте раствор, если он стал синим.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведит е все реагент ы, конт роли и калибрат оры
сыворот ки до комнат ной т емперат уры (20 - 27° С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°С.
2. Внесите 0.025 ml (25р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) ферментного реагента миоглобина в каждую лунку.
Необходимо вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
--- стр. 5 ---
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(CIM. раздел о подготовке реагентов).
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
10. Добавьте 0.050 ml (50р1) стоп-реагента во все лунки и осторожно перемешивайте
в течение 15-20 секунд. Считайте абсорбцию в каждой лунке при 450пт (используя
результат при длине волны 620-630пт для поправки на несовершенство лунок).
Измерение должно проводиться в течение тридцати (30) минут после
добавление конечного реагента.
Примечание: Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке, чтобы
минимизировать разницу времени реакции у различных лунок.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроля в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации миоглобина в препаратах используется
кривая дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от концентрации миоглобина в ng/ml. (найдите среднее
абсорбции каждого дубликата калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию миоглобина найдите точку
пересечения его абсорбции с кривой и по горизонтальной оси графика определите
концентрацию (в ng/ml). (См. рисунок 1).
ОБРАЗЕЦ I
_
Ь 3
z
1 1
>orc / > CT 3 E g
т зФ
O ’ =Ф > 3 ^ .1 «
Са1А
A1 0.003 0.004 0
B1 0.004
Cal В
Cl 0.115 0.118 10
D1 0.121
Cal С El 0.287 0.293 25
FI 0.299
Cal D G1 0.555 0.571 50
HI 0.586
CalE
A2 1.487
1.479 150
B2 1.470
CalF
C2 2.750 2.656 400
D2 2.563
Ctrl 1
E2 0.601
0.594 52.0
F2 0.586
Ctrl 2 G2 1.330 1.334 133
H2 1.338
Patient 1 A3 0.549 0.532 43.0
B3 0.515
--- стр. 6 ---
Рнс.1
200 300
Миоглобин в ng/ml
500
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий;
1. Абсорбция калибратора “А” ng/dl должна быть s 0.1
2. Абсорбция калибратора “F’ ng/dl должна быть 2 1.3
3. Четыре из шести контрольных смесей должны находиться в установленном
диалаэоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во
избежание смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять
субстрат и конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб
минимизировать разницу во времени реакции.
5. Не допускается использование препаратов с сильной микробной
контаминацией, с повышенным содержанием липидов и гемолизированных
препаратов.
6. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
7. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
8. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из
разных наборов
9. Пробы с концентрацией миоглобина выше 400 ng/ml можно разбавить в
нулевом калибраторе или человеческой сыворотке или моче, не содержащей
миоглобина, и протестировать повторно. Чтобы получить концентрацию
миоглобина, умножьте результат теста на коэффициент разбавления.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Концентрация миоглобина в плазме и сыворотке одинакова. Однако для анализа
предпочтительнее проба сыворотки, быстро отделенной от красных клеток крови.
Концентрация миоглобина выше у спортсменов или у людей, ежедневно
занимающихся интенсивными физическими упражнениями.
Диапазон нормальных значений для популяции зависит от множества факторов:
специфичности метода, тестируемой популяции и точности метода, используемого
лаборантом. Поэтому любая лаборатория выработать собственные пределы
нормальных значений.
На основе результатов проведенных тестов Monobind Inc. и литературных
источников, составлен нормальный диапазон значений:
Для взрослых (в норме) < 96 ng/ml
Реагенты для теста AccuBind™ Myoglobin Microplate Elisa составлены таким образом,
чтобы исключить максимальное мешающее взаимовлияние; однако возможно
взаимодействие между редкими препаратами сыворотки и реагентами, приводящее к
получению ошибочных результатов. Наличие гетерофильных антител приводит к
таким интерференциям и затрудняет анализ при использовании любых
иммуноферметных тестов. (Boscato LM Stuart МС. 'Heterophilic antibodies: а problem for
all im m unoassays' Clin. Chem 1988:3427-33). Поэтому врач при постановке диагноза
должен учитывать историю болезни И результаты всех клинических и лабораторных
исследований.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
--- стр. 7 ---
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
ПРОБА N X О C.V.
Смесь 1 20 7.71 0.82 10.6%
Смесь 2 20 31.3 1.67 5.3%
Смесь 3 20 118 3.43 2.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
ПРОБА N X C.V.
Смесь 1 20 8.15 0.79 9.7%
Смесь 2 20 36.7 1.45 3.9%
Смесь 3 20 124 5.54 4.5%
•данные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение M onobind Mioglobin Microplate ELISA™ с радиоиммуным
тестом путем анализа препаратов (симптоматических и бессимптомных). Общее
количество исследованных препаратов - 202. Диапазон полученных значений - от 0
до 118 ng/ml. Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод Среднее (х)
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
Коэффициент
корреляции
Этот метод (у) 24.37
у=-1.97+1.12(х) 0.989Метод для
сравнения (х) 25.34
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент корреляции
показывают отличную согласованность методов.
С. Чувствительность
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О ng/ml при использовании
статистики 2а (95% точности) для расчета минимальной дозы. Чувствительность
данного теста оказалась равной 1.0 ng/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность метода оценивалась путем добавления дополнительных
веществ в матрицу сыворотки. При добавлении очень высоких концентраций
гемоглобина, СК-МВ, Тп1 и FABP не обнаружилось никакой перекрестной
реактивности.
Наличие липемин (25 mg/ml); гемоглобина (4.0 mg/ml) и билирубина (2.5 mg/ml) не
повлияло на точность теста.
E. Сверхдозовый "хук"-эффе 1ст:
На точность теста не влияют концентрации миоглобина до 10,000 ng/ml в сыворотке.
Однако пробы с предполагаемым уровнем концентрации выше 400 ng/ml необходимо
растворять в нормальной смешанной человеческой сыворотке в соотношениях 1:10 и
1:100 для получения базового значения. При определении скорректированной
концентрации миоглобина в пробе нужно учитывать базовое значение и
коэффициент разбавления.
СПИСОК справочной ЛИТЕРАТУРЫ
1. Apple Fred S, Christenson RH, Valdes RJ, Andriak AB, Duh Show-Hong, Feng YJ,
Saeed AJ, Johnson Nancy J, Koplen Brenda, Mascotti K, and Wu Alan J.
‘Simultaneous Rapid Measurement of Whole Blood Myoglobin, Creatine Kinase MB,
and Cardiac Troponin I by the Triage Cardiac Panel for Detection of Myocardial
Infarction.’ Clin Chem 1999; 45:199-205.
2. Adams JE, Schechtman KB, Landt Y, et al. Comparable detection of acute
myocardial infarction by creatine kinase MB isoenzyme and cardiac troponin I. Clin
Chem 1994;40:1291-5.
3. Apple FS, Preese LM. Creatine kinase-MB: detection of myocardial infarction and
monitoring reperfusion. J Clin Immunoassay 1994;17:24-9.
4. Bhayana V, Cohoe S, Leung FY, et al. Diagnostic evaluation of creatine kinase-2
mass and creatine kinase-3 and -2 isofonn ratios in early diagnosis of acute
myocardial Infarction. Clin Chem 1993; 39:488-95. 4) Bruns DE.
5. Diagnosis of acute myocardial infarction when skeletal muscle damage is present: a
caveat regarding use of creatine kinase isoenzymes. Clin Chem 1989; 35:705.
6. Gibler WB, Lewis LM, Erb RE, et al. Early detection of acute myocardial infarction in
patients presenting with chest pain and nondiagnostic ECGs; serial Myoglobin
sampling in the emergency department. Ann Emerg Med 1990; 19:1359-66.
7. Henderson AR, Stark JA, McQueen MJ, et al. Is determination of creatine kinase-2
after electrophoretic separation accurate? Clin Chem 1994; 40:177-83.
8. Kallner A, Sylven C, Brodin. U, et al. Early diagnosis of acute myocardial infarction;
a comparison between chemical predictors. Scand J Clin Lab Invest 1989; 49:633-9.
9. Klyasu Y. John. Current status of detecting Myoglobin for patient management. Am
Clin Prod Rev 1985; 4:29-31.
10. Lang H, Wuerzburg U. Creatine kinase, an enzyme of many forms. Clin Chem 1982;
28:1439-47.
11. Lee KN, Csako G, Bernhardt P, Elin RJ. Relevance of macro creatine kinase type 1
and type 2 isoenzymes to laboratory and clinical data. Clin Chem 1994; 40; 1278-
83.
--- стр. 12 ---
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
13. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подгот овке реагент ов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
14. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
15. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи
микропланшетного люминометра на 96 лунок (0.2-1.0 секунды на лунку). Измерение
должно проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроля в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации IgE в препаратах используется кривая
дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации IgE в ng/ml.
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию IgE, отложите среднее RLU каждого
препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с кривой и по
горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ng/ml) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
ниже примере, среднее RLU (32233) пересекает калибровочную кривую при
концентрации IgE 106 ng/ml. (См. рисунок 1).
ОБРАЗЕЦ 1
I.D.
I
uо
2.r*
o*D
>O'
vtо"TO'filЭоФ
>O'
о
Dl ?
О 3
Ф
3
Ооо■С: о
i =
I 1
о3
Cal А
A1 99
105 0
B1 111
Cal В
Cl 610
613 5
D1 615
Cal С
El 5465
5506 25
F1 5547
Cal D
G1 15541
15330 50
HI 15119
CalE
A2 47459
45913 150
B2 44366
CalF
C2 114247 114095 400
D2 113942
Ctrl 1
E2 93140
90912 307
F2 88684
Ctrl 2
G2 26660
27402 91
H2 28143
Patient 1
A3 32695 32233 106
B3 31770
--- стр. 13 ---
р
, г - н
, / »
t *
* - ч *
^ 11<111ИС11Т
о 100 200 100 « о ООО
Значения IgE в пд/гл1
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
=100,000 RLU для калибратора ‘Р (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20% ) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
3. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
4. Не допускается использование препаратов с сильной микробной контаминацией, с
повышенным содержанием липидов и гемолизированных препаратов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
6. Концентрация IgE в сыворотке зависит от множества факторов: включая
чувствительность пациента, количество контактов с аллергеном, и т.д.
Только концентрации общего IgE недостаточно для оценки клинического состояния
пациента. При диагностике необходимо учитывать всю клиническую информацию,
включая результаты теста на специфический аллерген. Поскольку иммуноглобулин Е
участвует не во всех атопических реакциях, необходимо принимать во внимание всю
историю болезни, перед тем как выносить решение о пациенте, показатели IgE
которого находятся в рамках нормы.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Приблизительные пределы нормальных показателей для различных возрастных
групп приведены в таблице 1:
ТАБЛИЦА 1
Возраст (лет) Количество Среднее Диапазон
0-3 31 6.4 не определяется - 46
3-16 43 25.0 не определяется - 280
взрослые 145 43 0-200
(только для справки)
Каждой лаборатории рекомендуется найти собственный диапазон нормальных и
анормальных значений, поскольку они всегда зависят от популяции,
местоположения, методов лаборатории и т.д.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анапизов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - lU/ml)
Для оценки внутрианалитической сходимости теста Monobind IgE CIA™ были
проанализированы 20 копий каждого препарата сыворотки (на низком, среднем и
высоком диапазоне дозового ответа). Была получена внутрианалитическая
сходимость от 3.7 до 8.2%.
Низкий Средний Высокий
Количество 20 20 20
Среднее 44.8 154.4 “2 8 2 ^ ^ ? ^
Стандартное отклонение 3.7 7.0 10.3
Коэффициент вариации % 8.2 4.6 3 .7 Ж У
--- стр. 14 ---
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
Для оценки межаналитической сходимости метода Monobind CIA™ был
проанализирован один дубликат каждой из трех проб смешанной сыворотки (в
низком, среднем и высоком диапазоне кривой дозовой зависимости) в 10 тестах,
проведенных за 6 месяцев, что потребовало пяти разных наборов реагентов и трех
различных операторов. Была получена межаналитическая сходимость от 3.3 до
9.5%.
Низкий Средний Высокий
Количество 10 10 10
Среднее 45.5 160.3 295
Стандартное отклонение 4.3 10.4 9.7
Коэффициент вариации % 9.5 6.5 3.3
В. Точность
Было проведено сравнение M onobind IgE Microplate CIA™ со стандартным
иммуноферментным тестом {Elisa) путем анализа препаратов с низкой, нормальной
и высокой концентрацией, (диапазон значений от 0.8 до 3100 lU/ml).
Общее количество исследованных препаратов - 219. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для IgE CIA по
сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4.
Метод Среднее (x)
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
Monobind CIA “X” 178 х=-12.Э+1.21(у)Monibind Elisa “Y” 157
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент корреляции
показывают отличную согласованность методов.
С. Параллелизм
Два препарата с сывороткой были протестированы методом Monobind IgE CIA™ в
растворе (нулевого калибратора) и нерастворенными. Полученные и ожидаемые
значение приведены в таблице 5.
Проба Полученный
результат
Ожидаемое
значение
Процент
соответствия
Смесь 1 106.8 - -
Смесь 1/2 50.8 53.4 95.1
Смесь 1/4 25.3 26.7 94.8
Смесь 1/8 13.4 13.3 100.6
Смесь 2 395.9 - -
Смесь 2/2 189.5 197.9 95.8
Смесь 2/4 106.1 98.9 107.2
Смесь 2/8 48.0 49.5 96.9
Смесь 2/16 25.8 24.7 104.2
D. Чувствительность
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией 0 ng/ml при использовании
статистики 2 SD для расчета минимальной дозы. Чувствительность метода Monobind
IgE CIA™ равна 1.0 llU/ml.
E. Специфичность
Перекрестная реактивность метода IgE CIA™ на сходные иммуноглобулины
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
концентрациях вдвое выше физиологических. Не было отмечено никакой
перекрестной чувствительности между используемыми антителами и тестируемыми
молекулами.
F. Линейность
Две смеси сыворотки с известной концентрацией IgE были проанализированы
методом Monobind IgE CIA™. Полученные и ожидаемые значение приведены в
таблице 6.
Проба Полученный
результат lU/ml
Ожидаемое
значениеlU/ml
Процент
соответствия
Смесь 1 25.7 - -
Смесь 1+25 50.7 50.7 100.0
Смесь 1+50 74.8 75.7 101.2
Смесь 1 + 100 122.7 125.7 97.6
Смесь 1 + 200 232.0 225.7 102.7
Смесь 2 12.3 - -
Смесь 2 + 25 41.7 37.3 111.2
Смесь 2 + 50 62.6 62.3 100.6
Смесь 2+100 109.4 112.3 97.4
Смесь 2 + 200 197.2 212.3 92.8
--- стр. 17 ---
^СК-МВ. + ®"^m)
-а
- моноклональное антитело
Ад г . к.M R - нативный антиген (переменное количество)
Enz.. - антитело, помеченное ферментами (в избытке)Си'лГ
^'^Abrn 4-AgcicMB-°*^Ab(m) - сэндвичевый комплекс антиген-антитело
.постоянная скорость ассоциации
-я - постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрептавидином и биотинилированным антителом.
Эта реакция показана ниже:
^’^Abtmt-Aqr.K-ма-°*'АЬш.>+51гер1п w=>immobilized complex
Streptavidit^ w - иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки.
Immobilized complex * сэндвичевый комплекс на сплошной поверхности.
После достижения равновесия, фракцию антиген-антитело отделяют от несвязанных
антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность ферментов в фракции
связанных антител прямо пропорциональна концентрации нативного антигена.
Используя несколько различных известных контрольных показателей антигена,
можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью неизвестную
концентрацию антигена.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С. поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с лабораторными правилами обращения с препаратами крови в
"Biosafety in Microbiologicai and Biomedical Laboratories," 2-я редакция, 1988, HHS
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток. Перед центрифугированием препарата убедитесь, что кровь полностью
свернулась. Иначе наличие в крови фибрина может привести к получению неверных
результатов.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более двух (2) дней или
при температуре минус 20”С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
РЕАГЕНТЫ:
А. Калибраторы креатинкиназы МВ 2.0 ml/пробирка (лиофилизованные)
[Обозначения А - F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением антигена креатинкиназы для
уровней антигена 0(A), 4(B), 10(C), 40(D), 100(E), и 400(F) ng/ml. Добавьте в каждую
пробирку 1 мл дистиллированной или деионизированной воды. 1-1е замораживайте и
не размораживайте более 1 раза. Восстановленные калибраторы стабильны в
течение 7 дней при температуре 2-8°С. Для более длительного хранения поместите
калибраторы в специальные пробирки и держите при температуре - ЮС.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание: калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
по гравиметрическому весу белка от >99% препарата.
B. Конъюгат ферментов креатинкиназы —13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка, содержащая очищенное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиной IgG в буфере с красителем и
консервантом
Хранить при температуре 2-8°С.
C. Лунки со Стрептавидином - 96 лунок - Значок U
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-8°С.
D. Концентрат промывающего раствора — 20т1 — значок *
--- стр. 18 ---
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30°С (см. Раздел по подготовке реагентов).
«АE. Сигнальный реагент А - 7мл/пробирка - Обозначение °
Одна (1) бутыль с тетраметилбензидином (ТМВ) в буфере. Хранить при температуре
2-8°С. (см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8°С (см. Раздел по подготовке реагентов).
G. Стоп-реагент - 8.0т1/пробирка - обозначение
Одна бутыль с сильной кислотой (1N HCI). Хранить при 2-30“С.
H. Вкладыш в упаковку.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка дня раскапывания объема 50 и 100 р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в О.ЮОпт! и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 450 и
620 пт (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Диспенсер для многократного распределения объема 200-1000 р1.
10. Контейнер для хранения буфера для промывания.
11. Дистиллированная или деионизированная вода.
12. Материалы для контроля качества.
13. Контейнер для смешивания реагентов (см. ниже)
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°С) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор субстрата
Перелейте содержимое пробирки ‘А’ в пробирку ‘В’. Смешайте и храните при
температуре 2-8°С. Используйте в течение 60 дней.
Определите необходимое количество реагента и подготовьте его, смешав равные
порции субстрата А и субстрата В в подходящем контейнере. Например, добавьте 1
мл А и 1 мл В в два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток
раствора. Выбросьте неислользованную долю раствора).
Примечание: не используйте раствор, если он выглядит синим.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведит е все реагент ы, конт роли и калибрат оры
сыеоротки до комнат ной т емперат уры (20 - 27° С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°С.
2. Внесите 0.025 ml (25р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) ферментного реагента СК-МВ в каждую лунку.
Необходимо вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре (20 - 25° С).
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовке реагентов).
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати
10. Добавьте 0.050 ml (50р1) стоп-реагента во все лунки и ocтopoжJ
в течение 15-20 секунд. Считайте абсорбцию в каждой лунке npi
результат при длине волны 620-630nm для поправки на nei
--- стр. 19 ---
Измерение должно проводиться в течение тридцати (30) минут после
добавление конечного реагента.
Примечание: Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке, чтобы
минимизировать разницу времени реакции у различных лунок.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроля в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации креатинкиназы-МВ в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от концентрации СК-МВ в пд/гл1. (найдите среднее
абсорбции каждого дубликата калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию СК-МВ найдите точку пересечения
ее абсорбции с кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию
(в ng/ml). (См. рисунок 1).
Рис.1
ОБРАЗЕЦ 1
сл^ в»
р 1ф li
>crV)
s
C T 3
“ 8
5 ^
5 S
1 s
Cal А
A1 0.022 0.022 0
B1 0.023
Са1В
C1 0.097
0.103 4.0
01 0.107
Cal С
El 0.421 0.429 10
FI 0.439
Cal D G1 0.889 0.901 40
HI 0.910
CalE A2 1.976 1.971 100
B2 1.966
CalF
C2 2.717 2.643 400
02 2.570
CtrM
E2 0.429
0.433 11.2
F2 0.437
Ctrl 2
G2 1.861 1.887 84.2
H2 1.913
Patient 1 A3 0.388 0.405 9.1
B3 0.421
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
--- стр. 20 ---
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Абсорбция калибратора *А* ng/dl должны быть й 0.1
2. Абсорбция калибратора ‘F’ ng/dl должны быть 2 1.3
3. Четыре из шести контрольных смесей должны находиться в установленном
диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во
избежание смещения результатов теста.
При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять
субстрат и конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб
минимизировать разницы во времени реакции.
Не допускается использование препаратов с сильной микробной
контаминацией, с повышенным содержанием липидов и гемолизированных
препаратов.
Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
3.
5.
8. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из
разных наборов
9. Пробы с концентрацией СК-МВ выше 100 ng/ml можно разбавить в нулевом
калибраторе и протестировать повторно. Чтобы получить концентрацию СК-
МВ, умножьте результат теста на коэффициент разбавления.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Значения СК-МВ выше в плазме, чем в сыворотке, поэтому анапиз сыворотки
предпочтительнее. По сравнению с показателями концентрации у пациентов с
нормальным весом и без диабета, уровень СК-МВ выше у пациентов с ожирением,
не больных диабетом, и ниже у тренированных спортсменов.
Каждой лаборатории рекомендуется найти собственный диапазон нормальных и
анормальных значений, поскольку они всегда зависят от местоположения,
популяции, лаборатории, оборудования и особенностей метода.
На основе клинических данных, собранных Monobind и указанных в специальной
литературе, были определены следующие пределы:
(только для справки)
Взрослые (норма) 2.0 - 5.2 ng/ml
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
ПРОБА N X а C.V.
Смесь 1 20 0.82 0.07 8.53%
Смесь 2 20 12.11 0.59 4.87%
Смесь 3 20 58.10 3.74 6.44%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. ■ng/ml)
ПРОБА N X а C.V.
Смесь 1 20 0.86 0.09 10.4%
Смесь 2 20 13.31 1.22 9.16%
Смесь 3 20 52.52 2.84 5.45%
'данные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение M onobind СК-МВ Microplate ELISA™ с радиоиммуным
тестом путем анализа препаратов (симптоматических и бессимптомных). Общее
количество исследованных препаратов - 202. Диапазон полученных значений - от 0
до 86 ng/ml. Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод Среднее (х)
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
Коэффици^т
Этот метод (у) 12.52
y=0.5477+0.9946(x)i
JL.O /___ - \
Метод для
сравнения (х) 12.04
01^^ 0 *
--- стр. 21 ---
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент корреляции
показывают отличную согласованность методов.
С. Чувствительность
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О ng/ml при использовании
статистики 2а (95% точности) для расчета минимальной дозы. Чувствительность
данного теста оказалась равной 0.05 ng/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность метода оценивалась путем добавления дополнительных
веществ в матрицу сыворотки. При добавлении очень высоких концентраций
гемоглобина, СК-МВ, Тп1 и FABP не обнаружилось никакой перекрестной
реактивности.
Добавление изоформ креатинкиназы (СК-ВВ и СК-ММ) в высоких концентрациях не
повлияло на точность теста.
СПИСОК справочной литературы
Adams JE, Schechtman КВ, Landt Y, et al. Comparable detection of acute
myocardial infarction by creatine kinase MB isoenzyme and cardiac troponin I. Clin
Chem 1994;40:1291-5.
Apple FS, Preese LM. Creatine kinase-MB; detection of myocardial infarction and
monitoring reperfusion. J Clin Immunoassay 1994;17:24-9.
Bhayana V, Cohoe S, Leung FY, et al. Diagnostic evaluation of creatine kinase-2
mass and creatine kinase-3 and -2 isoform ratios in early diagnosis of acute
myocardial infarction. Clin Chem 1993;39:488-95. 4) Bruns DE.
Diagnosis of acute myocardial infarction when skeletal muscle damage is present: a
caveat regarding use of creatine kinase isoenzymes. Clin Chem 1989;35;705.
Gibler WB, Lewis LM, Erb RE, et al. Early detection of acute myocardial infarction in
patients presenting with chest pain and nondiagnostic ECGs; serial CK-MB
sampling in the emergency department. Ann Emerg Med 1990;19:1359-66.
Henderson AR, Stark JA, McQueen MJ, et al. Is determination of creatine kinase-2
after electrophoretic separation accurate? Clin Chem 1994;40:177-83.
Kallner A, Sylven C, Brodin. U, et al. Early diagnosis of acute myocardial infarction;
a comparison between chemical predictors. Scand J Clin Lab Invest 1989;49:633-9.
Kiyasu Y. John. Current status of detecting CK-MB for patient management. Am Clin
Prod Rev 1985;4:29-31.
Lang H, Wuerzburg U. Creatine kinase, an enzyme of many forms. Clin Chem
1982;28:1439-47.
10. Lee KN, Csako G, Bernhardt P, Elin RJ. Relevance of macro creatine kinase type 1
and type 2 isoenzymes to laboratory and clinical data. Clin Chem 1994;40;1278-83.
11. Lee TH, Rouan GW, Weisberg MC, et al. Sensitivity of routine clinical criteria for
diagnosing myocardial infarction within 24 hours of hospitalization. Ann Intern Med
1987;106:181-6.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
12. Panteghini M. Creatine kinase MB isoforms. J Clin Immunoassay 1994;17:30-4.
13. GibblerWB, Runyon JP, Levy RC, Sayre MR, Kacich R, Hattemar CR, et al. ‘A rapid
diagnostic and treatment center for patients with chest pain in the emergency
department.’ Ann Emerg Med 1995;25:1-8.
Редакция: оригинал.
Cat# 2925-300.
Date: 10.10.02
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email: info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.
--- стр. 25 ---
IBBW!!
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна лроверять контроля в низком, q}eднeм и высоком
диалазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Максимальная абсорбция должна
соответствовать полученной при предыдущих тестах. Значительное отклонение от
обычных показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения
теста или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие
реагенты, чтобы определить причину отклонений. *
Рис. 1
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
ОБРАЗЕЦ I
СО
^ 0>
р 1
ф
ll
Ф
>
СГ
<n
>
о
— §
ГО ^
i s
1 i
Cal А
A1 2.306
2.311 0
B1 Z316
Cal В
C1 2.012
2.018 0.25
D1 2.024
Cal С
E1 1.717
1.701 0.5
F1 1.685
CalD
G1 1.144
1.184 1
H1 1Z24
CalE
A2 0.662
0.672 2
B2 0.683
Cal F
C2 0,379
0.387 4
D2 0.396
Patient
E2 1.240
1.262 0.9
F2 1284
--- стр. 26 ---
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Абсорбция калибратора О ng/dl должны быть 2 1.3
2. Четыре из шести контрольных смесей должны находиться в установленном
диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов. Пипетирование проб не должно занимать
более десяти (10) минут во избежание смещения результатов теста. При
использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
2. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять
субстрат и конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб
минимизировать разницы во времени реакции.
3. Не допускается использование препаратов с сипьной микробной
контаминацией, с повышенным содержанием липидов и гемопизированных
препаратов.
4. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
5. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
B. Интерпретация
1. Некоторые заболевания увеличивают восприимчивость пациента к токсичности
дигоксина. (4). К ним относятся:
(a) Гипокалиемия
(b) Гипотиреоэ
(c) Почечная недостаточность
(d) Прогрессирующая сердечная недостаточность
2. Некоторые исследования указывают на относительно высокий уровень дигоксина в
сыворотке младенцев. Однако у детей старше двух лет, принимающих дигоксин, его
концентрация в сыворотке близка ко взрослым показателям. (3).
3. Необходимо тщательное наблюдение за пациентами, одновременно
принимающими дигоксин и хинидин (5). Уровень дигоксина в сыворотке может
вырасти вдвое в течение 24 часов после первого приема хинидина и иногда остается
повышенным в течение нескольких дней.
4. У пациентов, принимающих диуретик фуросемид, показатели дигоксина в
сыворотке могут не соответствовать клинической картине (6). Рекомендуется
проводить мониторинг пациентов, принимающих одновременно препараты
фуросемида и дигиталиса (7).
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Нормальная концентрация при терапии дигоксином составляет 0.5-2.0 ng/ml.
Однако показатели у пациентов с признаками клинического токсикоза и без них могут
совпадать. Значительное количество пациентов с концентрацией выше 2.0 пд/гл1 не
имеет признаков токсикоза, и точно так же у многих пациентов с токсикозом уровень
дигоксина находится в пределах 1.4-2.0 ng/ml (8). Некоторым пациентам с
суправентрикулярными аритмиями требуются большие дозы дигоксина для
нормализации сердечной деятельности. У таких людей концентрация препарата
может составлять 2.0-4.0 ng/ml без клинических признаков токсикоза. Поэтому врач
при постановке диагноза должен учитывать результаты всех клинических и
лабораторных исследований.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
ПРОБА N X а C.V.
Низкий 12 0.66 0.05 7.6%
Средний 12 1.91 0.10 5.2%
Высокий 12 3.20 0.17 5.3%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. ■ng/ml)
ПРОБА N X О C.V.
Низкий 10 0.68 0.06 9.1%
Средний 10 1.83 0.12 6.6%
Высокий 10 3.15 0.20 6.5%
*данные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
О
--- стр. 27 ---
с п и с о к СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
2.
Doherty, J.E. and Kane, J.J: Clinical Phannacology of Digitalis Glycosides. ANN.
REV. MED,, 26: 159, (1975).
Butler, V.P.: Assays of Digitalis in blood. PROG. CARDOVASC. DIS., 14:571,
(1972).
Henry, J.B.: Therapeutic Drug Monitoring and Toxicology. CLINIAL DIGANOSIS and
MANAGEMENT,1:482, (1974).
Beller, G.A., et al., NEW. ENG. J. MED., 284, 989, (1979).
Swidler, G., HANDBOOK of DRUG INTERACTIONS, Wiley-Interscience, New York,
(1971), p. 253.
Duron, O., RADIOASSAY NEWS, 2, 35, (1975).
Swidler, G., HANDBOOK of drug interactions, Wiley- Interscience, New York,
(1979), p. 150.
Butler, V.P., and Lindinbaum, J.: Serum Digitalis Measurements in the Assessment
of Digitalis Resistence and Sensitivity. AM. J. MED., 58:460, (1975).
Редакция: 3.
Cat# 925-300.
Date: 12.04.04
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email:
info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.
--- стр. 31 ---
(см. раздел о подгот овке реагент ов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
14. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
15. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи
микропланшетного люменометра на 96 лунок (0.2-1.0 секунды на лунку). Измерение
должно проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроля в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации ферритина в препаратах используется
кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации ферритина в ng/ml.
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию ферритина, отложите среднее RLU
каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ng/ml) (можно
найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В
приведенном ниже примере, среднее RLU (32555) пересекает калибровочную кривую
при концентрации ферритина 202 ng/ml. (См. рисунок 1).
--- стр. 32 ---
ОБРАЗЕЦ 1
С О— й >
р 1ф
SО
-D
О< лSоэ
7 )Г*С
>
? S с ®-Г й »
5 ^
Оо„ 33 2 (Q Ф
— 0 3
о*3
Cal А
А1 406
413 0
В1 421
Cal В
С1 2744
2832 10
D1 2921
Cal С
Е1 12931 12664 50
F1 12397
Cal D
G1 25944
26384 150
Н1 26824
CalE
А2 53935
57086 400
В2 60238
CalF
С2 98907
99423 800
D2 99934
Control
Е2 3194
3269 16
F2 3344
Control
G2 30957
32255 202
Н2 33554
Sample
АЗ 11415
12010 40
ВЗ 12605
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
=100,000 RLU для калибратора ‘F’ (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
Рис. I
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение дпя иммунолюминометрических тестов, (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2: Monobind может оказать помощь в покупке и установке
оборудования/программ дпя расчета и интерпретации резупьтатов
иммунопюминометрического теста.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20%) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов. Пипетирование проб не должно занимать более
десяти (10) минут во избежание смещения результатов теста. При использовании
более одного (1) планшета, рекомендуется повторять построение кривой дозового
ответа.
2. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации ипи декантации
может привести к получению искаженных результатов.
3.. Не допускается испопьзование препаратов с сильной микробной контаминацией, с
повышенным содержанием липидов и гемолизированных препаратов.
4. Пробы пациентов с содержанием ферритина выше 800 ng/ml нужно разбавить
нормальной сывороткой (в соотношении, например, 1:10) и проанализировать
повторно. Чтобы получить корректное значение, умножьте результат повторного
анализа на коэффициент разбавления (100).
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
--- стр. 33 ---
в. Интерпретация
При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов теста,
требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в пределах
10% от соответствующих концентраций.
Ферритин в сыворотке содержит 20-25% железа: его концентрации является
хорошим индикатором запасов железа у здоровых людей и лациентов с дефицитом
железа. Уровень ферритина <10 лд/т1 обычно указывает на железодефицитную
анемию. Концентрация ферритина выше 250 ng/ml указывает на гемохроматоз,
вызванный определенными заболеваниями печени. Голодание, острая лейкемия,
воспалительные заболевания, регулярное употребление большого количества
алкоголя, и другие поражения печени вызывают повышение уровня ферритина в
плазме.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на двух различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
т т
ПРОБА N X О C.V.
Проба 1 20 37.4 1.54 4.1%
Проба 2 20 105.1 7.03 6.8%
Проба 3 20 343.0 8.06 2.3%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
ПРОБА N X < т C.V.
Проба 1 10 39.2 2.75 7.0%
Проба 2 10 116.2 9.41 8.2%
Проба 3 10 324.5 16.21 4.9%
•данные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах
дубликатов.
с использованием
В. Чувствительность
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией 0 ng/ml при использовании
статистики 2 SD для расчета минимальной дозы. 2 SD средней абсорбции 20
одинаковых нулевых калибраторов для процедуры CIA^” Ferritin Microplate Elisa дала
чувствительность, равную 1.0 ng/ml.
С. Специфичность
Перекрестная реактивность метода Femtin CIA™ на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
различных концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
ферритина, необходимых для получения одинаковой абсорбции.
Вещество Перекрестная
реактивность
Ферритин печени 100%
Ферритин селезенки 100%
Ферритин человеческого
сердца
<1.0%
Гемоглобин <0.1%
D. Ожидаемые значения
Приблизительные пределы нормальных показателей для взрослых мужчин и
женщин были определены после тестирования 400 препаратов сыворотки;
Мужчины’ 16-220 ng/ml
Женщины’ 10-124 ng/ml
(только для справки)
Каждой лаборатории рекомендуется найти собственный диапазон нормальных и
анормальных значений, поскольку они всегда зависят от популяции, диеты
пациентов, методов лаборатории и т.д.
E. Точность
Было проведено сравнение M onobind Ferritin Microplate CIA™ со стандартным
иммуноферментным тестом (Elisa) путем анализа препаратов с низкой, нормальной
и высокой концентрацией. Общее количество исследованных препаратов -202.
Уравнение регрессии методом наименьших квадратов и коэффициент корреляции
были рассчитаны для ферритина CIA по сравнению с обычным методом.
Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод Среднее (х)
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
Коэффициент
корреляции
Этот метод 56.2
у=-0.2028+0.989(х) 0.994Метод для
сравнения 55.3
--- стр. 34 ---
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(CIA™ Femtin) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
F. Сверхдозовый "хук"-эффект:
На точность теста не влияют концентрации ферритина до 10,000 ng/ml в сыворотке.
Однако пробы с предпопагаемым уровнем концентрации выше 800 ng/ml необходимо
растворять в нормальной смешанной человеческой сыворотке в соотношениях 1:10 и
1:00 для получения базового значения. При определении скорректированной
концентрации ферритина в лробе нужно учитывать базовое значение и коэффициент
разбавления.
СПИСОК справочной литературы
1. Beamish MR et al: “Transferrin iron, cheiatable iron and ferritin in idiopathic
hemochromatosis", Br. Jour. Haematology, 27:219 (1974).
2. Grace ND, Powel LW, "Iron storage disorders o f the liver” , Gastroenterology, 67:
1257.(1974).
3. Anonymous, "Adult screening for anem ia and hemoglobinopathies". Nurse Prac„
20:48-51 (1995).
4. Corti MC, Gaziano M., Hennekens CH, "Iron status and risk o f cardio-vascular
disease", Ann Epidemiol, 7;62-68, (1997).
5. Edwards CQ., Kushnar JP, "Screening for hemachromatosis", WEJM,32:1616-
19,1993.
6. Jonxix JHP, Visser ИКА," Determination o f low percentage o f fetal hem oglobin in the
blood o f norm al cft/ldren.” Am. J.Dis.Child.92:588-98 (1956).
7. Jouanolle AM, David V, LeGall JY, "Genetic Hem ochrom atosis."Ann Biol Clin
(Paris), 55:189-193. (1997).
8. Little D, “Hemochromatosis; Diagnosis and Management", Am Earn Physician,
53:2623-2658 (1996).
9. Morikawa K., Oseko F, Morikawa S, "A role for ferritin in hem opoiesis and the
immune system ", Leukemia Lymp/)oma,18:429-433(1995).
10. Naimark BJ., Reddy AE., Sawasky JA,’Serum Ferritin and Heart Disease: The effect
o f m oderate exercise on iron storage in postm enopausal women". Can J Cardiol,
12:1253-1257(1996).
11. Jandal JH, “Textbook o f Hem atology",' 2nd ed Philadelphia. Lippinscott-Raven Pub
(1996).
12. Lee GR, Ed, “Wintrobe’s Clinical Hematology”, Baltimore, Williams & Wilkins, 1996.
13.Steiene-Martin EA, Lotspeich-Steininger CA, Koepke JA, “Clinical Hematology:
Principles, Procedures, and Correlations.” 2nd ed. Lippinscott-Raven. Philadelphia,
1997.
14.Tietz N.: Textbook of Clinical Chemistry. Cart A Burtis.3rd ed. WB
Saunders.Philadelphia.1999.
Редакция: 1c.
Cat# 2875-300.
Date: 09.23.02
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email; info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.