Реагенты диагностические in vitro для цитометрических исследований, в наборах и отдельных упаковках — инструкция и характеристики

РУ: ФСЗ 2010/07428 от 19.07.2010 · класс риска 1

Производитель: Beckman Coulter, Inc. (Бекмен Культер, Инк.) (Соединенные Штаты)

Вид изделия: Подсчет клеток крови ИВД, контрольный материал · CD14 клеточный маркер ИВД, антитела · CD45 общий лейкоцитарный антиген клеточный маркер ИВД, антитела

Назначение: Реагенты in vitro диагностические и расходные материалы для цитометрических исследований» предназначены для использования с системами проточной цитометрии производства компании Beckman Coulter, Inc., а так же системами использующих аналогичный принцип измерений.

В госконтрактах 44-ФЗ: 134 контракта, медианная цена за единицу 54 148 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

«УТВЕРЖДАЮ»
Ге^ральны1у],иректор
Культер»
по
ИНСТРУКЦИЯ ПРИМЕНЕНИЮ
«Реагенты диагностические in vitro для цитометрических исследований»
производства Бекмен Культер, Hhk,(BECKMAN COULTER, INC.), США.
%
lOTest' Спецификации первого компонента Спецификации второго компонента
CD3-FITC I Специфичность CD3 HLA-DR
Клон UCHT1 Iminu357
HLA-DR-PE
Гибридома N31 хВа1Ь/с Р3-Х03-А9.а.653 X Ва1Ь/с
i каталожный HOMEPI A07737 Иммуноген Лимфоциты париферической крови Линия клеток, трансформиробанная
SO тестов; 1 мл вирусом Эпштейна-Барра
20 мкл / тест
Иммуноглобулин lg<3l IgGI
Вид животных Мышь Мышь
Источник Асциты Асциты
Способ очистки Аффинная хроматография с Аффинная хроматография с
' ItlTest иммо5ипизованным белком А иммобилизованным белком А
Коиъюгаты антител
Флуорохром Флуорвсциниэотиоцианат (FITC) Фикоэригрин R (РЕ)
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€ л возбуждения 4ВВ нм 4S8 нм
IN VITRO Пик эмиссии 625 нм 576 нм
Буфер PBS pH 7.2, БСА2 мг/мл, 0-1% NaNj
НАЗНАЧЕНИЕ 6. Растворы антител, содержащие азид натрия (NaNj), В этом случае следуйте указаниям руководства для
Данная смесь ((онъюгированных с фпуорохромами требукя осторо)№ого обращения. Не конкретного приложения
антител использувтоя для многопара метрового проглатывайте, (ufierame любого контакта с коцовй, При исследовании любого образца необходимо
анат^л лейкоцитов с помощью проточных слизистой оболочкой и тазами, Q кислой среде тяюив проанализировать контрольный образец
цитофлуориметрпв- Она позволяет обнаружить азид натрия способен образовывать взрывоопасную (исследуемый образец плюс изотипиче:кий
энспрессию антигенов СОа^и HLA-DR, азотисто-водородную кислоту. При утилизации контроль, кат. Ne AQ7794).
перед сливом в водопровод рекомендуется
1. Б пробирки для анализа клинических образцов
ПРИНЦИП АНАЛИЗА развести реагент большим объемом воды. Это
добавьте по 20 мкл конъюгатоэ антител, а в
Данный твсг основан на епосюбности специфических позволит избежать накопления азида натрия в
пробирки для анализа комтролей - по 20 мкл
моноклональных антител связываться с антигенными металлически* труОах и предотвратит образование
изотипического контроля,
детерминантами на ловврхности лейкоцитов. взрывчатого вещества.
2. В пробирки для анализа образца и для анализа
При инкубации образца с реагентом lOTest происходит 7. Все образцы крови следует рассматривать как изотипического контроля добавьте по 100 мкл
окрашивание лейкоцитов. Затем выполняется лизис потенциально инфицированные. При работе с
образца. Аккуратно перемешайте на вортексе.
эритроцитов. Иитактные лейкоциты анализируются ними необходима соблюдать все меры
ма проточном цитофлуориметра. предосторожности (в частности, использовать 3. Инкубируйте в течение 15 - 20 минут при
Протечный цитомотр измеряет светорассвяние и защитные перчатки, халат и очки). о ко т м с н в а е т т н а о г й к е т с е г м е, пературе (18-2S"C) в защищенного
флуорвсценцикз клеток. Он позволяет выделить 8. Никогда не отбирайте образец через пипетку
интересующую популяций на диаграмме, ртом. Избегайте контакта образца о кожей, 4. Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
отображающей светорассеяние в 5оковам слизистой оболочкой и глазами, следуя рекомендациям изготовителя
направлении (Side Scatter или 35) и сввтйрессеянив 9. После завершения работы пробирки с кровьиз и пизирующего реагента.
в прямом направлении под малыми углами (Forward все одноразовые материалы необходимо Например, при использовании реагента
Scatter или FS). Для выбора анализируемых поместить в специальные контейнеры для VersaLyse (кат. 1^ Д05777) следуйте указаниям
популяций можно мспопьзовать различные утилизации, инструкции к атому реагенту. Рекомендуется
двупараметровые диаграммы а швисимости от выполнить процедуру «с одновременной
используемого припожений. ОБРАЗЦЫ фиксацией». Для этого добавьте к образцу 1 мл
Прибор выполняет анализ флуоресценции Венозную кровь или образцы костного мозга свежеприготовленного расгаора для фиксации и
выбранной пог>уляции, распознавая окрашенные и необходимо отобрать в стерильные пробирки с солью лизиса. Немедленно перемешайте на вортексе в
неокрашенные клетки. Результат представляется а EDTA в качестве антикоагулянта. Использование течение 1 секунды, Инкубируйте Ю минут при
вше про14внтногй содержания положительных клеток других анликоагулянтов не рекомендуется. комнатной температуре в защищенном от свата
□т всех теток выбранной популяции. Образцы должны храниться при комнатной месте
температуре (18 - 25'С), Встряхивание образцов не Если образец не содержит эритроцитов,
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ допускается. Перед отбором аликвоты образец добарьте 2 мл PBS.
Анализ процентного содержания активированных Т- следует гомогенизировать, аккуратно перемешав. 5. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 150 х
лимфоцитов в периферической крови. Анализ образцов необходимо выполнить в течение g при комнатной температуре,
Антиген CD3 Экспрессируется только на клетках Т- 24 часов после отбора. 6. Удалите супернатант аспирацией,
линии. включающих зрелые Т-лимфациты и
7. Ресуспендируйте осадок клеток в 3 мп PBS.
субпопулнцию тимоцитов. В периферической крови МЕТОДИКА
8. Повторите шаг 5
около 76% лимфоцитов - CD3+. Это значение НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ
зависит от возраста, у детей младшего возраста оно МАТЕРИАЛЫ 9. Удалите супернатант аспирацией и
понижена (1). • Пробирки и материалы для отбора проб. ресуспендируйте клетки:
Антиген HLA-DR экспрессируется различными • Автоматические пипвтки с одноразовыми ~ 0.5 или 1 МП PBS с 0.1% раствором
клетками периферической крови, в частности, наконечниками на 20, 100 и 500 мкп. формальдегида, если лсдгатовленная проба будет
антиген-презентирующими. Однако его экспрессия Т- храниться от 2 до 24 часов, (Данный раствор
клетками варьирует и зависит от активации Т-клвто« • Пластиковые пробирки для гемолиза. гиожно получить разведением 12.5 мкп реагента
(1>. • Калибровочные частицы: флуоросферы Flow- lOTest 3 Fixative Soloiion (кат. № A073Q0) в 10-
Set™ (кат. № 6607007). кратной концентрации в 1 мп PBS ),
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ - 0,5 или 1 ГИЛ PBS без формальдегида, если
• Реагент дпя лизиса эритроцитов (с
До и после аскрытия флакона жидкие конъюгаты подготовленная проба будет проанализирована в
антител необходимо хранить при температуре 2 - лредусмгтгренной стадией отмывки после лизиса). течение 2 часов
Например: VersaLyse (кат, Ne А09777),
й°С в защищенном от света месте.
Стабипьность невскрытого реагента приводится на • Роагекг для фиксации лейкоцитов. Например: ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа подготовки,
дтикетке флакона. lOTest 3 Fixative SDlution (кат. Ns А07в00). подготовленные пробы необходимо хранить при
►9);а6ильность вскрытого реагента 90 дней. • Изотипический контроль: lOTest reagent. lgG1- температуре 2 - е“С в защищанном отсвета месте.
FITC/IgGI-РЕ (кат, Na Ай77Э4),
ВНИМАНИЕ
• Ёуфер (PBS: 0.01 М фосфат натрия; 0,145 М
1. Не используйте реагет с истекшим сроком
хлорид натрия; pH 7.2),
^тздности.
2 Не замораживайте реагент, • Центрифуга.
3. Перед испольэованиии необходимо уравновесить « Миксер (вортекс).
реагент при комнатой температуре (18-гв‘С). • Проточный цитофлуориметр.
4 Всздействие света необходимо свести к
]иинкмуму- ПОДГОТОВКА ПРОБ
Заиечдние: Приведенкая ниже процедура пригодна
5, Избегайте контаминации микроорганизмами, в
лротианом случае возможно получение дпя стандартных исследований. При выполнении
недостоверных резупьтатов. некоторых приложений Beckman Coulter объем
образца и/ипи реагента VersaLyse может отличаться
1/3 A07737EN_A2DD3-11-21
АС-03-1132
СПЁЧИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 2, Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов о
Количество Среднее CV отмывкой, поскольку данный реагент не
СПЕЦИФИЧНОСТЬ Лимфоциты образцов (%) SD (%) оптимизирован для процедуры без огмыаки
Моноклональные атигвла (шАт) UCHT1 реагируют е 3, Для получения точных и воспроизводимых
Е-цапью комплекса CD3 (2). В 1982 г. на Первом CD3+ 52 73.0 11.2 16 результатов необходимо соблюдать все
д м и в ф яа ф д е /н р а е р н о ц д и н р о о м в йчны р м а боче а м нт игйн с а о м в вща л н е и й и к оцито п в о CD3+HLA-DR+ 52 21 О 13.1 62 л п а ри й в о е р д а е тс н р н н ы о е й р и а н б с о тр ты ук . ции и следовать нормам
человека в Париже, франций, было лодтверждено,
4, Антитела данного реагента откалибраваны для
ч 3, т о S м ac Д t т io n U C I) H T (3 1 ). н а M гг A р T а в I л m а m ны u 3 п 5 р 7 о т р и а в с п C о D з 3 н а [ ю W т S 5 C Пи o т d о e п : ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ получения наилучшЕго соотношения
Щ-A'DR на мономорфном белке массой 29 - 33 i^a. ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ специфического и неспецифичесипго сигнала.
Поэтому в кахадом исследовании необходимо
В один день на одном цитоиетре определялось
строго дозировать учазанный объем реагента с
процентное содержание окрашенных попо>«лтельных
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ клеток (лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 учетом количества клеток в образце.
Для проверки линейности окрашивания данным раз. Полученные результаты суммированы в 5, При гилврлейкоцитоза разведите образец PBS
' (Кагентем были а различных лролорциях смешаны спедукицей таблице: так, чтобы получить примерную концентрацию
лейкоцитов 5 X 10%.
лолоокительные клетки линии HPBALL (CD3+HLA-0RT
и отрицательные клетки линии DAUDI (CD3"HLA’DR+). Положительные Количество среднее CV 6, При некоторых заболеваниях, таких нак тяжелая
Общее количество клеток в образце оставалось лимфоциты измерений (%) SD (%) почечная недостаточность или гемогловинопагии,
постоянным. Соотношение положительных и пизж: эритроцитов может происходить медленно,
отрицательных клеток изменялось от О до 100%. CD3+ 12 69.9 D.B 11 не полностью или совсем на лроисходить. В зтом
о А л л и и с к а в к о н т о ы й Вы вы ли ш о otp м a е w т B о H д i и K к ой в . с Н о а о тве о т с с н т о в в и а и н ии с CD3+HLA-DR+ 12 9,2 0.5 5 6 с в л ы у д ч е а л е и ть пе м р о е н д о нух о п к е р а а р ш н и ы в е а ни к е л м е тки р е в к ом гр е а н д д и у е е н тс те я
полученных и ожидаемых значений вычислялась плотности (например, фикола).
линейная регрессия. Урарненив рагрессии можно
использовать для йпраделения линейности и МеЖПАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
диапазона измерений для каждого маркера. РЕЗУЛЬТАТОВ В приложении приводится список литературы и
В один день на двух цитоиетрах двумя примеры диаграмм-
лаборантами определялось процентное
Маркер Линейная Линейность Диапазон
регрессия (R^) (%) содержание окрашенных клеток одной популяции ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
(лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 раз. Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS, EXPO,
CD3 Y = 0.9BX + 1.19 0.999 2-98 Полученные результаты суммированы в следующих Flow-Set, IMMUNO-TROL, lOTest, System II, XL
таблицах: ЯВПЙЮТСЯ зарегистрированными торговыми знаками
HLA-DR У = 0Э6Х + 0,в7 О.Э93 2-9S компании Beckman Coulter Inc
Цитонетр # 1
BD FACScan и BD LVSYS II являются
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ Положительные Количество Среднее CV зарегистрированными торговыми знаками компании
лимфоциты измерений (%) SD (%) BD Blosclances and Company.
Каждая лаборатория должна определить
собственные диапазоны нормальных значений на CD3T 12 69,Э 0,6 1.1
основании исследования образцов нормальны*
доноров местной популяции. При этом следует CD3+HLA-DR+ 12 а.2 0.5 56 ИЗГОТОВЛЕНО:
учитывать возраст, пол и этническую IMMUNOTECH S.A.
прииадпежность доноров, а также другие местные Цитометр # 2 a Beckman Coulter Company
особенности населения. 130 avenue de Lattre de Tasaigny
В наших лабораториях с использованием данного Положительные Количество Среднее CV B.P, 177 - 13276 Marseille Cedox Я
реагента было проведено исследование образцов лимфоциты измерений (%) SD (%) France
SO взрослых людей- В следующей таблице CD3+ 12 89,4 0,5 0.7 Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
лредсгавлвмы результаты подсчета положительных
со5ьпг1Й’. CD3+HLA-DRT 12 0.0 0.5 5,2 www.beckmancaulter.com
WBBXMAN
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ COUU№,
1. При неправильной настройке цитофлуориметра,
неверной компенсации флуоресценции и
неправильном расположении регионов могут
быть получены недостоверные результаты,
2/3 A07737EN_A 2003-11-21
AC-03-1132
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ N* А07737
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двупараметровыв диаграммы (Интенсивнасть флуоресценции 1. Harnet, I., ErkHller-Yuksel, F., Lydyard, P.. Deneys. V., ОвВгиуеге, M,, "De-
- Интенсивность флуоресценции), полученные лри анализе лизированногр velopmentai and maturatlonal changes in human blood lymphoeirte subpopula­
образца нормальной цепьной крови. Длв окрашивания использовались tions", 1992, Immunol. Today, 13, 215-218.
конъюгаты антител lOTest CD3-FITC / HUA-DR-PE (кат. № А07737). 2. Tunrtacliffe, A., Olsson, C., Traunecker. A., Krissansen, G.W.,
Выпапняпось выделение лимфоцитов программными срвдсграми. Для Karjajainen, K., De la Hera, A„ "The majority of CDS epitopes are conferred by
установки квадрантов использовался иютипичвский контроль lOTest lgG1- the s chain", 1989, Leucocyte Typing IV, \ЛЛ111е Celt Dilterentiation Antigens.
■ %ТС / IgGI-PE (кат. № А077Э4) (диаграмма не локазана)- W. Knapp, Bt al,, Eds,, Oxford University Press, 295-296.
Диаграмма 1. Считывани» и анализ данных выполнены с помощью 3. Berriard, A,, Brottier, P., Georget, E., Lepage, V., Boumsell, L,, "Joint report of
проточного цигофлуориметра COULTER EPICS* XL^" в программном the first intemalional workshop on human leucocyte differentiation antigens by
, о^спечении System II™. lha investigators of the participating laboratories", 1884, Leucocyte Typing I,
Bernard, A. et at,. Springer Veriag, 9-135,
LYMPHOCYTKS
Диаграмиа 2. Счетывамие данных выполнено с помощью проточного
цитофлуориметра BD FACSoan^". Для анализа использовалось программное
обеспечение LYSYS 11^».
гтмрнаатез
гШ
FL1-H\FLl41ni4hl—> CD3.I
3/3 A07737EN А 200^-11-21
АС-03-1132
lOTesf Спецификации первого компонента Спецификации второго компонента
CD45-FITC / Специфичность CD45 CD14
Клон Immul9.2 RM062
CD14-PE
Гибридома РЗ-ХеЗ-Ад.Е,653 х Balb/c ЗРг/О X Ва1Ь/с
I КАТАЛОЖНЫЙ номер!A0773S Иммуноген Клетки линии FU7.57, Изолированные моноциты человека
50 тестов; 1 мл трансформированные вирусом Эпияейнэ-
20 мкп / тест Барра
А Иммуноглобулин 19(31 lgG2a
Вид животных Мышь Мышь
Источник Асциты Аоциты
‘ i6t0si Способ очистки Хроматография Аффинная хроматография с
Конъюгаты антител иммобилизованным белком А
Флуорохром Флуоресцинизотиоциннат {FITC) Фикоэритрин R (РЕ)
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€
А возбуждения 483 нм 438 нм
IN VITRO
Пик эмиссии 526 им 575 нм
Буфер PBS pH 7.2, БСА2 мг/мл, 0.1% NaNj
НАЗНАЧЕНИЕ ВНИМАНИЕ • Цеитрифуга.
Данная смесь конъюгированных с флуорохромаии 1. Не используйте реагент с истекшим сроком • Миксер (вортекс)
антител используется для многопарамвтрового гадности.
• Проточный цитофлуориметр
анализа лейкоцитов с помощью прогточных 2. Не замораживайте реагент.
иитофлуориметров. Она позволяет обнаружить 3. Перед использованием необходимо уравновесить
экспресздю антигенов CD45 и СОИ. реагент при комнатной температуре (18~25‘C). ПОДГОТОВКА ПРОБ
Замечлниё; Приведенная нижа процедура пригодна
Д П а Р н И и Н ы Ц й И П А т Н ес А т Л ИЗА основан ма способности 4. м В и о н зд и е м й у с м т у в . ие света необходимо свести к д не л к я о т с о т р а ы н х д ар п т р н и ы л х о ж и е с н с и л й е до B в e а c н k и m й a . n Пр C и o u в l ы te п r о л о н б е ъ н е и м и
6. Избегайте контаминации микроорганизмами, в образца и/ипи реагента VersaLyse может
специфических моноклональны* антител
сврзываться с ангтигенными детерминантами на противном случае еозмолоно получение отличаться. В этом случав следуйте указаниям
недостоверных результатов. руховодства для конкретного приложения,
поверхности лейкоцитов.
л П в п ы е р р й о п и к и о о с л ц х и н о и я н д т е к ы и у т т б с я а ци о а и к л н р и а а з л о ш и и б с и з р в и а а р з н у ц э и ю а р е т и с т я р с о л ц е р и й е т к н о а о а в г ц е . и н т т о о в п И м . р н о т т а l о З O ю ч а T н т н e о е ы s м м е t В, я т с Р п р л р з а е и о с т б з г т и л у в н а с ю о а т т р т т о ы ы р й в и а а й й о н б т с т е и п о о , т о л с а с о т и л о о ч а , б р к б о о е с е й н о ж г а д н о й е о и б т р г р в о ж г а л л а з а ю щ о з в б и а ы о м е в г о и о а а б . з т р к и ь В а о д щ в т н з а « е р а м н к ы т и с г р в а л я и о о . я й о с п ( ш N а с с р в a н к е N з у д Н j й ю ) е е , , П т и (и а з р с о к и с ж т л и е е п и д и с у ч с п е е л р м о а о к д ы а и о н й й в а а л к н о и о и н з б и и т р р р а о о з л л в е ю ь а ц ) б т , ь о г п о л к к о з о н с б т р р а о с з о л ц о ь а т н в ы е н й г е т о ст б о в х б у о р ю д а щ и з м и е й ц о
цитофлуориметре. азотисто-водородную кислоту. При утилизации 1, В пробирки для анализа клинических образцов
Проточный питометр измеряет светорассеяние и перед сливом в водопровод рекомендуется добавьте по 20 мкл конъюгатов антител, а в
флувреоценцию клеток. Он позволяет выделить развести реагент большим объемом воды. Это пробирки для анализа контролей - нужнь]й объем
интересующую популяцию на диаграмме, позволит избежать накоплена азида натрия в двуцветного иэотипического контроля.
отображающей светорассеяние в боковом металлических трубах и прадотвратит образование 2 В пробирки для анализа образца и для анализа
направлении (Side Scatter или SS> и взрывчатого вещества. изотипического контроля добавьте по 100 мкл
светорассеяние в прямом направлении псй 7. Все образцы крови следует рассматривать как образца. Аккуратно перемешайте на вортексе.
малыми углами (Forward Scatter или FS). Для потенциально инфицированные. При работе с 3. Инкубируйте в течение 1S - 20 минут при
выбора аналиаируамых популяций можно ними необходимо соблюдать все меры комнатной температуре (1в-25"С) в защищенном
использовать различные двупаро метровые продосторожности (в частности, использовать от света месте.
диаграммы в зависимости от используемого защитнью перчатки, халат и очки). 4 Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
приложения. 8. Никогда не отбирайте образец через пипетку следуя рекомендациям изготоаитвля
Прибор еыполняет анализ флуоресценции ртом- Избегайте контакта образца с кожей, лизирующего реагента,
выбранной популяции, распознавая окрашенные и слизистой оболочкой и глазами Например, при использовании реагента VersaLyse
неокрашенные плетки. Результат представляется 9 После эввершения работы пробирки с кровь» и все (кат, Ns А09777) следуйте указаниям инструкции к
в виде процентного содержания положительных одноразовые материалы необходимо поместить в этому реагенту. Рекомендуется выполнить
клеток от вое» клеток выбранной популяции. специальные контейнеры для улллизации. процедуру «с одновременной фиксацией». Для
этого добавьте к образцу 1 мл
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ОБРАЗЦЫ СБвжеприготовленного раствора для фиксации и
Данная комбинация конъюгатов антител позволяет Венозную кровь или образцы костного мозга пизиса Немедпенно перемешайте на вортексе в
идентифицировать лейкоциты и лимфоциты и необходимо отобрать в стерильные пробирки с солью течение 1 секунды. Инкубируйте ю минут при
подсчитывать их копичество в образцах EDTA в качестве антикоагупянта. Использование комнатной температуре в защищенном от света
периферической крови, костного мозга и других антикоэгулянтов не рекомеидуетсв. месте.
бронхоальееолярного смыва. В ходе Обраацы должны храниться при комнатной Если образец не содержит эритроцитов, добавьте
исследования выполняется двойное окрашивание температуре (ta-25'C). Встряхивание образцов не 2 мл РВЗ.
CD46 / CD14, результаты представляются на допускается. Перед отбором аликвоты образец 5. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 15Q х
двулараметровых диаграммах (интенсивность следует гомогенизировать, аккуратно перемешав g при комнатной температуре.
флуоресценции 1 - интенсивность флуоресценции
Анализ образцов необходимо выполнить в течение 6. Удалите супернатант аспирацией
2), программным образом выполняется выделение
24 часов после отбора. 7. Ресуспендируйте осадок клеток в з мл PBS.
интересующей популяций. Теким образом удается
а. Повторите шаг 5.
отличить лимфоциты CD45** CD14" от монацитов
CD45’ CD14**, а также количественно определлть МЕТОДИКА Э. Удалите супернатант аспирацией и
примйси эритроцитов и частиц CD45" CD14' в НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ ресуспендируйте клетки:
популяции лимфоцитов (1). МАТЕРИАЛЫ - в 0.5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором
^оспедование маркеров CD4S / CD'14 помогает в • Пробирки и материалы для отбора проб формальдегида, если подготовленная проба будет
и^(внтификации аномалий субпопуляций • Автоматические пипетки с одноразовыми храниться от 2 до 24 часов. (Данный раствор
лейкоцитов при злокачественных заболеваниях наконечниками на 20, 10D и 5D0 мкл. можно получить разведением 12.6 мкп реагента
крови. • Пластиковые пробирки для гемолиза lOTeat 3 Fixative Solution (кат. № AQTSOD) в 10-
кратной концентрации в 1 мл PBS.)
• Калибровочные частицы: фпуоросферы Flow-
-К^АНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ - в 0.5 или 1 мл PBS без формальдегида, если
Set™ (кат, № 6607007).
Д6 и после вскрытия флакона жидкие конъюгаты подготовленная проба будет проанализирована в
аьгтител необходимо хранить при температуре 2 - • Реагент для лизиса аритроцитов (с течение 2 часов.
8°С в защищенном от света месте. предусмотренной стадией отмывки после лизиса),
Например: VersaLyse (кат, № А0Э777). ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа подготовки,
Стабильность невскрытого реагента приводится на
этикетке флакона • Реагент для фиксации лейкоцитов. Например: подготовленные пробы необходимо хранить при
lOTest 3 Fixative Solution (кат. Na AD7B0Q), температуре 2 - S'C в защищенном от света месте.
Стабильность вскрьпого реагента 90 дней.
• Изогтипический контроль: двуцветный реагент
IgGI-FITC/lgGZa-pe,
• Буфер (PBS: 0.D1 М фосфат натрия; 0.145 М
хлорид натрия; pH 7.2).
1/3 A07738EN_A 2003-11-26
АС-03-11 за
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
Количество Среднее CV 1. При неправильной настройке цитофлуариметра,
СПЕиИФИЧНОСТЬ
Ли1мфоциты образцов {%) SD (%) неверной компенсации флуоресценции и
Свмвйствй траисмвмбрамных гпикопротеииов неправильном рвсполояознии регионов могут
CD45, экспрессирующихся на поверхности всех CD45+ БО Э5.4 3 2 быть получены недостоверные результаты.
пЕйкоцитоа человека, не экспресеируетсн арелыми
2. Рекомендуется выполнять лизис гритроцитпв с
гритроцигтами Моноклональные антитела (мАт)
Количество Среднее CV отмывкой, поскольку данный реагент не
Immu10.2 реагируют со всеми изоформаыи CD45 (с
молекулярной массой 130-220 кДа). CD45 является Моноциты образцов (%) SD (%) оптимизирован для процедуры без отмывки
панлейкоцитарным маркером. В 199В г. на Шестом CD4S+ 50 95.9 4.0 3. Для лйлучения точных и воспроизводимы*
. ^вкдукародном рабочем совещании по результатов необходимо соблюдать все
дифференцировочным антигенам лейкоцитов CD14+ 50 91.0 6,3 приведенные инструкции и нормы лабораторной
человека в Кобе, Япония, было подтверздено, что работы.
мАт lmmu1B.2 иаправланы против CD45 (WS Cods: 4 Антитела данного реагента откалиброваны для
M-L103, Section Non-Lineage NL6) (2), CD14 Количество Среднее CV получения наилучшего соотношения
' *|бнаружи»аетсн на миелоплоноцитах и слабо Гранулоциты образцов (%) SD (%) специфического и неспецифического сигнала.
экспрессируется В-лимфоцитами, На Т- CD45+ 50 98 5 2.2 Поэтому в ка>вдом исследовании необходимо
лимфоцитах, еетвственных киллерах, эритроцитах и строго дозировать указанный объем реагента с
тромбоцитов он не экспрессируется (3, 4), В 1996 г. С014+ 50 98.S 2.2 учетом количестра клеток в образце.
на Шестом международном рабочем совещании по 5, При гиперпейкоцитозе разведите образец PES
диффервмцироаочным антигенам лейкоцитов так, чтобы получить примерную концентрацию
человека в Кобе, Япония, было подтверждено, что ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ лейкоцитов 5 X 10°/Л,
мАт RMQ52 направпвны прогтив CD14 (WS Code: ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ 6, При некоторых заболеваниях, таких как Гйжепав
IMA62, Section М) (5). В один день на одном цитометре определялось почечная недостаточность или
процентное содержание окрашенных гемоглобинопатии, ль^зис эритроцитов может
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ происходить медленно, не полностью или совсем
положительных клеток (CD45+ лимфоцитов и
Для проверки линейности окрашивания данным не происходить. Б этом случае перед
CD14+ моноцитов), Измерений выполнялось 12 раз.
реагентом были в различных пропорциях смешаны окрашиванием рекомендуется выделить
Полученные результаты суммированы а следующей
положительные активирозанныа клетки линии ТНР1 мононукпварные клетки в градиенте плотности
таблице.'
и отрицательные клетки пинии FRN 17,4,14.33. (например, фикола)
Общее количество клеток в образце оставалось 7, Были описаны случаи острого лимфобластного
постоянным. Соотношение положительных и Попожитепьные Количество Среднее CV лейхоэа с отрицательной и слабоположительной
отрицательных кяеток игмвнялось от О до 1 Dfl%, клетки измерений (%) SD (%) реакцией по CD4S 6 »тих случаях
Аликвоты быпи окрашены в соответствии с Лимфоциты 12 97.9 0,36 0.4 лимфоцитарное происхо>едение бластных клеток
описанной выше мегодикой. На основании CD45* следует подтвердить другими маркерами.
полученных и ожидаемых значений вычислялась
линейчая регрессия. Уравнение регрессии можно Моноциты 12 97,7 0.38 0,4 ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
использовать для определения линейности и CD14T 8 приложении приводится список литературы и
диапазона измерений для какого маркера. примеры диаграмм,
Маркер Линейная Линейность Диапазон МЕЖЛАЕОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
регрессия (R=) (%) РЕЗУЛЬТАТОВ Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS, EXPO,
В один дань на двух цитометрах двумя Flow-Set, IMMUNO-TROL, IQTeat, System II, XL
CD45 У = 1,00 X+ 0.60 0,999 1 -99 лаборантами определялась процентное являются зарегистрированными торговыми знаками
содержание окрашенных клеток одной популяции компании Beckman Coulter Inc,
CD14 Y= 1.00Х + 0.31 0.999 1-99
(CD45+ лимфоцитов и CD14+ моночитов),
Измерение выполнялось 12 раз. Полученные BD FACScan и BO LYSYS II являются
зарегистрированными торговыми знаками компании
результаты суммированы в следующих таблицах:
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ BD Biosciences and Company
Каадая лаборатория должна определить Цитометр # 1
собственные диапазоны нормальных значений на
ИЗГОТОВЛЕНО;
основании исследования образцов нормальных Положительные Количество Среднее CV
доноров местной популяции. При этом следует клетки измерений (%} SD (%> IMMUNOTECH S.A.
учитывать возраст, пол и этническую a Beckman Coulter Company
принадлежность доноров, а таюке другие местные Лимфоциты 12 97.9 0,36 0.4 130 avenuedeLattredeTa»signy
псобенности населения CD45+ B.P. 177 - 13276 Marseille Cedex в
France
6 наших лабораториях с использованием данного Моно1|иты 12 97.7 ОЗВ 0.4
реагента было проведено исследование образцов CD14+ Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
50 взрослых людей. В следующих таблицах
представлены результаты подсчета положительных www,beckmancaulter.com
событий; Цитометр й 2
Положительные Количество Среднее CV
клетки измерении (%) SD (%)
Лимфоциты 12 Э8.4 0.45 0.5
CD45T
Моноциты 12 96.2 0,9Й 1.0
CD14+
2/3 AD7733EN_A 2003-11-26
AC-03-1136
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № А07734
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показамь! двупараметровые диаграммы (интенсивнастъ флуоресненции 1. Nicholson, J K.A., Hearn, T.L, Cross, G.D., White, M.D., "1997 revised guide­
- интенсивнасгь флуоресценции), полученные при анализе лизированного lines for performing CD4+ T-cell determlnationB m persons Infected with hu­
образца нормальной цельной крови. Для окрашивания использовались man Immunodeficiency virus (HIV)", 1997, MMWR 46, RR-31-29.
конъюгаты антител lOTest CD45-FITC / CDH-PE (иат. Ns А07738). На 2. Sewell, W,A., Cooley, M.A., Kate, K.S,, "CD45 Workshop panel report', 1997.
диаграмшх показана вся популяция лейкоцитов. Leucocyte Typing VI, 'Miite Cell Differentiation Antigens, Kishlmato, T,, et al,
Eds,. Garland Publishing, Inc., 499-S02,
Диаграмма 1 Считывание и анализ данных выполнены с помощью
проточного цитофлуариметра COULTER* EPICS® XL^'' в программном 3. Todd III, Nadler, L.M., Schlossman, S,F., "Antigens on human monocytes
обеспечении System II™. identified by monoclonal antibodies", 19B1. J. immunol.. 4.126, 1435-1442.
4. Todd, R,f^,, van Agthoven, A„ Schlossmann, S.F.. Terhorst. C. "Structural
analysis of differentiation antigens Mol and Mo2on human monocytes", 1982,
LEUCOCYTES Hybrldoma, 3,1, 329-337.
1 5. Goyert, S.M., Coheei, L., Gangloff, S.C., Ashmun, R., Haeffner-Cavaillon, N..
"CD14 Workshop panel report", 1Э97, Leucocyte Typing VI, White Cell Differ­
entiation Antigens. Kishimoto, Т., et al, Eds,, Garland Publishing. Inc,, 963-
ЭБ5,
Ы -
Ш
Ь .
S
М ■
' '......
'■S
■'V-'.
. 1 IB IBB taee
CB45-FITC
Диаграмма 2, Счит1?1ван1пе данных выполнено с помощью проточного
цитофлуориметра BD FACScan^“, Для анализа использовалось программное
оеаспечение LYSYS II™,
■Ц|' .........1tl
FLI Hl(=L1-Hei9til-> CP4i-FITC
3/3 AQ773BEN^A 2003-11-26
АС-03-1136
Моноклональное антитело CD95-PE
IM1739 - 50 тестов - Жидкий - 1 мл - Клон UB2
Только для исследований. Не предназначен для диагностики,
СПЕЦИФИЧНОСТЬ избежать накопления азида натрия в 4. Yonehara, S., Nishimura, Y., Kishil, S.,
CD95 (Fas или АРО-1) металлических трубах и предотвратить Yonehara, M„ Takazawa, K., Tamatani, Т.,
трансмембранный гликопротеин с образование взрывчатых веществ. При Ishii, A-. '‘Involvement of apoptosis antigen
молекулярной массой 40-50 кОа, попадании реагентов в глаза или на кожу, Fas in clonal deletion of human thymocytes",
принадлежащий к суперсемейству смойте большим количеством воды. 1994, Int. Immunol., 6, 1S49-1366.
рецепторов факторов роста нервной 2. Все образцы и контактирующие с ними
ткани/рецепторОЁ фактора нектора материалы следует рассматривать как ЗАКАЗ РЕАГЕНТА
огухоли (NGFR/TNF). Этот антиген потенциально инфицированные. При Конъюгат моноклональных антител С095-
содержит 3 постора, обогащенных работе с ними и утилизации необходимо РЕ
цистеином. CD95 опосредует запуск соблюдать все надлежащие меры KaiNs IМ1739-50 tests-1 мл
апоптоза клетки (1). предосторожности.
CD95 экспрессируется на значительной 3. Никогда не отбирайте образец через За дополнительной информацией
части периферических CD4+, CD8+ и В- пипетку ртом. Избегайте контакта образца обращайтесь к региональному
клетках и на небольшом количестве NK- с кожей и слизистыми оболочками. предствителю Beckman Coulter
клеток. Этот антиген также встречается на 4. Не используйте реагент после Тел. в США: 800-526-7694.
гранулоцитаж и моноцитах (2). истечения срока годности, указанного на www.beckmancoulter.com
Экспрессия CD95 значительно этикетке флакона.
увеличивается на активированных Т-. В, 5. При хранении и инкубации реагента ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
NK- клетках и тимоцитах (3,4). воздействие света должно быть сведено к Beckman Coulteir и логотип Beckman
Молекулярная масса распознаваемого минимуму. Coulter являются торговыми знаками
антигена 48 кОа. 6. Избегайте контаминации реагента компании Beckman Coulter, inc.
Данные антитела специфически микроорганизмами, в противном случае РЕ защищен патентам 4,520,110
распознают Fas антиген человека и не возможно получение недостоверных
реагируют с Fas антигеном мыши. результатов. Изготовлено для::
7. При работе с этим реагентом следует Immunotech, а Beckman Coulter Company
РЁАГЕНТ соблюдать требования GLP (Good 130, avenue de Lattre de Tassigny, BP. 177
Конъюгат моноклональных антител Laboratory Practice). 13276 Marseille Cedex 9, France
CD95-PE
KarNS 1М1739 ” 50 тестов- 1 мл ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
При температуре хранения 2-е“С реагент ©2005 Beckman Coulter, inc.
КЛОН UB2 в нераспечатанном флаконе стабилен в Bee права защищены.
течение срока годности, указанного на
ЦЕПЬ IgG lgG1 этикетке
флакона. Не замораживать. Воздействие
ИММУНОГЕ Рекомбинантный Fas
света свести к минимуму.
Н человека
ГИБРИДОМ NS1 X Mouse (Balb/c) ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТА
А BEO<M AN
Подготовка не требуется. Используйте
ВИД Мышь COULTER.
реагент непосредственно из флакона.
Перед использованием доведите реагент
ИСТОЧНИК Асцитная жидкость
до комнатной температуры.
ОЧИСТКА Преципитация с аммония
сульфатом и аффинная ПРОЦЕДУРА
хроматография с белком А Проточная цитофлуори«етрия:
КОНЪЮГАТ R-Фикоэритрин (РЕ): 0,5-1,5 20 мкл на 5x1 o'" клеток или 20 мкл на тест,
моль РЕ на 1 моль 1д СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Л возбуждения: 48В нм 1. Itoh, N.. Yonehara, S., Ishii, A. Yonetiara,
Мах Л эмиссии : 575 нм М.. Mizushima, S.I., Sameshima, М., Hase,
Основной цвет эмиссии: оранжево­ A., Seto, Y. Nagata, S., The polypeptide
красный encoded by the cDNA for human ceil surface
БУФЕР 1 мг/мл бычьего antigen Fas can mediate apoptosis". 1991,
сывороточного альбумина Ceii, 66, 233-243.
в фосфатно-солевом 2. Miyawaki, T,, Uehara,T., Nibu, R., Tsuji,
буфере, содержащем 0,1% Т., Yaciiie, A., Yonehara, S., Taniguchi, N.,
азида натрия “Differential expression of apoptosis-reialed
^ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ Fas antigen on lymphocyte subpopulalions in
1, Данный реагент содержит 0.1% азиhдu man peripheral blood", 1992, J, Immunol.,
натрия. В кислой среде азид натрия 149, 3753-3756,
образует азотисто-водородную кислоту, 3. Yoshino, T,, Kondo, E., Cao, L,
$ являющуюся чрезвычайно токсичным Tal<ahashi, K., IHayashi, K., Nomura, S.,
соединением. При утилизации соединений Akagi, T,, "Inverse expression of bcl-2
азидэ рекомендуется смывать их в protein and Fas antigen in lymphoblasts in
водопроводно-канализационную систему peripheral lymph nodes and activated
большим количеством проточной воды, peripheral blood T and В lymphocytes",
Эти меры предосторожности позволят 1994, Blood, 83, 1856-1B61.
1/1 1М173ЭЕХ С 2006-01-05
lOTest® IgGI (Mouse)-PE
Каталожный номер IM0670U, 2 мл раствора, 20 мкл/тест*, клон 679.1 Мс7
Реагент для оценки неспецифического связывания
Аналитические и технические характеристики не устанорлоны.
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ПРИЗНАКИ НЕПРИГОДНОСТИ РЕАГЕНТА
1. Данный реагент содержит 0.1% азид натрия, В Изменение физического состояния данного
Мышиные нонотональные антитела 679,1 Мс7 не
кислой среде азид натрия образует азотисто- реагента, содержащего флуорохром РЕ
имеют высокой специфичнскти, Их можно
водородную кислоту, являющуюся чрезвычайно (изменение цвета до светло-розового) или
•'использовать в качвсгье наспецифтвского
токсичным соединением. При утилиаации значительные вариации значений конгролей могут
средства, позволяющего выполнить
соединений азида ракамендуется смывать их в свидетельствовать о непригодности реагента. Такой
иммунолагичвское окрашивание гемопоэтичвских
водолроводно-канапизацианную систему реагент использовать на рекомендуется
клеток и тром6оц1гтов (1).
Большим количеством проточной воды. Эти
Конъюгаты манакпонапьных анттел 67в,1Мс7 с меры лредосторожнооти позволят избежать ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТА
к ф с с п л т о л м р е в / / т е о о к о р н р т к х о у о . н р к х л о н р с о ы о т н м е н а о ы л х м ь м а н р ы Р а м к С т и 5 е а р н а и и т н м с и т т е г и и е ю т к н е т и а л м а о ( м и п з и р о , е т д и с г е п п е л , е м е ц о ф н и л н л ф о ы у з и о е т ч р и н о ч о ы х е б р м с щ о к и и м и е х ) к т г в н в л р о з а а д р у к з б ы ы о а п а . в л * ч и е а л н и т и ы н я х и а в к е а й щ з ж и е у д п , с р а т с е в м д . о н о П й а т р т т в е р и р и а б п я т о о и л п т ь а ь в ш д а и н м м и е о и к т о б а р л р л е и а л а ч з и г о е ч е в с е н а т с т в н к а о и и м е в х д ф н П м о е о о л с о д н а т б г о к и о х к о г т о л н н о д о е е в и н . т к м а а к л о о ь м д П н н н о ы е е ж а р е т д е н а т д о р т а й е ь н б с т ( я у 1 и и е , В т с т п е - с п о л я о 2 к а . л 3 а ь ‘ т С з н И е о ) е м . с в п п п а о о е н с л р и р ь е а е з т м у д у й с р т т а е в е р р н е е д н а а а о г г н е е н н н ы т т в а а о е
2. Не используйте антитела после истечения срока
РЕАГЕНТ
падности, указанного на этикетке флакона, список ЛИТЕРАТУРЫ
Квнъюгаты антител ГОТея IgGI (Mouse)-PE 3. Йсе образцы и контактирующие с ними 1, Stewart, С.С., Stewart, S.J., "Cell preparation for
Каталожный номер IM0670U - 2 мл, раствор, 20 нкл / материалы следует рассматривать как ttie identification of leukocytes", 19S4, IWetftods
тестт* потенциально инфкцироеатые. При работе с Cell Biol,, Chaps, 41, 39-eO.
ними и утилизации необходимо соблюдать все
Кпон 679.1 Мс7 надлежащие uepbj предостаражности
ЗАКАЗ РЕАГЕНТА
Цепь 1д МмшиныИ 1дй1 4. Никогда не йтбир^ита образец через пипетку
Иммуноген Небиологический гагттен ртом. Избегайте дантакта образца с кожей и
Конъюгаты антител lOTtst I9GI (Moiise)-PE
слизистыми оболочками. KaтaлQжньiй номер IMDe70U - 2 мл, раствор, 20 мкл /
Гибридома Миеломные клетки линии ХЕЗ тест*.
5. При хранений и инкубации реагента воздействие
Ад.Б X Клетки селаавнки света должно быть сведено к минимуму.
ЛИНИИ Вв1Ыс Флуорохром РЁ защищен патентом 4,520,110,
В, Избегайте контаминации реагента
Источник Асцитная жидкость
микроорганизмами, в противном случае За дополнительной информацией в США
Метод очистки Ионообменная ига аффинная возможно получение недостоверных обращайтесь по телефону 800-526-7694.
хроматография результатов.
За пределами CllJA СБЯжитесь с вашим
Конъюгат Конъюгация с 7- При работе с этим реагентом следует соблюдать представителен компании Beckman Coulter.
фикоэритрином-R (РЕ) в требования GLP (Good Laboratory Praclice).
соотношении 0.S -1.5 моль РЕ
urww.becKmancoulter.com
на 1 моль |д. ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
Флуоресценция РЕ (оранжево-краснопэ цвета) Данный реагент стабилен в течение срока годности ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
Возбуждение 486 “ S80 нм при температуре хранения 2 - S°C. Не Логотип Beckman Coulter и lOlcsi является
Эмиссия 36Я - 590 нм замораживать. Воздействие свата свести к торговыми знаками компании Seckman Coulter fnc.
минимуму.
СОСТАВ РЕАГЕНТА Изготовлено:
Кроме антител в состав реагента входят Immunotech, а Beckman Coulter Company 130,
фосфатный буфор, 0.1% азид натрия (NaNj), avenue de Latire de Tassigny, B.P. 177 13276
использую11|ийся в качестве консерванта, и бычий Marseille Cedex 9, France
сывороточный альбумин (ЬСА) в концентрации 2.0
мгУмл. СорулдМ^® Beckman Coulter, Ine, 2006
Все права защищены.
(*); 20 мкл - этого обьема достаточно для окрашивания 5x10^ клеток
при выполнении стандартного иммунофлуоресцентного енализа
Страница 1 из 1 I-IMD670U 2006-06-29
BECKMAN
COULTER.
lOTest® CD45RA-FITC / CD4-PE
Каталожный номер IM2762 - 50 тестов ~ жидкий реагент 20 мкл/тест
Только для исследовательских целей. Не для диагностики.
РЕАГЕНТ
Конъюгаты антител lOTest CD45RA-FITC ICD4-PE
Т^йталожный номер 1М2762 - 50 тестов - жидкий реагент - 20 мкл ! тест.
Антитела 1 Антитела 2
^Опацифичность CD45RA CD4
Клон ALB11 13ВВ.2
Гибридома Клетки селезенки NS1 х Ва1Ь/с Клетки селезенки NS1 х Baih/c
1Лммуноген Т-кпетки человека, страдающего острым лимфобластньш Тимоциты человека
лейкозом
Цепь иммуноглобулина IgGI igGl
Вид животных Мышь Мышь
Источник Асцитная жидкость Аоцитнач жидкость
Способ очистки Ионообменная или аффинная хроматография Ионообменная или аффинная хроматография
Конъюгат FITC (Флуоресцеиниэотиоцианат) РЕ (Фикозритрин R)
Молярное соотношениэ FITCMgG:3-6 PE/I36: 0 5-1.5
Л возбуждения 408 нм 4S8 нм
Л эмиссии 525 им 575 нм
Буфер Бычий сывороточный альбумин в концентрации 2 мг/мл в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0.1% азид натрия
СПЕЦИФИЧНОСТЬ Субпопуляция CD4+/CD45RA+ играет глав­ ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
ную роль в обеспечении иммунного гомео­ Данный реагент стабилен в течение срока
CD4
стаза {отвечает за аутоиммунитет, отторже­ годности при температуре хранения 2-8‘С,
Молекулярная масса антигена CD4 59 кДа.
ние трансплантанта). Не замораживать.
Антиген CD4 обнаруживается в субпопуля­
ции клеток периферической крови, вклю­
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТА
чающей клетки-хелперы/индукторы. Также
он присутстеует на 75% тимоцитов (1) и в 1. Данный реагент содержит 0.1% азид Данный реагент предназначен для анализа
меньших количествах на моноцитах и мак- натрия. В кислой среде азид натрия об­ методом проточной цитометрии.
рофагах- разует азотисто-водородную кислоту, Объем для одного теста: 20 мкл на 5 х 10®
являющуюся чрезвычайно токсичным клеток или на 100 мкл цельной крови.
Субпопулйция CD4+ Т-клеток вовлечена во
соединением. При утилизации соедине­
взаимодействие Т-клеток между собой,
Т-клеток с В-клетками и Т-клеток с макрофа­ ний азида рекомендуется смывать их в ПРИМЕР
водопроводно-канализационную систему
гами, Было высказано предположение, что Ниже показана двупараметровая диаграмма
большим количеством проточной воды.
антиген CD4 взаимодействует с антигенами {интенсивность флуоресценции - интенсиа-
Эти меры предосторожности позволят
II класса. ность флуоресценции), полученная при ана­
избежать накопления азида натрия в мё'
Антиген CD4 являются частью рецептора талпически* трубах и предотвратить об­ лизе лизированного образца нормальной
ВИЧ наТ-клетках. разование взрывчатых веществ. При по­ цельной крови. Для окрашивания использо­
вался двуцветный реагент CD45RA-FITC /
падании реагента в глаза или на кожу,
CD45RA смойте большим количеством воды. CD4-PE (номер для заказа реагента см. в
Молекулярный вес антигена CD45RA 220 кДа. каталоге). Выполнялось гейтирование лим­
2. Все образцы и контактирующие с ними
Данный антиген присутствует в субпопуляции материалы следует рассматривать как фоцитов. Квадрантный регион был установ­
Т-клеток, на В-клетках и на моноцитах. Сла­ потенциально инфицированные. При ра­ лен с помощью изотипического контроля
бая реакция наблюдается на гранулоцитах. боте с ними и их утилизации необходимо (номер для заказа контроля см. в каталоге).
CD45RA это экспрессирующийся на опреде­ соблюдать все надлежащие меры пре­ "Верхний левый квадрант (1) содержит
ленных клетках вариант CD45 (общего лей­ досторожности. С045КА-огрицательные, С04-положитель^
коцитарного антигена), 3. Никогда не отбирайте образец через ные Т-лимфоциты.
пипетку ртом. Избегайте контакта образ­ "Верхний правый квадрант (2) содержит
СОСТАВ РЕАГЕНТА ца с кожей и слизистыми оболочками. СР4-положительные и CD45RA-nono-
Данные антитела поставляются в фосфатно- 4. Не используйте реагент после истечения жительные неа1стивированныв Т-хелперы.
солевом буфере, содержащем 0.1% азид срока годности, указанного на этикетке •Нижний левый квадрант (3) содержит CD4-
натрия и бычий сывороточный альбумин в флакона. отрицательные и С045НА-отрицательные
концентрации 2 мг/мл. 5. При хранении и инкубации реагента сле­ события.
дите за тем, чтобы он не подвергался ’Нижний правый квадрант (4) содержит
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ воздействию яркого света, С045КА-положительные и CD4-
Проточная цитометрия. 6. Избегайте контаминации реагента мик­ отрицательные лимфоциты.
(^опуляция CD4+ Т-клеток может быть раз­ роорганизмами, в противном случае
возможно получение недостоверных ре­ Считывание данных выполнено с помощью
делена, по меньшей мере, на дее субпопу­
ляции клеток: CD4+/CD45RA- Т-кпетки, со­ зультатов, проточного цитофлуориметра COULTER®
EPICS® XL™.
стоящие из клеток-хелперов/индукторов, и 7. При работе с этим реагентом следует
Анализ данных выполнен с помощью про­
CD4+/CD45RA+ Т-кпетки, состоящие ИЗ соблюдать требования GLP (Good Labo­
точного цитофлуориметра XL е программ­
Т-клеток супрессоров/индукторов. Данный ratory Practice - Надлежащая лаборатор­
ном обеспечении SYSTEM II™
двухцветный набор флуоресцирующих анти­ ная практика).
тел используется для изучения субпопуля-
ций CD4+/CD45RA+ и CD4+/CD46RA- Т-клеток
периферической крови.
Страница 1 из 2 IM2762 2008-09-05
BECKMAN
COULTER^
lOTest® CD45RA-FITC I CD4-PE
Каталожный номер IM2762 - 50 тестов - жидкий реагент - 20 мкл/тест
LVnPHOCY'TES СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 3a дополнительной информацией в США
1. Reinherz. E.L, Schlossman, S.F.. "The обращайтесь по телефону 800-526-7694
drfferentlation and function of human T lym­ За пределами США свяжитесь с вашим
phocytes". 1980. Cell, 19, 821-827. представителем компании Beckman Coulter.
ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ www.beckmancoutter.com
Логотип компании BecKman Coulter, з также Распечатано в России.
названия COULTER, lOTest, COULTER EPICS Изготовлено во Франции,
XL и XL SYSTEM II являются зарегистрирован­
ными торговыми знаками компании Beckman
Ф2008 Beckman Coulter, Inc.
Coulter Inc.
Авторские права защищены.
ИЗГОТОВЛЕНО:
IMMUNOTECH SAS,
a Beckman Coulter Connpany
130, avenue de Lattre de Tassigny
B.P. 177 13276 Marseille Cedex 9
France
Страница 2 из 2 !M270Z 2008-09-05
BECKMAN
COULTER
lOTDSt* Спецификаций первого компонента Спецификации второго компонента
CD3-FITC I специфичность CD3 CD19
CD19-PE КлОМ UCHT1 J-t 119
Гибридокла NS1 X Ва1Ь/с NS1 X Ва1ЬУс
I каталожный номер ) A07736 Иммуноген Лимфоциты периферической крови Клетки лимфомы SKLY13
50 тестов, 1 МП
Иммуноглобулин lgG1 igG1
20 мкл I тест
Вид животных Мышь Мышь
Источник Асциты Асциты
Способ очистки Аффинная хроматография с Аффинная хроматография с
иммобилизованным белком А иммобилизованным белком А
lOTost
Конъюгаты антител Флуорохром Флуоресцинизотиоцианат (FITC) ФикЕэритрин R <РЕ)
л возбуждения 4S6 нм 488 нм
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€ Пик эмиссии 525 нм 575 нм
IN VITRO
Буфер PBS pH 7.2. БСА 2 мг/мл. 0.1% NaNj
НАЗНАЧЕНИЕ ВНИМАНИЕ • Прогточный цитофлуориметр.
Данная смесь конъюгированных е флуорохромами 1. Не используйте реагент с истекшим сроком
антител используется для многйпэр^метро&ого пздности. ПОДГОТОВКА ПРОБ
анализа пейкоцитов с помощью протоиных 2. Не замораживайте реагент. Замечание: Приведенная ниже процедура пригодна
цитофлуоримвтрав. Ома позволяет обнаружить 3. Перед использованием необходимо для стандартных исследований. При выполнении
экспрессию антигенов CD3 и CD19. уравновесить реагент при комнатной некоторых приложений Beckman Coulter объем
температуре (18-25'С). образца и/или реагента VersaLyse может отличаться,
ПРИНЦИП АНАЛИЗА 4. Воздействие света необходимо свести к В этом случав следуйте указаниям руководства для
Данный тест основан нв способности минимуму, конкретного приложения,
специфических моноклйн^ьных антител 5. Избегайте юнтаминации микроорганизмами, в При исследоевнии любого образца необходимо
связываться с антигенными детариинактами на противном случае возможно получение также проанализировать контрольный образец
поверхности пвйквцитов. нздостоверных результатов. (исследуемый образец плкк изотипичвский
При инкуБацик< абразца с реагентом lOTest 6. Растворы антител, ссдержвщие азид натрия (NaNj). контроль, кат. Ns А07794).
происходит окрашивание лвйкицитов. Затем требуют осторожного обращения. Нв
1. Б пробирки для анализа клинических образцов
выпопмявтся лизис эритроцитов. |<1нтакгныв лроглатывайте. избегайте любого контакта о кожей,
добавьте по 20 мкп конъюгатов антител, а в
пейкоцитм анапиэируготся на проточном слизистой оболочкой и глазами В кислой среде
пробирки для анализа контролей - по 20 мкп
цитофлуориметре. азид натрия способен образовывать
Проточный цитометр измеряет светорассеяние и взрывоопасную азотисто-водородную кислоту. При изотипического контроля.
флуоресценцию клеток- Он позвопяйт выделить утилизации перед сливом в водопровод 2. В пробирки для анализа образца и для анализа
интересующую популяцию на диаграмме, рекомендуется развести реагент большим объемом изотипического контроля добавьте по 100 Мкп
отебрЕпкающей светорассеяние в баковом воды. Это позволит избежать накоплении азида образца. Аккуратно перемешайте на вортексв,
направлении (Side Scatter или SS) и светорассеяние натрия в металлических трубах к предотвратит 3. Инкубируйте в течение 15 - го минут при
в прямом направлении под малыми углами (Forward образование взрывчатого вещества. комнатной температуре (18-2S'C) е защищенном
Scatter или FS}, Для выбора анализируймык 7. Все образцы крови следует рассматривать как от света месте,
популяций можно использовать различные потенциально инфицированные. При работе с 4. Если требуется, выполните лизис эритроцитов.
друпараметроеые диафаммы в зависимости от ними необходимо соблюдать все меры Следуя рекомендациям изготовителя
используемого приложения. предосторожносгти (в частности, использовать лизиру|01двго реагента.
Прибор выполняет анализ флуоресценции защитные перчатки, халат и очки). Например, при использовании реагента VersaLyse
выбранной популяции, распознавая окрашенные и S. Никогда не отбирайте образец через пипетку ртом. (кат, NS А09777) следуйте указаниям инструкции К
неокрашенные клетки. Результат представляется в Избегайте контакта образца с кожей, слизистой этому реагенту. Рекомендуется выполнить
виде процентного содержания положительных клеток оболочкой и тазами. процедуру «с одновременной фиксацией». Для
9. После завершения работы пробирш с кровью и все этого добавьте е образец 1 мл
от всех клеток выбранной популяции.
адноразовые мвгтериалы необходимо поместить в свежеприштовлекного раствора для фиксации и
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ специальные контейнеры для утилизации. пизиса. Немедленно перемешайте на вортексе в
Анализ количестаенного соотношения Т- и В- течение 1 секунды. Инкубируйте 10 минут при
ОБРАЗЦЫ комнатной температуре в защищенном от света
лимфоцитов,
^нозную кровь или образць! кйсгного мозга месте.
Антиген CD3 зкспрессируетсн только на клетках Т-
необхсдимо отобрать в стерильные пробирки с солью Ёсли образец не содержит эритроцитов, добавьте 2
ллкии, включающих зрелые Т-лимфоциты и
субпопупчцию тимоцитов. В периферической крови EDTA в качестве ангикоагупянта. Использование МП PBS,
других антикоагулянтов не рекомендуется. 5. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 150 х
около 75% пимфоцитоа - С03+. Это значение
Образцы должны храниться при комнатной g при комнатной температуре,
зависит or возраста, у детей младшего возраста
температуре (18 2В°С). йстряхивание образцов не 6. Удалите супернатант аспирацией.
онс понижено (1).
допускается. Перед отбором аликвоты образец 7. Ресуспендируйте осадок клеток е 3 мл PBS,
А ис н к т л и ю ге ч н е н C и D ем 19 п л э а кс зм пр о е ц о и с т и о р в у ( е 2 т ) с . ч всеми В-клетками, за опедует гомогенизировать, аккуратно перемешав. 0, Повторите шаг 5,
CD19 - ранний маркер В-линии, появляющийся на А 24 н а ч л а и с з о в о б п р о а сл зц е о о в т б н о е р о а Б , ходхмо выполнить в течение 9. У ре д с а у л с и п т е е н дируй су тй пе к р п н е а т т к а и н : т аспирацией и
поверхности бластов еще перед
внутрицитоплазматичвским синтезом 1дМ (2, 3-5). МЕТОДИКА - в 0.5 или 1 мл PBS с 0,1% раствором
В пврифиреческой крови примерно 10 ~ 15% формальдегида, если подгогговленная проба
НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ будет храниться от 2 до 24 часов. (Данный
лимфоцитов - CD19+, У детей младшего возраста, МАТЕРИАЛЫ раствор можно получить разведением 12,5 мкл
особенно в первые месяцы жизни, содержание
• Пробирки и материалы для отбора проб. реагента lOTest 3 Fixative Solution (кат. № A07S00)
CD19+ клеток знвчительно выше, чем у взрослы».
• Автоматические пипетки с одноразовыми в 10-кратной концентрации в 1 мл PBS ),
■■Это значение быстро уменьшается в течение
наконечниками на 2D, 100 и &D0 мкл. - в О.Б или 1 МЛ P8S без формальдегида, если
Первого года и к 10 годам достигает такого же
• Пластиковые пробирки длА гемолиза. подготовленная Проба будет проанализирована
уровня, как у взрослых.
• Калибровочные чэстицьг флуоросферы Flow- в течение 2 часов,
, ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ Set™ (кат. NS 66D7007). ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа подготовки
j]o н после вскрытия флакона жидкие канъюгаты • Реагент для лизиса эритроцитов (о
подготовленные пробы необходимо хранить при
антител необходимо хранить при температуре 2 - предусмотренной стадией отмывки после лизиса). температура 2 - В"С в защищенном ОТ света месте.
а“С в защищенном от света месте, Стабильность Например: Ver^aLyse (кат. Ns А0Э777).
невскрытого реагента приводится на этикетке • Реагент для фиксации лейкоцитов. Например:
флакона. Стабильность вскрытого реагенте 90 lOTest 3 Fixative Solution (кат, Ni А07В00).
дней. • Изотипический контроль: lOTest reagent. IgGI-
Р1ТСЛд01-РЕ(кат, №А07794).
• Буфер (PBS; 0,01 М фосфат натрия; 0,145 М
хлорид натрия; pH 7.2).
• Центрифуга,
• Миксер (вортекс).
1/3 A07736EN_A 2003-11-21
АС-03-1131
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 2. Рекомендуется выполнить ЛИЗИС эритроцитов С
СПЕЦИФИЧНОСТЬ Количество Среднее CV отмывкой, поскольку данный реагент не
МйнОкпОнйпЬмый антиТйдй (мАт) UCHT1 рвагируктт Лимфоциты образцов (%) SD 1%) оптимизирован дпя процедуры без отмывки,
С Е-цепью комплекса CD3 (5), В 1Эв2 г. на Первом 3. Для получения точных и ВОСПРОИЗВОДИМЫХ
мвждунараднйм рабочем соващании ло CD3+ 50 72.9 9,1 13 результатов необходимо собпюдатв все
диффервицировочкым антигенам лейкоцитов CD19+ 50 10 8 S.7 53 приведенные инструкции и нормы лабораторной
человека в Парике, Франция, была подтверждено, работы,
что мАт UCHT1 нaпpaвлeньi против CD3 (WS Code:
4. Антитела данного реагента откалиброваны для
3, Section Т) (7).
В 1989 г. на Четийртом ме}){дунЗроднам рабочем ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ получения наилучшего соотношения
- -совещанки по ди^еренцировочным антигенам ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ специфического и неспецифического сигнала.
лейкоцитов чйповйкй в Вймй, Австрия, Выпо В один день на одном цитомвтра определялось Поэтому в каждом исследовании необходимо
подтвергвдено, что мАт J4,119 направлены против процентное содержаний окрашенных попажительны* строго дозирсзать указанный объем реагента с
CD19 (WS Code; В191, Section &) (2). клеток (лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 учетом количества клетох в образце.
раз. Полученные результаты суммированы в 5. При гиперлейкоцитозе разведите образец PBS
следующей таблице: так, чтобы получить примерную концентрацию
ДИАПАЗОН линейности лейкоцитов 5 X 10*Ул,
Для проверки линейности окрашивания данным Положительные Количество Среднее CV 6. При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
реагентам были в различных пропорциях смешаны лимфоциты измерений {%) SD (%) почечная недостаточность или гемоглобинопатии,
положительные клетки линии HPBAJ.L (CP31-CD10-) ЛИ5ИС эритроцитов может происходить медленно,
и отрицательные клетки линии RAMOS (CD3- CD3+ 12 74,6 0.6 о,е не полностью или Совсем не происходить. В этом
CD19+). Общее количество клеток в обрааце CD19+ 12 11.Е 0.3 2.2 случае перед окрашиванием рекомендуется
оставалось постоянным, Соотношение вьделить мононуклварные клетки в градиенте
положительных и отрицательных клеток плотности (например, фикола}.
изменялась от О до 100%.
МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ
Аликвоты были окращйны в соатветствии t
описанной выше методикой. Ив основании РЕЗУЛЬТАТОВ ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
В Один день на дву* цитОмйтрах двумя
полученных и ожидаемых значений вычислялась В приложении привадится список литературы и
лаборантами определялось процентное
линейная регрессия, Уравнение регрессии можно примеры диаграмм.
содержание окрашенных клеток одной популяции
использовать для определения линейности и
(лимфоцитов). Измерение выполнялась 12 раз.
диапазона измерений для каждого маркера. ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
Полученные результаты суммированы в
Логотип Beckman Coulter. COULTER, EPICS, EXPO,
следующих таблицах:
Flow-Set, IMMUNO-TROL, lOTeat, System |1, XL
Маркер Линейная Линейность Диапазон
являются зарегистрированными торговыми знаками
регрессия (R=) (%) Цитомйтр # 1
компании Beckman Coulter Inc,
CD3 Y = 0.37X + 1.93 0,999 3-9S
Положительные Количество Среднее CV BD FACScan и BD LYSyS II являются
CD19 Y = 0,99 X +0,16 0,999 1-93 лимфоциты измерений (%) SD (%) зареплстрироранными торговыми знаками компании
CD3+ 12 74,е 0,6 0,6 ВО Biosciences and Company,
0ЖИДДЕМЬ1Е ЗНАЧЕНИЯ CP19+ 12 11,3 0.3 2,2
ИЗГОТОВЛЕНО:
Каждая лаборатория должна определить
собствен ныв диапазоны нормальны* значений на Цитоллетр # 2 1ммиштесн S.A,
основании исследования образцов нормальных а Вескппап Coulter Соглрапу
доноров местной популяции, Г|ри атом следует Положительные КоличестРО Среднее CV 130 avenue de Lattre de Ta^signy
учитывать BospacT, лоп и этническую лимфоциты измерений (%) SD (%) B.P. 177 -■ 13276 Marseille Cedex Э
првиадлйжмйсть доноров, а также другие местные France
особенности населении, CD3+ 12 78 2 1,5 1.Э Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
В нащих лаборатория* с использованием данного CD19+ 12 10.6 04 4.2
реагента было проведено исследование образцов www.t)eokmancoulter.corn
60 взрослы* людей. S следующей таблице
п co р tS е h д iT с H та H в : лены результаты подсчета положитепьных ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ S .B t fOWAN
OOUTEX.
1. При неправильной настройке цитофлуориметра,
неверной компенсации флуоресценции и
неправильном расположении регионов могут
быть попучвнм недостоверные результаты.
2/3 A(5V736EN_A2003ni^21
AC-03-1131
ПРИЛОЖЁНЙЁ к РУКОВОДСТВУ Ма А07714
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двулараметрйвыв дна^рамплы (мнтенсиБНОСТЬ фпуоресцтции - 1. Hannet, I., Erkeller-Yuksel, F., Lydyard, P„ Deneys. V,, DeBwyere, M , "De-
интенсивность флуоресценции), попученныв при анализе лизирпванного valopmenfal and maturational changes In human blood lymphocyte subpopula-
нормальной 14ельной крови. Для окрашивания использовались Ijora", 1992, tmmunol. Today. 13, 215-218.
конъюгаты актител ЮТеа! CD3-FITC/CD19-PE (кап. № А07734). Выполнялось 2. Tedder, F., Isaacs, C.M.. Penta. A., "Clonirg and slnjcture of CD19, a member
выделение лимфоцитов программными средствами. Для установки квадрантов of the immunoglobulin superfamily. Use of transfected ceils to examine the
, .использовался изотипичвсжий комтропь lOTest IgGi- FITC / lgQ1-PE (кат. Ms Workshop antibodies", 19вЭ, Leucocyte Typing IV, White Cell Differentiation
A077S4) (диаграмма не показана). Antigens. W. Knapp, etal-, Eds., Oxford University Press, 36*3в.
3. Lochen, M.R., Shah, V.O., Pattilio, K.L., Civin, C l., "Flow cytometric analys>s
Диаграмма 1. Считывание и анализ данны>: выполнены с помощью of human bone marrow. II. Normal В lymphocyte development", 1ЭВ7, Blood,
' Ч1ротачного цитофлуориметра COULTER* EPICS® XL™ в программном 70, 1316-1324.
обеспаченим Systtm II™. 4. Uckun, F.M., "Regulation of human B-cel[ ontogeny", 1990. Blooct.lO, 76,
1Э08-1Э23,
5. Caldwell, C.W,, Poje, E„ Helikson, M.A., "B-ce|| precursors in normal pediatric
LYHPHDCVTES
bnne marrflw", 1ВЭ1, Am J. Clin Pathol., 9b, 316-B23.
6. Tunnacljffe, A., Olsson, C.. Traunecker, A., Krissansen, G W.. Karialainen, K.,
De la Hera, A, "The majority of CDS epitopes are conferred by the e cnain',
1989. Leucocyte Typing IV, While Cell Differentiatiori Antigena. W Knapp, el
af., Eds , Oxford University Press, 2Э5-2ЭБ
7. Bernard, A,, Brottier, P„ Georget, E-, Lepage, V., Boumsell, L., "Joint report of
the first international workshop on human leucocyte differentiation antigens by
the investigators of the participating laboratories", 1984, Leucocyte Typing I,
Bernard, A. et al,. Springer Veriag, 9-135.
CD3-FITC
Диаграмма 2. Считывание данных выполнено с помощью проточного
цитофлуориметрэ BD FACScan™. Для анализа испольэозалось программное
обеспечение LYSYS II™.
3/3 A07736EN_A 2003-11-21
AC-03-1131
lOTest* Спецификации первого компонента Спецификации второго компонента
CD3-FITC / Специфичность CD3 CD8
CD8-PE Клан UCHT1 В9.11
Гибридома N31 хВа1Ь/с NS1 X Ва1Ь/с
I КАТАЛОЖНЫЙ НОМЕР | А07Г34
50 тестов, 1 мл Иммуноген Лимфоциты периферической крови Клон цип-отоксических Т-клетои HLA А2
-3D МКП / тест Иммуноглобулин lgG1 lgG1
Вид животных Мышь Мышь
Источник Асциты Асциты
Способ очистки Аффинная хроматография Аффинная хроматография
lOTest с иммобилизованным белком А с иммобилизованным белком А
Конъюгаты антител
Флуорохром Флуоресцинизотиоцианат (FITC) Фикоэритрин R (РЕ)
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€ л возбуждения 488 нм 486 нм
IN VITRO
Пик эмиссии 526 нм 575 нм
Буфер PBS pH 7,2, БСА2 мг/мл, 0.1% NaNj
НАЗНАЧЁНИЕ слизистой оболочкой и глазами. В кислой среде (исследуемый образец плюс изотипический
Данная смесь конъюгированных с флуорохромами азид натрия способен образовывать взрывоопасную контроль, кат. Ns А07794).
антител используется для многопарамотрового азотисто-вадорвдную кислоту. При утилизации 1. Б пробирки для анализа клинических образцов
анализа лейнйцигоа с помощью проточных перед сливой в водопровод рекомендуется добавьте по 20 мкл конъюгатов антител, a в
цитофлуориметров. Она позволяет обнаружить развести реагент большим объемом воды. Это пробирки для анализа контролей - по 20 мкл
зкспрвсоию антигенов CD3 и CD3, лозеолит избежать накопления азид« натрия в ИЭОТИПИческогп контроля,
металлических трубах и предотврагит образование 2. В пробирки для анализа образца и для анализа
ПРИНЦИП АНАЛИЗА взрывчатого вещества. изотипического контроля добавьте по 100 мкл
Данный тест аснован на способности специфических 7. Все образцы крови следует рассматривать как образца. Аккуратно лереме^иайте на вйртексе.
Мбнокпонвльных антител связываться с антигенными потенциальна инфицированные. При работе с
3. Инкубируйте в течение 15-20 минут при комнатной
дйтерминанташ на поверхности лейкоцитов. ними необходимо соблюдать все меры
температуре (1В - 2S"C) в защищенном от света
При HMKyfiaifdM образца с реагентом lOTest лроисхсдит предостороишости (в частности, использовать месте,
окрашивание лейкоцитов. Затем выполняется лизис защитные перчатки, ха лат и очки).
эритроцитов. Интекгные лейкоциты анализируются 8. Никогда не отбирайте образец через пипетку 4. Если требуется, выполните лизис эритроцитов
на проточном цигафлуориметре. ртом. Избегайте контакта образца с кожей, следуя рекомендациям изготовителя лизирующего
реагента.
Проточный цитометр измеряет светорассеяние и слизистой оболочкой и глазами.
флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить 9. После завершения работы пробирки с кровьк! и Например, при использовании реагента
интересующую популяцию на диаграмме, все одноразовые материалы необходимо VersaLyse (кат. Ms А09777) следуйте указаниям
отображающей еветорасоаянив в боковом поместить в специальные контейнеры для инструкции к этому реагенту Рекомендуется
направпйнйи (Side Scatter или SS) и светорассеяние утилизации. выполнить процедуру «с одновреиенной
фиксацией». Для атого добавьте к образцу 1 мл
в прямом направлении под малыми углами (Fonward
Scatter или FS). Для выбора анализируемых ОБРАЗЦЫ свежеприготовленного раствора для фиксации и
популяций можно использовать различные Венозную кровь или образцы костного мозга лизиса. Немедленно перемешайте на вортекее в
двупарамегровые диаграммы в зависимости от необходимо отобрать а стерильные пробирки с течение 1 секунщы. Инкубируйте 10 минут при
используемого приложений. солыо EDTA в качестве антикоагулянта комнатной температуре в защищенном от света
Использованио других антикоатупянтов не месте.
Прибор выполняет анализ флуоресценции
рекомендуется. Если образец не содержит эритроцитов,
выбранной популяции, распознавая окрашенные и
Образцы долины храниться при комнатной добавьте 2 мл PBS
н ви е д ок е р п а р ш о е ц н е н н ы тн е о г к о л е с т о к д и е . рж Р а е н зу и л я ь п та о т л о п ж р и е т д е с л т ь а н в ы л х я е к т л с е я т о в к д те о м пу п с е к р а а е т т у с р я е . ( П 1 е 6 р " е 2 д 5 о "С тб ) о , р В о с м т р а я л х и и к в в а о н т и ы е о о б б р р а а з з е ц ц о в не 5. О g т п ц р е и н к т о р м иф на у т г н и о р й у й т т е е м п в е т р е а ч т е ур ни е. е 5 минут при 150 *
от всех клеток выбранной популяции.
следует гомогенизировать, аккуратно перемешав. 6. Удалите супернатант аспирацией.
ПРИМЕРЫ клинического ПРИМЕНЕНИЯ Анализ образцов необходимо выполнить в течение 7. Ресуспемдируйте осадок клеток в 3 мл PBS.
24 часов после отбора. 3. Повторите шаг 6.
Характеристика и подсчет CD3+ субпопуляции Т-
ioieTo« при нарушения» иммунной системы: СПИДе и 9, Удалите супернатант аспирацией и
других иммунодефицитных состояниях (1). МЕТОДИКА ресуспендируйте клетки:
аутоиммунных заболеваниях, реакциях НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ - в 0.5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором
гиперчувствительности, вирусных инфекциях, МАТЕРИАЛЫ формальдегида, если подготовленная проба будет
восстановлении иммунной системы после пересадки • Пробирки и материалы для отбора проб. храниться от 2 до 24 часов, (Данный раствор
костного мозга (2). Харакгвристика и подсчет • Автоматические пипетки с одноразовыми можно получить разведением 12,5 мкп реагента
естественных киллеров. Фенотипирование наконечниками на 20, 100 и 5D0 мкл. iOTest 3 Fixative Solution (кат. N° А07Э00) в 10-
субпопуляций Т-клвток и наблюдение за пациентом • Пластиковые пробирки для гемолиза. кратной концентрации в 1 мл PBS.),
при злокачественных заболеваниях крови, таких как • Калибровочные частицы: флуоросферы Flow- - в OS или 1 мл PBS без формальдегида, если
лимфома и лейкоз {3>, Set™ (кат- MS 66D7007}, подготовленная проба будет проанализирована в
течение 2 часов.
■ Реагент для лизиса эритроцитов (с
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ предусмотренной стадией отмывки после лизиса).
До и после вскрьпия флакона жидкие конъюгаты Например; VeraaLyse (кат. Nt АСЭ777) ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо or способа подготовки,
антител необходимо хранить при температуре 2 - подготовленные пробы необходимо хранить при
• Реагент для фиксации лейкоцитов. Например:
8°С в защищенном or света месте. Стабильность температуре 2 - 8"С в защищенном от света месте.
lOTest 3 Fixative Solution (кат. Ns AQ7B00),
невскрытого реагентч приводится на этикетке
• Иаотипический контроль' lOTest reagent. IgGI-
флакона. Стабильность вскрытого реагента 90
FITC / IgGI-PE (кат. № AD7794).
,дней
• Буфер (PBS: 0,01 M фосфат натрия; 0.14Б М
ВНИМАНИЕ хлорид натрия; pH 7.2).
1. Не используйте реагент с истекшим сроком • Центрифуга
' годности. • Миксер (вортекс).
i. Не замораживайте реагент. • Проточный цитофлуориметр.
3. Перед использованием необходима уравнонесить
реагент при вомнатийй температуре (18-25^0). ПОДГОТОВКА ПРОБ
4. Воздействие света необходимо свести к Замечание: Приведенная ии«е процедура пригодна
минимуму. для стандартных исследований. При выполнении
5. Избегвйте контаминации микрйортанизмаии, в некоторых приложени!* Beckman Coulter объем
противном случае возможно получение образца и/или реагента VersaLyse может отличаться.
недостоверных результатов. В атом случае следуйте указаниям руководства для
6. Растворы антител, содержащие азид натрия (NaNa), конкретного приложения.
требуют осторожного обращения. Не При исследовании лкзбого образца необходимо
проглатываете, избегайте любого контакта с кохвй,
также проанализировать контрольный образец
1/3 A07734EN_A 2003-11-21
АС-03-1130
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 2. Рекомендуется выполнять лизис зритроцнтса с
СПЕЦИФИЧНОСТЬ Количество Среднее CV отмывкой, поскольку данный реагент не
Моноклонетьные анткттвла (мАт) UCHT1 реагируют Лимфоциты образцов SD (%) оптимизирован для процедуры без отмывки,
с с цепью комллекса CD3 (4). В 1982 г. на Первом 3. Для получения точных и йоспроизаодимых
международном рабочем совещании по С03+ 50 66,51 Э.90 14,89 результатов необходимо соблюдать асе
дифференцировочкым антигенам лейкоцитов приведенные инструкции и нормы лабораторной
человека в Париже, Франция, Выло подтаерждено, соа+ 50 16,11 6 ВО 34 74 работы-
что мАт UCHT1 направлены против CD3 (WS Code: 4- Антитела данного реагента йТкЗЛийрйнйнЬ! Длй
3, Section I) (5)
получения наипучшего соотношения
. МйнйшШнальные антитела BS.H реагируют с а- ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ специфического и неспецифического сигнала.
субъединицей гетвродимвра CD3 (6). ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ Поэтому в каждом исследовании необходима
В 1982 г. на Первом международном рабочем в один день на одном цитометре определялось строго дозировать указанный объем реагента с
совещании по диффэренцировочным антигвнам процентное содержание окрашенных учетом количества клеток в обраэце.
лейкоцитов челпввка й Париже, Франция, было положительных клеток (лимфоцитов). Измерение 6. При гиперлейкоцитозе разведите образец PBS
* ?*дт«вр>вдв»о, что мАт В9,11 направлены против выполнялось 12 раз. Полученные результаты так, чтобы получить примерную концентрацию
СОВ (WS Code: 43, Section 7) (5). суммированы в следующей таблице: лейкоцитов 5 х 10®/л
6. При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
Положительныа Количество Среднее CV почечная недостаточность или гемоглобинопатии,
Д
Д
л
И
я
А П
п
А
р
З
о
О
ве
Н
р к
Л
и
И Н
л
Е
и
Й
не
Н
й
О
н
С
ос
Т
т
И
и окрашивания данным
лимфоциты измерений т SD (%) лизис аритроцитов м01кет происход^ь медленно,
не полностью или совсем ив происходить, В этом
реагентом были в различных пропорциях смешаны CD3+ 12 S4.67 0.46 0,5 случае перед окрашиванием рекомендуется
положительные клетки линии HPBALL и
выделить мононуклеарные клетки б градиенте
отрицательные клетки лини» DAUDI, Общее сое*- 12 £8.9й 0,68 2.3
плотности (например, фикола),
количество клеток в образце осггааалось
постоя»! и ым. Соотношение положительных и
отрицательных клеток изменялось от О до 1оО%.
МЕЖПАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Аликвоты были окрашены а соответствии с РЕЗУЛЬТАТОВ В приложении приводится список литературы и
описанной ВЫШ0 методикой. На основании В Один день не двух цитометрах двумя примеры диаграмм.
полученных и ожидаемых значений вычиспяпа» паборантами определялось процентное
линейная регрессия. Уравнение регрессии можно
оодержанме окрашенных клеток одной популяции
использовать для определения линейности и (лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 раз. ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
диапазона измерений для ка>|адого маркера. Полученные результаты суммированы в следующих Логотип Ввокл1ап Coulter, COULTER, EPICS, EXPO,
таблицах: Flow-Set, IMMUNO-TROL, iOTest, System II, XL
Маркер Линвйнай Линейность Диапазон являются зарегистрированными торговыми знаками
регрессия (Я") (%) Цитометр # 1 компании Beckman Coulter inc.
CD3 Y = 0,93 X + 0,40 0.999 1 - 97 BD FACScan и ВП LY3YS внлякзтся
Положительл ые Количесгао Среднее CV
зарегистрированными торговыми знаками компании
CDS Y= 1.00 X -0,70 0.999 2 - 99 лимфоциты измерений {%) SD (%) во Bioeclences and Company,
CD3+ 12 84 67 0.46 0.5
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ CD6* 12 28.90 0,66 2.3 ИЗГОТОВЛЕНО:
Каждая лаборатория должна определить iMMUNOTECH S.A
собственные диапазоны нормальных значений на a Beckman Coulter Company
основании исследования образцов норплальных 130 avenue de Lattre de Tasslgny
Цитомвтр # 2
доноров местной популяции, При этом слвдует B.P. 177 - 13276 Marseille Cede* 9
учитывать возраст, пол и атническ/ю France
принадлежность доноров, а также другие местные Положительные Количество Среднее CV
Отдал no работе с клиентами: (Зз) 4 B1 17 27 £7
особенности населения, лимфоциты измерений (%) SD (%)
р В е а н г а е ш н и та х л б а ы б л о о р а п т р о о р в и е я д х е н с о и и с с п с о л л е ь д зо ов ва а н н и и е е м о б д р а а н з н ц о о го в CD3+ 12 64.09 1.S9 1.7 www.beckmancDultercom
50 взрослых люден. В следующей таблице
пред1»авлены результаты подсчета положительных CD3+ 12 29.35 0,55 1.9
событий:
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
1, При неправильной настройке цитофлуориметра,
неверной компенсации флуоресценции и
неправильном расположении регионов могут
быть получены недостоверные результаты.
2/3 A07734EN_A 2003-11-21
АС-03-1130
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № А0Т7М
ПРИМЁРЫ ДИАГРАММ список ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двупараметровые диаграммы (интенсивность флуоресценции - 1. Schenker, E.L., Hultin, L.E., Bauer, KD., Ferbas, J., Margolick, J.B., and
интенсивность флуоресценции), полученные при анализе лизированного образца Glorgi, J V. Evaluation of a dual-color flow cytometry immunophenotypin9
нормальной цельной крови. Для окращивамия использовались конъюгаты panel in a multicenter quality assurance program. Cytometry. 19эз;14(3);3а7-
антител lOTest СОЗ-ЯТСУСВВ-РЕ (кат. Ма А07734). Выпопнвлось выделение 17.
лимфоцитов программными средствами, Изотипичвский контроль - lOTest lgG1- 2. Veiardi, A., Tarenii, A., CucciaionI, S., Millo, R,, Gnossi, C,E,.
. FITC / IgGl'PE (кат. Nb A07794) (диаграмма на показана). Grignani, F.. Martelli, M,F,, ''Innbalance within the peripheral blood
T-helper (CD4+) aniJ T-suppressor (CDS*) cdl populations in the reconstitu­
Диаграмма 1. Считывание и анализ данных выполнены с помощью tion phase after human bone marrow transplantation", 1B88, Blood, S, 71.
проточного цитофлуориметра COULTER EPICS® XL™ в программном 1196-1200,
обеспечении System И™.
3. Rothe, G., Schmitz, G,, Adorf, D„ Barlage. S., Gramatzki, Wl„
Haffkes, H,G,, Janos&y, G„ Knuchel, R., Ludwig, W.P., Nebe, T, Neri, C,, Or-
LYMPHOCYTES fao. A., Serke, S,, Sonnen, R., Tichelli, A„ Wormann, S., ''Consensus protocol
for the flow cytometric immunophenolyping of hematopoietic malignancies",
199S, Leukemia, 10, «77-896
4. TunnacliffB, A, Olsson, C., Traunecter, A., Krissansen, GW.,
Kafjalainen, K., De la Hera, A.. "The majority of CD3 epitopes are conferred by
the E ctiain", 198Э, Leucocyte Typing IV, White Cell DiffeTentialion Antigens.
W Knapp, et al,, Eds., Oxford University Press, 2S5-2S6
6- Bernard, A., Bmttler, P., Georget, E., Lepage, V., Boumsall, L., "Joint report of
the first international wofksfiop on human leucocyte differentiation antigens by
the investiaators o( the participating labonatories", 1934, Leucocyte Typing I,
Bernard, A. et at.. Springer Verlag, 9-135.
6. Alcover, A,, "CD8 duster report", 1Э95, Leucocyte Typing V. White Cell Differ­
entiation Antigens. Schlossman, S.F., et al , Eds.. Oirford University Press, p.
353-354.
Диаграмма 2. Считывание данных выполнено с помощъю проточного
цитофлуориметра BD FACScan™. Для анализа использовалось программное
обеспечение LYSYS II™.
LYMPHOCYTES
FL1-H\FL1-Height—> СОЗ-FITC
3/3 A07734EN Л 2003-11-21
АС-03-113D
ЮТезГ Спецификации первого компонента Спецификации второго компонента
CD3-FITC I Специфичность соз CD4
CD4-PE Кпон UCHT1 13В3.2
Гибридома NS1 X Ва1Ь/с NS1 X Вв1Ь/с
IКАТАЛОЖНЫИ НОМЕР | А07733
Иммумоген Лимфоцлты периферической крови Тимоциты человека
50 тестов; 1 мл
' йО мкл / тест Иммуноглобулин IgGI I3G1
Вид ЖИРОТНЫХ Мышь Мышь
Источник Асциты AcsjHTbi
Способ очистки Аффинная хроматография с Аффинная хроматография с
lOTest иммобилизованным белком А иммобилизованным белком А
Конъюгаты антител
Флуорохром Флуйресцинизоттлоцианат (FITC) Фикоэритрин R (РЕ)
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€ л разбуждвния 4ав нм 488 нм
IN VITRO
Пик эмиссии S25 нм 57S нм
Буфер PBS pH 7.2, БСА 2 мг/мл, 0.1% NaNj
НАЗНАЧЕНИЕ 6. Растворы антител, содержащие азид натрия (NaNj). ПОДГОТОВКА ПРОБ
Данная смесь коньюгироаэнмых q фпуарохромами требуют осторожного обращения. Не ЗАмеЧАНие: (1риведенкая ниже процедура пригодна
антител используется для многолараметроваго проглатывайте, издайте любого контакта с кожей, для стандартных исследований. При выполнении
анализа лейкоцитов с помощью проточны» слизистой оболочкой и глазами. S кислой среде некоторых приложений Бесктап Coulter объем
цитпфлуориметров. Ома позволяет обнаружить азид натрия способен образовывать образца и/или реагента VersaLyse может отличаться.
экспрессию антигенов СОЗ и CD4. взрывоопасную азотисто-аодороднукз кислоту. При В этом случав следуйте указаниям руковсщства для
утилизации перед сливом а водопровод конкретного приложения.
ПРИНЦИП АНАЛИЗА рекомендуется развести реагент большим объемом При исследовании любого образца необходимо
Данный тест основан на способности воды. Это позволит избежать накопления азида такзке проанализировать контрольный образец
специфических маноклональныл антител натрия в металлических трубах и предотвратит (исследуемый образец плюс изотипический
связываться с антигенными двгерминантани на образование взрывчатого вещества. контроль, кат. NB А07794),
поверхности лейкоцитов. 1. В пробирки для анализа клинических образцов
При инкубации образца с реагентам lOTest проио«ддит 7, Все образцы крови следует рассматривать как добавьте по 20 мкл конъюгатов антител, а в
окрашивание лейкоцитов. Затем выпапняется лизис потенциально инфицированные. При работе с пробирки для анализа контролей - по 20 мкл
эритроцитов. Интакгные лейкоциты амализируготсй ними необходимо соблюдать все меры изотипического «онтролн.
ф н П а р л о у п т о р о р о ч е т н о с ы ч ц н й е о н м ц ц и и ц ю т и о т м о к ф й л т л в р т у с о х и р - з и м м О е е р н тр я е е п . т о з с в в о е л т я о е р т а сс в е ы я д н е и л е и ть и 6. Н р л за и т р о щ к е о м д и г . о т д с н а т ы И о е з р н б о е п е ж е г н р а о о ч й т с а б т ш т е и к р и а , к ( й о х в т н а е т л ч а а а о к т т с б а т и р н а о о з ч о с е к б т и ц и р ) , , а ч з е ц и р а с е п з о с л п ь и з к п о о е в ж т а е к т й у ь , 2. и о В б з о р п т а р и з о п ц б и а и ч . р е А к с к и к к о у д г р о л а я т н ко а о н н п т а е р л р о и е п з м я а е ш о д б а о р й б а т а е з в ц ь н а т а е в и о п р д о т л е й к с 1 а е 0 . н 0 а л м и к з л а
интересующую популяцию на дмеграмме, слизистой оболочкой и глазами. 3. Инкубируйте в течение 15-20 минут при
отображающей светорассвянь«е в боковом комнатной температуре (18 - 26°С) в защищенном
направлении (Side ВсвНег или SS) и Э, После завершения работы пробирки с кровью и от света месте,
светорассеяние в прямом направлении под малыми все одноразовые материалы необходимо 4 Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
углами (Forward Scatter или FS). Для выбора поместить в специальные контейнеры для следуй рекомендациям изготовитепв
анализируемых популяций можно использовать утилизации, лиз)^рук5Щего реагента.
различные двупареметровые диаграммы в Например, при использовании реагента VersaLyse
зависимости от используемого приложения. ОБРАЗЦЫ (шг NS А0Э777) следуйте указаниям инструкции к
Прибор выполкяет анализ флуоресценции венозную кровь или образцы костного мозге этому реагеиту. Рекомендуется выполнить
выбранной популяции, распознавая окрашенные и необходимо отобрать в стерильные пробирки с процедуру ис одновременной фиксацией». Для
неокрашвмные клетки. Результат представляется в сопью EDTA в качестве атикоагулянта. этого добавьте к образцу 1 мл
виде процеитмопа содержания положительных Использование других антикоагупянтов не свежеприготовленного раствора для фиксации и
клеток от всех клеток выбранной популяции. рекомендуется. лизиса, немедленно перемешайте на вортексе в
течение 1 секунды. Инкубируйте 10 минут при
Образцы должны храниться при комнэтно!*
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ температуре (10 - Z5”C). Встряхивание образцов не комнатной температуре в защищенном от сяета
месте.
Характеристика и подсчет CD4'*' лимфоцитов при допускается. Перед отбором аликвоть! образец
нарушениях иммунной системьл СПИДе (1) и других следует гомогенизировать, аккуратно перемешав, Если образец не содержит эритроцитов,
1чммунодвфицитных состояниях, аутоиммунных
Анализ образцов необходимо выполнить в течение
добавьте 2 мл PBS,
заболеваниях (2), реакциях гиперчувствительности, S, Отцентрифугируйте в течение £ минут при 150 х
24 часов поспе отбора.
вирусных инфекциях, восстановлении иммунной Э при комнатной температуре,
системы после пересадт костного мозга и/или е. Удалите супернатант аспирацией,
МЕТОДИКА
органов. Фенотипирование популяций CD4+ и 7. Рвсуспендируйте осадок клеток а 3 мл PBS,
НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ
наблюдение за пациентом при злокачественны* е Повторите швг S.
МАТЕРИАЛЫ
заболеваниях крови, таких как лимфома и лейкоз 9. Удалите супернатант аспирацией и ресуспеидируйте
(3). • Пробирки и материалы для отбора проб. клетки:
• Автоматические пипетки с одноразовыми
- в 0,5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором
ХРАНЕНИе и СТАБИЛЬНОСТЬ нвконечныками на 20. 100 и 50Q Мкл.
формальдегида, если подготовленная проба
До и после вскрытия флакона жидкие конъюгаты • Пластиковые пробирки для гемолиза.
будет храниться от 2 до 24 часов. (Данный
антитйл необходимо хранить при температуре 2 - • Калибровочные частицы: флуоросферы Flow- раствор можно получить разведением 12.5 мкл
6'С в защищенном отсвета месте. Set™ (кат. № 6607007), реагента lOTest 3 Fixative Solution (кат. М» А07300)
Стабильность невскрьп’сго реагента природится на • Реагент для лизиса эритроцитов (с в 10-кратной концентрации в 1 мл PBS)
этикетке флакона. предусмотренной стадией отмывки поспе лизиса). - в 0.5 или 1 МП раз без формальдегида, если
Стабильность вскрытого реагента 90 дней, Например; VersaLyse {кат. Ns А09777). подготовленная проба будет проанализирована
• Реагент для фиксации лейкоцитов. Например: в течение 2 часов.
ВНИМАНИЕ iciest 3 Fixative Solution (кат. № AD7B0Q),
*). Не используйте реагент с истекшим сроком »Изотипический контроль: lOTest reagent, lgG1- ЗАМЕЧАНИЕ; Независимо от способа подготовки,
< годности. FITC i lgG1-PE (кагт, № AD7794), подготовленные гробы необходимо хранить при
2. Не замораживайте реагент. • Буфер (PBS: 0,01 M фосфат натрия; 0,145 М температуре 2 - В°С в защищенном от света месте
3. Перед использованием необходимо урааноавсить хлорид натрия; pH 7.2),
реагент при комнатной температуре (16 - 25"С). • Центрифуга,
4. Воздействий света необходимо свести к • Миксер (вортекс).
минимуму.
• Проточный цитофлуорииетр.
5. Избегайте контаминации микроорганизмами, в
противном случае возможно получение
недостоверных результатов.
1/3 A07733EN А 2003-11-21
АС-03-1129
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 2. Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов с
СПЕЦИФИЧНОСТЬ Количество Среднее GV отмывкой, поскольку данный реагент не
Монйкпоиаяьмые антитела (мАт) UCHT1 реагируют Лимфоциты образцов (%) SD (%) оптимизирован для процедуры без отмывки.
с £-14нпыо комплекса COS (2). В 1982 г, на Первом 3. Для получения точных и воспроизводимых
ме>вд/наролном рабочем совещании по CD3+ 30 ее, 51 9-ЭО 14.69 результатов необходима соблюдать все
диффервнцирввочным антигенам пвйкоцитор приведенные инструкции и следовать нормам
человеке а Париже, Франция, было подтвериздвно, CD4+ 50 55 91 ю.аг 19 36 лабораторной работы.
что мАт UCHT1 направлены против CD3 (WS Code: 4. Антитела данного реагента йткалиброааны для
3, Section Т) (S), получения наилучшего соотношения
, Моноклонапьмь1е антитела 1ЭВВ.2 распознают 0НУТРИЛАБОРАТОРНАЯ специфического и неспецифического снгнала
SnuTon, распрложенный на ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ Поэтому в казедйм исследовании необходимо
иммунсглобулиноподаЬном домене VI антигена В один день на одном цитомвтре определялось строго дозировать указанный объем реагента с
CD4. Картирование зпитопов о использованием проценп-ное содержание окрашенных учетом количества клеток в образце.
направленных мугтаций внвцитоплаэматичвских положительны* клеток <лимфоцигов). Измерение 5. При гиперлейкоцитозе разведите образец PBS
показало, что на фиксацию мАт 13В8.2 вьiлoлнялocь 12 раз Полученные результаты так, чтобы получить примерную концентрацию
влиякл- мутации голы» 88 и/ипи 39 остатков (6). суммированы а следующей таблице: лейкоцитов Б X 10%,
МАт 13ВВ.2 ингибируют фиксацию in vitro HIV-1.
6. При некоторых заболезания*, таких как тяжелая
В 1Э8Б г. на Третьем международном рабочем Попожительные Количество Среднее CV почечная недостаточность или гемоглобинопатии,
совещании по диффервнциравочным антипвнам лимфоциты измерений {%) SD (%) лизис эритроцитов может происходить
лейкоцитов чвпйвека в Оксфорде, Англия, было
медленно, не полностью ипи совсем не
подтверладено, что мАт 13В8.2 направлены Против CD3+ 12 59.40 0,69 1.2 происходить. В этом случае перед окрашиванием
CD4 (WS Code* 501, Section: Т) (7).
рекомендуется выделить мононуклеарные клетку!
CD4+ 12 42,56 0В4 2.0 в градиенте плотности (например, фикола).
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ
Для проверки линейносл^и окрашивания данным
МЕЖПАБОРАТОРНАЯ В0СПРО1|ЧЗв0ДИи0СТЬ ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
реагентом были в различных пропсрциях смешаны
полокителъные кпйтга пинии HPBALL и РЕЗУЛЬТАТОВ в приложении приводится список литературы и
отрицэтельные клетки линии DAUDI. Общее В один день на дву* цитометрах двумя примеры диафзмм,
количество клеток в образце оставалось лаборантами определялось процентное
постоянным. Соотношение положительных и содержание окрашенных клеток одной популяции ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
отрицательны* клеток изменялось от О до 100%. (лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 раз
Полученные результаты суммированы в Логотип Beckman Coulter COULTER, EPICS, EXPO,
Аликвоты были окрашены в соогветстаии с следующих таблицах: Flow-Set, IIHMUNO-TROL, lOTest, System 11, XL
описанной выше методикой На основании являются зарегистрированными торговыми знаками
полученных и ожидаемых значений вычислялась Цитометр # 1 компании Beckman Coulter Ino,
линейная регрессия. Уравнение регрессии можно
использовать для определения линейности и BD FACScan и BD LYSYS II ввляклся
диапазона измерений для каждого маркера. Положительные Количество Среднее CV зарегистрированными торговыми знаками компании
лимфоциты измерений {%) SD (%) BD BioBciences and Company.
Маркер Линейная Линейность Диапазон CD3+ 12 5Э.40 0.S9 1.2
регрессия (R=) {%)
CD4+ 12 42.56 0.84 2.0 ИЗГОТОВЛЕНО;
CD3 Y = 0.97X + 1,11 0.9ЭЭ 2-57 IMMUNOTECH S.A.
a Beckman Coulter Company
CD4 У'*О.09Х-й.23 0 999 1-93 Цитометр # 2
130 avenue de Lattre da Tassigny
B,P, 177- 1327Б Marseille Cedex s
Положительные Количество Среднее CV France
ожидаемые значения лимфоциты измерений (%) SD {%)
Какадая лаборатория должна определить Отдел по работа с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
собственные диапазоны норнапьнь1х значений на CD3+ 12 Б9.46 0,55 0.9
основании исследования образцов нормальных WWW. beckmancoulter.co m
доноров местной популяции. При атом следует CD4+ 12 42.B8 0.55 1.3
учитывать возраст. пол и этническую
принадлежность доноров, а также другие местные reeOCMAN
CDumt,
особенности населения.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
В наших лабораториях с использованием данного 1. При неправильной настройке цитофлуориметра,
реагента было проведено исследование образцов неверной компенсации флуоресценции и
50 взрослы* людей. В следующей таблице неправильном расположении регионов могут
представдень! результаты подсчета лапожительных быть попучены недостоверные результаты.
событий:
2/3 A07733EN A 2003-11-21
AC-03-1120
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № А07733
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двупараметровые диаграммы (интенсивность 1. SchenKer, E.L., Hultin, L.E., Bauer, K.D., Ferbas, J., Margolick, J.B.,
флуоресценции - интенсивность флуоресценции), полученные при and Giorgi, J.V, Evaluation of a dual-color flow cytometry Immuno-
анализе лизированного образца нормальной цельной крови. Для phenolyping panel In a multicenter quality assurance program. Cy­
окрашивания использовались конъюгаты антител lOTest CD3- tometry. 1993:14 (3):307-17,
' ЯТС/С04-РЕ (кат, № AD7733). Выполнялось выделение лимфоцитов 2. van Agthoven, A., Terhorst, C., Relnhers, E.L., SchlossrDan, S.F ,
программными средствами. Изотипический контроль - IQTest lgG1- "Characterization of T cell surface glycoproteins T1 and T3 present
FITC / IgGl-PE (кат. Ns Aa7794) (диаграмма не показана). on ad human peripheral T iymptiocytes and functional mature T lym­
phocytes", 19S1, Eur. J. Immunol., 11, 18-21.
' )1|иаграмма 1- Считывание и анализ данных выполнены с помощью
3. Valcltus, L., Ball, E.D., Foon, KA, "Immune markers In hematologic
проточного цитофлуориметра COULTER® EPICS® в
malignancies", 1991, Critical reviews in oncologyyhemafology, 11,
программном обеспечении System II™.
267 297.
4. Tunnacliffe, a., Olsson, C., Traunecker, A., Krissansen, G.W., Kar-
1УМРН0С¥ТЕ5 jalainen, K„ De la Hera, A., "The majority of CD3 epitopes are сол-
fen-ed by the t. chain", 1989, Leucocyte Typing IV, White Cell Differ­
entiation Antigens. W. Knapp, ef al., Eds.. Oxford University Press.
295^296.
5. Bernard, A., Brottier, P„ Georget, E., Lepage, V.. BDumseii, L., "Joint
report of the first international workshop on human leucocyte differ­
entiation antigens by the Investigators of the pBrticlpaling latwrato-
ries", 1984, Leucoc^e Typing I, Bernard, A. et al., Spnnger Verlag,
9-135.
6. SprenI, J., "T lymphocytes and the thymus", 1989, Fundamental
Immunology, Chap 4. 2nd Ed., 69-93.
7. Taylor, G.M., Williams, A., fi/lorten, J., Morten, H., "Analysis of CD4
monoclonal antibodies using human X mouse hybnd celllines 0KT4",
1987, Leucocyte Typing III, White Cell Differentiation Antigens, A.J.
McMlchael, p. 234-233.
■>' I 'I'miil I ....................
1 1в 1в0 iBEia
CD3-FITC
Диаграмма 2. Считывание данных выполнено с помощью проточного
цитофлуориметра BD FACScan™. Для анализа использовалось
программное обеспечение LYSYS II™.
LYMPHOCYTES
f
чг
S
л
DO "I'oi .............ib?
FL1-H\FL1-Height—> CD3-FITC
3/3 A07733EtJ_A 2003-11-21
AC-03-1129
Спецификации первого компонента Спецификации второго компонента
lOTesr
Специфичность CD3 CD16 CD56
CD3-FITC I
Клон UCHT1 3G8 N901 (NKH-1)
CD16+CD56-PE
Гибридома NS1 X BalWc SP2№ X Balb/c NS1/bAg4xBalb/c
I КАТАЛОЖНЫЙ номер] A07735 Иммуноген Лимфоцугты периферической крови Нейтрофилы Кпетки.
человека человека полученные от
SOtbctob; 1 мл больного
^ 20мкл/тест хроничесшм
миелопейкоэам
CO дБ U С U К E М R А . Ы Иммуноглобулин lgG1 IgGI IgGI
Вид животных Мышь Мышь Мышь
lOTcst Источник АСЦ1ДТЫ Асциты Асциты
Конъюгаты антител Способ очистки Аффинная хроматография с Аффинная хроматография t
иммобипизовэнным белком А иммобилизованным белком А
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ C€ Флуорохром Фпуоресцинизотиоцианат (FITC) Фикоэритрин R (РЕ)
IN VITRO л возбуждения 489 нм 48В нм
Пик эмиссии 625 нн 575 нм
Буфер PBS pH 7.2, БСА2 мг/мл, 0.1% NaN,
НАЗНАЧЕНИЕ 5. |Лзбегайтв контэиинации микроорганизмами, 6. Растворы антител, содержащие азид натрия
Данная смесь каньйгированных q в противном случае возможно получение (NaNj), требуют осторожнога обращения. Не
фпуорохромом антител позволяет недостоверных результатов. проглатывайте, избегайте любоп: контакта с
идентифицировать клетки, экспрессирующие кожей, спизистйй оболочкой и глазами.
сЬэ,
антигены CD16 и CD56, и выполнить их В кислой среде аэид натрия способен
подсчет. Для анализа используются обрааоеыватъ взрывоопасную аэотисто-
биологические образцы человека. водорсдную кислоту. При утилизации перед
Исследование провсдится метсдом проточной сливом в водопровод рекоменцуется развести
цйтофпуоримвтрии. реагент большим объемом воды. Это позволит
избежать накопления азида нагтрия в
принцип АНАЛИЗА метаплических трубах и предоттвратит
Данный тест основан на способности образование взрывчатого вещества.
специфических моноклональных антител 7, Все образцы крови следует рассматривать
связываться с антигенными детерминантами на как потенциально инфицированные. При
поверхности лейкоцитов. работе с ними необходимо соблюдать все
При инкубации образца с рэагвнтвм lOTest меры предосторожности (в частности,
происхсяит окрашивание лейкоцитов. Затем использовать защитные перчатки, халат и
вьтолняется лизис эритроцитов. Интакгные очки).
лрйкоциты анализируются на проточном й, Никогда не отбирайте образец через пипетку
цитофлуориметра. ртом. Избегайте контакта образца с кожей,
Проточный цитоыетр измеряет светорассеяние слизистой оболочкой и глазами-
и; флуоресценции клеток. Он нозволнет 9. После завершения работы пробирки с
выделить интересующую популяцию на кровью и все одноразовые материалы
диаграмме, отображающей светорассеяние в необходимо поместить в специальные
боковом направлении (Side Scatter или SS) и контейнеры для утилизации.
светорассеяние а прямом направлении под
малыми углами (ForwarJ Scatter или FS). Для ОБРАЗЦЫ
выбора анализируемых популяций можно Венозную кровь или образцы костного мозга
использовать различные двупараметровые необходимо отобрать в стерильные пробирки с
диаграмилы в зависимости от используемого солью EDTA в качестве антикоагупянта.
приложения. Использование других антикоагулянтов не
Прибор выполняет анализ флуоресценции рекомендуем.
Убранной популяции, распознавая окрашенные Образцы должны храниться при комнатной
и неокрашенные клетки. Результат температуре (18 - 25'С). Встряхивание образцов
представляется в виде процентного содержания на допускается. Перед отбором аликвоты образец
положительных клеток от всех кпеток выбранной следует гомогенизировать, аккуратно перемешав,
популяции. Анализ образцов необходимо выполнить в
течение 24 часов после отбора
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
Аналш естественных киллеров (С 03^ / CD16+ / МЕТОДИКА
CD56+) (1, 2) и читотоксических Т-лимфоцитов НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ
(GD3+/CD16+/CD56+)(3). МАТЕРИАЛЫ
• Пробирки и материалы для отбора проб.
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
• Автоматические пипетки с одноразовыми
До и после распечатки флакона жидкие наконечниками на 20. 100 и 500 мкл
конъюгаты антител необходимо хранить при
• Пластиковые пробирки для гемолиза.
• температуре 2 - 8°С в защищенном от света
месте. • Калибровочные частицы: флуоросферы Flow-
Set тм (кат. № 6607007).
■Стабильность нераспечатанного реагента
приводится на этикетке флакона. • Реагент для лизиса эритроцитов (с
К предусмотренной стадией отмывки после
Стабильность распечагтанного рааганта 90 дней. лиэиса). Например: VersaLyse (кат, №
А09777).
ВНИМАНИЕ
• Реагент для фиксации лейкоцитов. Например:
1. Не используйте реагент с истекшим сроком
lOTcst 3 Fixative Solution (кат, Ns A078D0),
годности.
• Иэотипический контроль: lOTest reagent.
2. Не замораживайте реагент.
IgGI-FITC / IgGl-PE (кат. Na A07794}.
3 Перед гепольэоаанием необходимо уравновесить
• Буфер (PBS: 0.01 M фосфат натрия; 0,145 М
реагент при комнатной температуре {10 - 2S°C).
хлорид натрия, pH 7.2).
4. Воэдейстрие света необходимо свести к
минимуму. • Центрифуга.
• Миксер (вортекс),
1/4 А07735СЕ С 2005-12-05
• Пр1?точный дитофлуариметр. ПОДГОТОВКА ПРОБ
Замечание; Приведенная ниже процедура
пригодна для стандартных исследований, При
выполнении некоторых приложений Beckman
Couter объем образца и/или реагента VersaLyse
может отличаться. В этом случае следуйте
указаниям руководства для конкретного
приложения
При исследовании любого образца необходимо
также проанализировать контрольный образец
(исследуемый образец плюс иэотипический
контроль, кат, Na А077Э4},
1. 8 пробирки для анализа клинических образцов
добавьте по 20 мкл конъюгатое антител JOTest,
а в пробирки дли анализа контропей - по 20 мкп
мотипичеаюго контроля.
2. В пробирки для анализа образца и для анализа
изатипич0Ского контроля добавьте по 100 мкл
образца, Аккуратно пврамешайте на еортексе,
J. Инкубируйте в течение -15 - 20 минут при
комнатной температуре (16 - 26'С) в
защищенном от света месте,
4, Если требуется, выполните лизис эритроцшвв,
следуя рекомендациям изготовителя
лизирующего реагента.
Например, при использовании реагента
VersaLyse (кат № А09777) следуйте
указаниям инструкции к этому реагенту,
Ревдмендует[;ч вылолнсто процедуру «с
одновременной фиксацией» Для этого
добавьте к образцу 1 мл
саежеприготоапанного раствора для фиксации
и лизина. Немедленно перемешайте на
вортекое в течение 1 секунды. Инкубируете 10
минут при «омнатной температуре в
защищенном от света месте.
Если образец не содержит эритроцитов,
добавьте 2 мл PBS.
5, Отцентрифугируйте в течение 5 минут при
150 X g при комнатной температурб.
6, Удалите супернатант аспирацией.
7, Ресуспендируйте осадок клеток в 3 мл PBS,
8, Повторите шаг 6,
9- Удалите супернатант аспирацией и
ресуспендируйте клетки:
- в 0,5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором
формальдегида, если лойпитовленная проба
будет хрантъся от 2 до 24 часов. (Данный
раствор можно получить разведением 12.5 мкп
реагента SOTest 3 Fixatwe Solution (кат. N9
А07а00) в 10-кратной концентрации в 1 мп
PBS.)
- в 0.S или 1 мл PBS без формальдегида, если
подготовленная проба будет
проанализирована в течение 2 часов.
ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа
подготаеки, подготобланные пробы необходимо
хранить при температуре 2 - 8°С в защищенном
от свата месте.
2/4 А07735СЕ С 2D0S-12-05
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Копичвстао Среднее CV 3. Для получения точных и воспроизводимых
СПЕЦИФИЧНОСТЬ Лимфоциты образцоэ (%) SD (%) результатов необходимо соблюдать все
приведенные инструкции и следовать
Моноклональные антитела (мАт) UCHT1
окрашивают Е-цепь комплекса CD3 (4). CD3+ 50 6.9 10 нормам лабораторной работы
В 1982 г, на Первом международном рабочем CD16+/a6+ 60 8.86 4.2S 4в 4. Антитела денного реагента
откалиброваны для получения наилучшего
совещании по дифференцировочным
антигенам лейкоцитов человека в Париже, CD37 50 8.39 3.8В 46 соотношения специфического и
Франция, было подтверждено, что мАт CD16+/CD5S+ неспецифического сигнала. Поэтому в
каждом исследовании необходимо строго
>■ UCHT1 направлены против CD3 (WS Code: 3,
дозировать указанный обьем реагента с
SecVon Т) (5).
В 1989 г. На Четвертом мевдународном ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ учетом количества клеток в образце.
рабочем совещании по ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ 5. При гиперлейкоцитозе разведите образец
- дифференцировочным антигенам лейкоцитов В один день на одном цитометре PBS так, чтобы получить примерную
человека в Вене, Австрия, было определялось процентное содержание концентрацию лейкоцитов 5х 10 /л.
подтверждено, что мАт 3G8 направлены окрашенных положительных клеток целевой 6-При некоторых заболеваниях, таких как
против CD16 (WS Code; 409, Section NL) (6). популяции (лимфоцитов). Измерение тяжелая почечная недостаточность или
выполнялось 12 раз. Полученные гемоглобинопатии, лизис эритроцитов
В 1989 г. На Четвертом международном
результаты суммированы в следующей может происходить медленно, не
рабочем совещании па
таблице: полностью или совсем не происходить. В
дифференцировочным антигенам
этом случае перед окрашиванием
лейкоцитов человека в Вене, Австрия, было
подтверждено, что мАт N901 (NKH-1) Положительные Количество Среднее CV рекомендуется выделить мононуклеарные
направлены против CD56 (WS Code; 9, Sec­ лимфоциты измерений (%) SD (%) клетки в градиенте плотности (например,
фикола).
tion NL) (7).
CD3+ 12 70,66 0-Вг 0.9
CD16+/S6+ 12 24 44 0.74 3.0
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Для проверки линейности окрашивания В приложении приводится список литературы
данным реагентом были в различных и примеры диаграмм,
МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ
пропорциях смешаны положительные клетки
ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ
~ HUT7B (положительные по CD3), GRANU
В один день на двух цитометрах двумя ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
(положительные по CD16), М07Е
лаборантами определялось процентное Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS,
(положительные по CD56) и отрицательные
содержание окрашенных клеток целевой EXPO, Flow Set, lOTest, System II, XL
кяет«и -эритроциты (отрицательные по CD3
популяции (лимфоцитов). Измерение являются зарегистрированными торговыми
и CD56) и клетки пинии FRN 17.4.14.33
выполнялось 12 раз. Полученные знаками компании Beckman Couller Inc.
(отрицательные по CD16). Общее
результаты суммированы а следующих
количестео клеток в образце оставалось
таблицах: BD FACScan и BD LYSYS II являются
постоянным- Соотношение положительных и
зарегистрированными торговыми знаками
отрицательных клеток изменялось от О до
Цигометр # 1 компании BD Blosclences and Conipany.
100%.
Аликвоты были окрашены в соответствии с Положительные Количество Среднво CV
описанной выше методикой. На основании лимфоциты измерений (%) SD (%)
ИЗГОТОВЛЕНО:
полученных и ожи^цаемых значений
CD3+ 12 70.66 0.62 0.9 IMMUNOTECH
вычислялась линейная регрессия.
a Beckman Coulter Company
CD16+/5S+ 12 24,44 0.74 3.0
130 avenue de Lattre de Tasslgny
Маркер Линейная Линейность (R^) B.P. 177 - 13276 Marseille Cedex Э
регрессия Цитометр # 2 France
CD3 Y = 0.srX+1.J0 0.99S Положительные Количество Среднее CV Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
CD16 Y = 0.eaX + 0.31 0.Э99 лимфоииты измерений (%) SD (%)
WWW.beckmancoulter.com
CD56 Y = 0.97 X +0,65 D.99S срз^- 12 71.В7 3.50 4.9
CD16+/5S+ 12 21.32 2.07 Э.7 ^BECKM AN
COUUER.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Каждая лаборатория должна определить
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
собственные диапазоны нормальных
1, При неправильной настройке
значений на основании исследования
цитофлуориметра, неверной компенсации
образцов нормальных доноров местной
флуоресценции и неправильном
популяции. При этом следует учитывать
расположении регионов могут быть
возраст, поп и этническую принадлежность
получены недостоверные ре»ультаты.
доноров, а также другае местные
2, Рекомендуется выполнять лизис
особенности населений.
эритроцитов с отмывкой, поскольку
В наших лабораториях с использованием
данный реагент не оптимизирован для
данного реагента было проведено
процедуры без отмывки.
исследование образцов 50 взрослых людей.
В следующей таблице представлены
^ результаты подсчета положительных
событий:
3/4 A07735CE„C 2005-12 05
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № A0773S
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двупараметровые диаграммы (интенсивность 1. Cooper, М. et а!., « The biology of human natural killer-cell subsets »,
флуоресценции - интенсивность флуоресценции), полученные при 2001,Trends immuno 22,633-640.
анализе лизираванного образца нормальной цельной крови. Для 2. Robertson, M.J., and RUz, J. « Biological and clinical relevance of
окрашивания использовались коньюгаты антител lOTest CD3-FITC / human natural killer celts », 1990, Blood, 76, 2421-2438.
(CD16+56)-PE (кат. № А07735). Выполиялоо. выделение
3. Lanier, L.L., Chang, C,, Azuma, М., Ruitenberg, J.J., Hemperly, J.J.,
лимфоцитов программными федст^ами. Окрашивание
Phillips, J.H., "Molecular and functional analysis of human riaiural
иэотипическим контролем IgGI-FITC/lgGI-PE Сс мышиным IgGI),
killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CP66)",
кат. Мя А07794. не показано.
1Э91, J. Immunol.. 146, 4421-4426.
4. Tunnacliffe, A., Olsson, C., TraunecKer, A,, Krissansen, G.W., Kar-
Диаграмма 1. Считывание и анализ данных выполнены с помощью jalainen, K., De la Hera, A., "The majority of CD3 epitopes are con­
проточного цитофлуориметра COULTER® EPICS'* XL''“ в ferred by the £ chain", 1989, Leucocyte Typing IV, White Cell Differ­
программном обеспечении System II™. entiation Antigens. W, Knapp, et al„ Eds., Oxford University Press,
295-29S.
LYMPHDCYTES 5. Me Michael, A.J., Gotch, F.M., "T-cell antigens: new previously
defined clusters", 1987, Leucocyte Typing III, White Cell Differentia­
tion Antigens, A.J, McMichael, 30-62.
6. Schmidt, R.E,, Perussia, B,, "Cluster report: CD16", 1989, Leuco­
cyte Typing IV, White Cell Differentiation Antigens. W. Knapp, et al,
Eds,, Oxford University Press, 574-578.
7. Schubert, J., Lanier, L.L., Schmidt, R.E., "Cluster report: CD56",
1969, Leucocyte Typing IV, White Cell Differenilation Antigens. W.
Knapp, et al., Eds., Oxford University Press, p. 699-702.
свэ-ггтс
Диаграмма 2. Считыван1ие данных выполнено с помощью
проточного цитофлуориметра Becton Dickinson FACScan™. Для
анализа данных использовалось программное обеспечение LYSYS
||ТМ
|.УМРНаСУТЕ5
£ ■л
li
г
■S'
г 1^3 1<Н
4/4 А07735СЕ С 2005^2-05
' lOTfiSt^ РУССКИЙ Спецификации Спецификации
компонента 1 компонента 2
IgGI-FITC/
Специфичность Непримвнигио Непригиенимо
lgG1-PE
Кпон 679.ШС7 679.1Мс7
Изотипический
Гибридома P3-X63-Ag.8.653 X Ва!Ыс Р3-Х63-Ад.8.653 X Ва1Ь/с
контроль
Иммуногвн Небиологический гаптен Небиологический гаптен
fREF] А07794
Иммуноглобулин igGi IgGi
50 определений; 1 мл
’.20 мкл I определение Вид Мышь Мышь
Источник Асцит Асцит
^ ВЕСКИМ
CjQUafR. Очистка Аффинная хройлатография на белке А Аффинная хроматография на белке А
'VOTtsI
Флуорохром Флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТ1Ц) R-фикоэритрин (ФЭ)
Конъюгированные антитела
X возбуждения 488 нм 43Й нм
ш С€ Пик эмиссии 525 нм 575 нм
Буф^р ФСБ pH 7,2 плюс2 мг/МП БСА и 0,1% fvlaNj
ПРИМЕНЕНИЕ окрашивания. Чтобы оценить реальное значение этого ОБРАЗЦЫ
Данная смесь мышиных изотипичвсш конгролей положительного окрашивания, необходимо учесть Венозную кровь или образцы костного мозга собирают
IgGl-PITC/lgGI-PE из серии реантиаов lOTest может вклад неспецифической фиксации в уровень а стерильные пробирки, содержащие соль ЭДТА в
ислольэомться дли анализа образцов крови человека измеряемого сигнала (1,2). качестве антикоагупянта. Использование других
с пойащью проточной цитоиетрии. Реактив пмвопяет Данная смесь изотипических контрслей из серии антикоагулянтов не рекомендуется.
оценить долю неспецифического окрашивания реактивов lOTest служит для определения Образцы следует хранить при комнатной температуре
лейкоцитов или троибоцитов й помощью комбинаций неспецифического окрашивания моноклональными (18-25'С), не встряхивая. Перед забором аликвоты
специфических антител изотипа IgSI, антителами того же изотипа, конъюгированными с для исследовании образец следует перемешать путем
конъюгированкык с ФИТЦ или ФЭ, из серии lOTest. флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) и петого встряхивания пробирки, чтобы обеспечить
R-фикаэритрином (ФЭ), из серии реактивов (OTesl
ПРИНЦИП При специфическом окрашивании фаницу иежду однородное распределение клеток по объему.
Данный тест основан на способности специфичесхих отрицательными и положительными собьпиями Образцы подлежат анализу в течение 24 часов после
моноклональных антител связываться с антигенными следует устанавливать для каждой исследуемой венепункции.
дйтврминеигами, которые зкспрессированы популяции в лависимости от сигнала, получаемого с МЕТОДИКА
пей«оц^(тани и тромбоцитами. изотопическим контролем. НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ
Специфическая окраска осуществляется путем ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ ВХОДЯЩИЕ В комплект поставки
инкубации образца со специфическим реактивом
lOTesi. После этого эритроциты лизируют, а Жидкие конъюгаты до и после вскрытия флакона • Пробирки для образцов и материалы для забора
пайкоцкты или тромбоциты, на которые процесс следует хранить при температуре от 2до8“С в образцов,
лизиса не оказывает воздействия, исследуют методом защищенном от света месте. • Айтонатические пипетки и одноразовые
проточной цитометрии. Стабильность а невскрытом флаконе: см. срок наконечники вместимостькг 20,100 и 500 мкл.
Протечный цитометр измеряет рассеивание света годности на флаконе. • Пластиковые пробирки для гемолиза.
клетками и их флуоресценцию. Он позволяет Стабильность лосле вскрытия флакона: реактив • Калибровочные микросферы: Флуоросферы
устанавливать фаницы целевой популяции клеток сохраняет стабильность в течение 90 дней. Flow Set™ Fluorospheres (Ref, 6607007).
внутри электронного о*на, задаваемого на МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ • Реашв для лизиса эритроцитов с отмывкой после
гистограмме, которая соотносит рассеивание света лизиса. Например: VersaLyse™ (Ref. А03777).
1. Не используйте реактив после иаечения срока
под прямым углом (боковое рассекание • Side Scatter • Реактив для фиксации лейкоцитов. Например:
годности.
или SS) с рассеиванием света под малым углом IOTe.st 3 Fixative Solution (Ref, A07800),
2. Не замораживайте.
{npRMoe рассеивание - Forward Scatter или FS)- На • Специфическая комбинация антител,
3. Перед исполмованиеи доведите температуру
этапе гейтинга можно воспользоваться и другими конъюгированных с ФИТЦ и ФЭ, из серии
реактива до комнатной (18 ^ 25°С).
гистограммами, которые содержат по два раапичных реактивов tOTest.
4. Минимизируйте воздействиа света,
параметра, рвмерлемых цитометром, в зависимости • Буфер (ФСБ: 0,01 М фосфат натрия; 0,145 М
5. Избегайте микробного загрязнения реактивов во
от приложения, избранного пользователем. хлорид натрия; pH 7,2).
избежание ложных результатов,
Гистограмма FS versus SS позволяет исключать из • 14ентрифуга,
6. Растворы антител, содержащие азид натрия
рассмотрения фрапаанты разрушенных клеток, а (NaNs), требуют осторожного обращения. Не г Автоштический встряхиватель (типа УоПех).
таюкв отличать лимфоциты от моноцитов и принимайте вг^утрь и избегайте попадания на кожу, • Проточный цитометр.
попиморфноядерных лейкоцитов. Окно наюппвния
слизистые оболочки и глаза. процедура
сигизла, ограничивающее целевую популяцию, Кроме того, в кислой среде из азида натрия может Примечание; Описанная ниже процедура
используется для создания монопараметричесиой
образоваться потенциально опасное соединение действительна для станрартных приложений. Для
гистограммы, которая соотносит число собыгий с
азотистоводородная кислота. Во избежание ряда приложений Beckman Coulter объемы образца и
флуоресценцией выделенных таким образом клеток
накопления взрывоопасных производных азида реактива VersaLyse могут различаться. В таких
или тромбоцитов. Такой анализ позволяет отличить
натрия на поеерхности металлических труб случаях необходимо следовать инструкциям,
положительно тртенны$ события от событий, рекомендуется перед удалением реактива в приведенным в описании приложения.
рассматривающихся как неокрашенньге. Результаты
отходь! развести его большим объемом воды, а Для каждого анализируемого образца помимо тест-
выражают в виде доли флуоресцирующих клеток в
затем слить в сток. пробирки требуется одна контрольная пробирка.
процентах от общего числа событий,
7. Все образцы крови следует рассматривать как Данная смесь изотипичестих контролей,
, зарегистрированных при помощи электронного окна.
потенциально инфицированные и принимать IgGI-FlTC/lgGI-PE (Ref.A07794) адаптироаана для
ЛРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКИХ соответствующие меры лрвдосторожнести использования с соответствующими комбинациями
ПРИЛОЖЕНИЙ (работать в защитных перчатках, халатах и очках), ФИТЦ- и ФЭ'КОншгироааиных антител серии SOTesi.
Стадии дифференцировки гемопоэтических клеток 8. Запрещается набирать раствор в пипетку ртом. 1. В каждую тест-пробирку добавляют по 20 ми
' характеризуются наличием или отсутстеиеи Следует избегать лопэдания образцов на кожу, специфического конъюгированного антитела
§ксчрессии поверхностны* антигенов, которые можно слизиаые оболочки и глаза, lOTest, а в каждую контрольную пробирку-по
идентифицировать с помощью моноклональных 9. Для удаления в отходы пробирок из-под образцов 20 мкл данной смеси изотипических контролегЧ.
антител, имеющих четко определенную крови, а тайке одноразовых материалов, 2. В тест-пробирку и контрольную пробирку вносят по
специфичность. Одной из трудностей, с которыми использованных при обработке образцов, их 100 мкл образца. Осторожно встряхивают
сталкиваются при анализе таких антигенов методами помещают в специальные контейнеры и пробирки на приборе Vortex.
проточной цитонетрии, является более или менее направляют на сжигание. 3. Инкубируют в течение 15 - 20 мин при комнатной
выраженная неспецифичсскзя фиксация конъюгатов температуре (18-25“С) в защищенном от света
специфических моноклональных антител в процессе месте.
1/3 I-A07794 2006-12-01 RU
4. Затем производят лимс эритроцитов, при Результаты, попученнъ|е для lgGI-ФЭ. обобщены в
OTpHuaTenbHbiB Число СИФ SD CV
необходимости пользуясь рекомендациями по следующих таблица*:
целевые {%)
использованию реатва для лизиса. Лимфоциты Цитоматр №1;
Например, если используется VersaLyse 1 : 1 3 0,12В 0,002 1,4 Отрицательные Число СИФ SD CV
(Ref А0Э777), следует обратиться к листку- 1 :3 3 0,12'5 0,003 2,0 целевые (%)
вкладышу и рекомеьщуегся воспользоваться 1 : 10 3 0,124 0,0021 1,Б lgG1" 12 0,15 0,001 0.7
процедурой «с одновременной фиксацией», лимфоциты
Отрицательные Число СИФ SD CV
которая састоит в добавлении 1 мл смеси целвэыв <Ю IgCr 12 0,30 0,007 2,2
Tix-and-Lyse” приготовляемой ех tempore. Моноциты______ Моноциты
Немедпенно встряхивают на Vortex в течение 1 :1 0,250 0,006 2,2 lgGl“ 12 0,46 0.D05 1,0
одной секунды, а затем инкубируют в течение 1 ;2 0,245 0,005 1,9 Гр анулоциты
1D мин при комнатной температуре в лащищенном 1 : 10 0,297 0,015 5,0 Цитометр Na2:
от света м we.
's. д Е [^ о с н б л т а и р в и л ф яю О уг б т а р 2 р а у з м е ю л ц т Ф в С Б н т . е е ч ени со е д 5 е р м ж и и н т у т пр зр и и т 1 р 5 о 0 ц g и т п о р в и , О Г ц 1 р е т : а л 1 р н е и у в ц л ы а о т е ц е й л т ь ы ные Число 0 С ,2 И 9 Ф 4 0, S 0 D 05 ( C 1 % , V 6 ) О л ц Ig и е т G м л р е и ф l^ в ц о ы а ц т е и е т л ы ьные Чи 1 с 2 ло С 0, И 2 Ф 7 0, S 0 D 04 ( C 1 % , V 3 )
комнатной температуре. 1 : 2 0,272 0,021 7,7 lgG1“ 12 0,46 0,012 2,5
6. Удаляют супернатант аспирацией. 1 :10 0,280 0,001 0,5 МОНОЦ147Ы
7. Ресуопендиругат платочный осадо» в 3 мл ФСБ. lgGi“ 12 0,61 0,005 0,6
6. Повторяют этап 5. В НУТРИЛАБОРАТОРНАЯ Г ранулрциты
9. Удаляют супернатант аспирацией и ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
ресуспандируют осадок клеток, используя для Реактивом, описанным выше, был обработан образец
этого. крови здорового взрослого челонеха. Результаты 1. Проточная цитометрия может дать ложные
- 0,5 мл или 1 мя ФСБ, содержащего 0,1% 12 вылолненны* в течение сщного и того же дня с результаты, если цитометр идеально не
формапьдегхда, если препараты предполагается иогюльзоаанием одного и того же цитометра юстирован, рассеивание флуоресценции
хранить в течение 2-24 часов. (ФСБ, содержащий измерений средней интенсивноаии флуоресценции правильно не скомпенсировано, а области
0,1% формальдегида, можно получить rtyreM (СИФ) 1дС14|ИТЦ-отрицатвпьны* (неокрашенных) тщательно не установлены.
разведения 12,5 ыкл фиксирующего раствора событий проанализированы в следующей таблице: 2. Предпочтительно использовать метод лизиса
lOTest 3 Fixative Solutiofl (Rsf. A078QQ), имеющего
концентрацию 10Х, в 1 мл ФСБ.) Отрицательные Число СМФ SD CV реактив не оптимизирован для методов лизиса без
* 0,5 мл или 1 мл ФСБ без формальдегида, если целевые (%) отмывки.
препараты предполагается анашаироаать в I л g и G мф I” оциты 12 0,17 0,002 1.0 3, Точные и воспроизводимые результаты
течение 5лиж$^чх 2 часов. |0СГ 12 0,69 0,010 1,5 получаются, если использованные процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех случаях препараты Моноциты выполняются е соответствии с требованиями
следует хранить при температуре от 2доВ”С в IgGr 12 0,$3 0,013 1,6 прилагаемой инструкции и стандартами
защищенном от света месте. Г ранулоциты надлежащей лабораторной практики.
Результаты 12 «мерений средней интенсивное™ реактива откалибровано таким образом, чтобы
ПАРАМЕТРЬ! флуоресценции (СИФ) lgGI-ФЭ-отрицательных обеспечить наилучшее отношение специфического
СПЕЦИФИЧНОСТЬ (неокрашенных) событий проанализированы в сигнала к неспецифическому. Поэтому важно,
Моноклональное антитело 679.1 Мс7, принадлежащее следующей таблице: чтобы соотношение объемов реактива и образца
к подклассу изстипа IgGI, не связывается при каждом определении было одниш и тем же.
специфи'^впи ни с одним из дифференцировочных Отрицательные Число СИФ SD CV 5. В случае лейкоцитоза кровь следует разводить
антигенов, присутствующих на поверхности иелевые (%} ФСБ приблиаительно до концентрации
IgGI’^ 12 0,16 0,001 0,7
лейкоцитов человека. лигй4юциты 5 к 10“ лейкоцитов в 1 л.
СТОЙКОСТЬ IgGI- 12 0,30 0,007 2.2 6. При таких заболеваниях, как тяжелая почечная
ЧтоБы проверить стойкость неспецифического Моноциты недостаточность или гемоглобинопатия, лизис
IgGI” 12 0,46 0,005 1,0 эритроцитов может идти медленно и быть
окрашивания нормальной цельной крови данным
Г ранулоциты неполным или даже невозможным, 8 этом случае
реактивом, использовали его двукратное и
рекомешуется выделять мононуклеарные клетки с
десятикратное разведения, а препараты готовили
МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ использованием градиента плотности (например,
согласно вышеописанной процедуре.
ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ Ficoll), а затем окрашивать их.
Результаты игмерений средней интенсивности
В течение одаого и того же дня с использованием
флуоресценции (СИФ) окрашенных lgGI-ФИТЦ
лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов приведены в одной и той же целевой популяции неокрашиваемы* РАЗНОЕ
клеток {лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов) было
следующих таблицах: Примеры (Examples) и ссылки (References) смотрите в
выполнено 12 измерений средней интенсивности
Приложении (Appendix),
флуоресценции (СИФ) отрицательных событий
Отрицательные Число СиФ SD CV
целевые (%) силами двух лаборантов; препараты псщверглись
Лимфоциты анализу на двух различных цитометрах. Резупьтаты, ТОРГОВЫЕ МАРКИ
1 : 1 3 0,119 0,000 0.0 полученные для lgGI-ФИТЦ, обобщены в следующих Логотил компании бесклчал Coulter и назаания
1 : 2 3 0,119 0,002 1,7 таблицах: COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Set, lOTesi, Sysleni II,
1 : 1Q 3 0,119 0,001 0,5 VersaLyse и XL явпяк)тся зарегистрированными
Цитометр №1;
торговыми марками компании Bedcman Coulter Inc.
Отрицательные Число СИФ SD CV
Отрицательные Число СИФ SD CV
целевые (%)
целевые (%) BD FACScart и BD LYSYS H являются
Моноциты
1 : 1 3 0,435 0.006 1.9 IgGI" 12 0,17 0,002 1,0 зарегистрированными торговыми марками компании
1 :2 3 0,511 0,003 0,7 лимфоциты ВО Biosciences and Company,
igGi^ 12 0,69 0,010 1,5
1 :10 3 0,576 0,011 1,7
Моноциты
Отрицательные Число СИФ SD CV IgGi- 12 0,83 0,013 1,6 ИЗГОТОВИТЕЛЬ:
целевые т Г ранулоциты IMMUNOTECHSAS
Г оаиулоциты а Beckman Coulter Company
Цитометр №2:
1 : 1 3 0,609 0,009 1,5 130 avenue de Laltra de Taseigny
1:2 3 0,BS6 0,013 2.1 Отрицательные Число СИФ SD CV B.P. 177- 13276 Marseille Cede* В
1 : 10 3 0.665 0,026 3,7 целевые {%) Франция
lgGl“ 12 0,27 0,003 1,0 Отдел обслуживания клиентов: (33) 4 91 17 27 27
Результаты измерений средней интенсивности лимфоциты
флуоресценции (СИФ) окрашенных lgGI-ФИТЦ IgGl” 12 0,70 0,008 1,2 www.beckmancou Iter.com
пимфо1^гов, моноцитов и фанупоцитов приведены в MOHOUHTbi
следующих таблицах: leGl” 12 0,В1 0,006 0,6
Г ранулоциты
соиовг
2/3
1-А07Г94 2006-12-01 RU
РУССКИЙ Спецификации
lOTEst*
Специфичнйсть Неприменимо
lgqi-FITC
Клон 679. Шс7
Изотипический контроль Г ибридомэ Р3-Х63-Ад.8,б53 х: Ва1Ь/с
Иммуноген Небиологический гаптеи
,"'рЁК] А07795
100 определений; 2 мл
20 мкл / определение Иммуноглобулин №1
Вид Мышь
_______________ C B O E W C E KM K A . N __ Источник Асцит
Очистка Аффинная хроматография на белке А
KJTfst
Конъюгированное антитело
Флуорохром Флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ)
IVD С€ X возбуи<Двиия 48S нм ^
Пик эмиссии 525 нм
Буфер ФСБ pH 7.S плюс 2 мг/ мл БСА и 0,1% NaNj
ПРИМЕНЕНИЕ рклад иеспелифической фиксации в уровень для исспедоаани.я образец следует переме1ьать путем
Данный мышиный изогипйчеокий контроль lgG1-FITC измеряемого сигнала (1, 2]. легкого встряхивания пробирки, чтобы обеспечить
из серии реактивов lO IVsi может использоваться для Данный изотипический контроль из серии реактивов однородное распределение клеток по объему.
диализа образцов крови человека с помощью lO'losi служит для определения неспецифического Образцы подлежат анализу в течение 24 часов после
проточной цитометрии. Реактив позволяет оценить окрашивания моноклональными антителами того же венепункции
долк1!неспецифического окрашивания лейкоцитов или изотипа. конъюгированными с фпуоресцеин- МЕТОДИКА
тромбоцитов с помощью специфических антител изотиоцианатом (ФИТЦ), из серии реактивов 10'l c.st. НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ
иэатта IgG). конъюгированньа с ФИТЦ, из серии При специфическом окрашивании границу между ВХОДЯЩИЕ В КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИ
КУГйЁ1, отрицательными и положитегьными событиями
спедуат устанавливать для каячой исследуемой » Пробирки для образцов и материалы для забора
ПРИНЦИП популяции в зависимости от сигнапа, получаемого с образцоб-
Данный тест ссиован на способности специфических изотипическим контролем, • Автоматические пипетки и одноразовые
моноклональных антител связываться с антигенными наконечники вместимостью 20, ЮО и 500 мкл
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
детерминантами, которые экспрессированы » Плэстиковь1е пробирки для гемолиза,
лейкоцитами и тромбоцитами. Жидкие конъюгаты до и лосяе вскрытия флакона » Калибровочные микросферы Флуоросферы
Специфическая окраска осуществляется путем следует хранить при температуре от 2до8"С в F!ow-Set™ FliioroEpheres (Ref. 660700/)
инкубации o5pad4a со специфическим рвактиаом защищенном от света месте. • Реактив для лизиса эритроцитов с стмывксй после
lOTcsi, После атого эритроциты лизируют, а Стабипьностъ в невскрытом фпаконе: ом, срок Лизиса Например: Vers3Lyse'“ (Ref. А09777).
лейкоциты или тромбоциты, на которые процесс годности на флаконе. • Реактив для фиксации пейкоцигае. Например:
лизийа не оказывает воадействия, исследуют методом Стабильность после вскрытия флакона: реактив 1(>Тея1 ;j Fixellue Solution (Ref. AC780D)
проточной цитометрии. сохраняет стабильность в течение 90 дней. • Специфические антатвла. кокъюг»^рованные с
Прсттный цитометр измеряет рассеивание света МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ФИТЦ, из серии реактивов lOTcst.
клетками и их флуоресценцию. Он позволяет 1. Не используйте реактив после истечения срока • Буфер {ФСБ: 0,01 М фосфат натрий. 0145 М
устакавпиаать границь! целевой популяции клеток годности. хлорид натрия: pH 7,2).
внутри электронного окна, задаваемого на
2. Не замораживайте. • Центрифуга.
гистограмме, которая соотносит рассеивание света
3 Перед использованием доведите температуру • Автоматический встряхиватепь (типа Vortex;,
под прямым углом (боковое рассеиввиие - Side Ststler
реактива до комнатной (Ifl - 25“С). • Проточный цитометр.
ипи S3) с рассеиванием света под малым углем
4. Минимизируйте во?дэйст0ие света, ПРОЦЕДУРА
{прямое рассеивание™ Fonward Scatter или FS), На
5. Избегайте микробного загрязнения реактиаоа so
этапе гейтинга можно воспользоваться и другими Примечание: Описанная ни»<е процедура
избежание ложных результатов.
гистогреммам!!, которые содержат по два различных действительна для стандартных приложений Для
6. Растворы антител, содержащие азид натрия
параметра, измеряемы* цитометром, в зависимости ряда приложений Seckman Coulter объемы образца и
(NaNj), требуют осторожного обращения. Не
от приложения, избранного пользователем. реактива VersaLyse могут различаться, 3 таких
принимайте внутрь и избегайте попадания нв кожу,
Гистограмма типа FS versus SS поззопяет исключать случаях необходимо следовать инетрукцикм,
слизистые оболочки и глаза
из рассмотрения ойпом кпетон, а также отличать приведенным в описании приложения.
Кроме того, а кислой среде из азида натрия может
лимфоциты от моноцитов и полиморфноядерных Для хаждого анализируемого образца помимо тест-
образоваться потенциально опасное соединение
лейкоцитов. Окно накопления сигнала, пробирки требуется одна контрольная пробирка
азотистоводородная кислота. Во избежание
офанкчивающве целевую популяцию, используется Данный изотипический контроль, IgGl-FlTC
накопления взрывоопасных производных азида
для создания манопараметрической гистограммы, (Ref А077Э5), адагтирован для исполпзоаания с
натрия Ий поверхности металлических труб
которая соотносит число событий с флуоресценцией ФИТЦ-конъюгированными антителами серии Kno.si,
реконеедуется перед удалением реактива в
выделенны:( таким образом клеток или тромбоцитов. 1. В каждую тест-пробирку добавляшт по 20 мкл
отходы развести его большим объемом воды, а
Такой анализ гозволяат отличить положительно специфического конъюгированного антитела
затем слить в сток.
окрашенные собьция от событий, рассматривающихся lOTcsi, а в каждую контрольную пробирку-по
7. Все образцы крови следует рассматривать как
как неокрашенные. Результаты выражают а виде доли 20 мкл данного изотипического контроля
потенциально инфицированные и принимать
флуоресцирующих клетск в процентах от общего lgGl-FlTC,
соответствующие меры предосторожности
числй событий, зарегистрированных при помощи 2, В тест-пробирку и контрольную пробирку вносят
(работать в защитных перчатках, халатах и очках),
электронного окна. по 100 мкл обрал^а. Осторожно встряхивают
8. Запрещается набирать раствор в пипетку ртом.
пробирки на приборе Уолех.
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКИХ Следует избегать попадания образцов на кожу,
3. Инкубируют 9 течение 15-20 мин при комнатной
'■ПРИЛОЖЕНИЙ слизистые оболочки и глаза,
температуре (1В-26”С) в защии^енном от света
Ттадки дифференцироаки гемопсотических «леток S. Для удаления в отходы пробирок из-лад образцов месте.
хврактеризуются наличием ипи отсутствием крови, а также одноразовых материалов, 4, Затем производят лизис эритроцитов, при
экспрессии поверхностных антигенов, которые можно использованных при обработке образцов, их необходимости пользуясь рекомендациями по
’ идентифицировать с помощью моноклональных помещают в специальные контейнеры и использованию выбранного реалтива для лизиса.
фнтитап, имеющих четао определенную направляют на сжигание. Например, если используется VersaLyse
специфичность. Одной из трудностей, с которыми ОБРАЗЦЫ (Ref. А09777;, следует обратиться к Л1ястку-
сталкиваются при анализе таких антигенов методами Венозную кроаь или образцы юстного мозга собирают вклвдышу и рекомендуется вocпoльзoвaтьc^
проточной цитоыетрии, является более или менее в стерильные пробирки, содержащие соль ЭДТА в процедурой «с одновременной фихсацией»,
выраженная неспецифическая фиксация конъюгатов качестве антиколгулянта. Использование других которая состоит в добавлении 1 мл смес^
специфических моноклональных антител в процессе антикоагулянтов не рекомендуется. Tix-and-Lyse' npHroToanflevoH ex 19!г:р0ге.
окрашивания, Чтобы оценить реальное значение этого Образцы следует хранить при комнатной температуре Немедпенно встряхивают на Vortex в течение
17ологкитйльного окрашивания, необходимо учесть (18--2S'’C), не встряхивая. Перед забором аликвоты одной секунды, а затем инкубируют в течение
1 /3 |^А07795 2006-1£-01__RU
10 мин при комнатной температуре е Отрицательные Чисэто СИФ SD CV ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
защищенном дт света месте. целевые (%) 1. Проточная цитометрий может дать ложные
Если образец не содержит эритроцитов, Гранупоциты результаты, если цитометр идеально не
добавляют 2 мл ФСБ. 1 : 1 0.697 0,02 г,Б юстирован, рассеивание флуоресценции
0.540 0,01 1,0
5. Центрифукруют в течение 5 минут при 15D g при 1 :10 0,737 0.00 0.2 правильно не скомпенсировано, а обгааи
комнатной температуре. тщательно не установлены.
6 Удаляют супернатант зсгирацией. 2 Предпочтительно иопсльзовать метод лизиса
ВНУТРИЛДБОРАТОРНАЯ
7. Ресуспенииругатклеточный оса/юк в 3 мл ФСБ. ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ эритроцитов с отмывкой, поскольку данны'/
S Повторяют этап 5, реактив не оптимизиодвэн для метолоа лизиса без
9. Удаляют супернэтэнт аспирацией и Реашвом, описанным выше, был обработан образец ОТИЫВКИ.
V ресуспендируют осадок клеток- используя для крови здорового взрослого человека. Результаты 3. Точные и воспроизводимые результаты
этого: 12 выполненных а течений одного и того же дня с получаются, если использованные лроцелуры
- 0,5 ил ипи 1Ш1 ФСБ, содержащего 0,1% использованием одного и того же цитометра выполняются в соответствии с твебоаайиями
формальдегида, если препараты предполагается изллерений средней интенсианостии флуоресценции прилагаемой инструкции и стендартаали
’, хранить в течение 2 - 2Л часов. (ФСБ, (СИФ) отрицательных (неокрашенных) событий надлежащей пабораторной практики.
содержащий 0,1% формальдегида, можно Проанализированы в нижеследующей таблице: 4. Конъюгированное антитело в составе данного
получить путей разведения 12,5 мт реактива откалиброаано таким образом, чтобы
фиксирующего раствора Ю Гс.ч13 Fixative Solution Отрицательные Число СИФ SD I CV обеспечить наилучшее отношение специфического
целевые !%)
(Ref. А07800), имеющего концентрацию 10Х, в сигнала к неспецифическому. Пoэтo^'y важно,
IgCr 12 0,00 1,3
1 мл<РСБ.) чтобь! соотношение объемов реактива и образца
лилдфоциты
- 0,5 МП ипи 1 мл ФСБ без формальдегида, если |0СГ 12 0,610 0,02 3,0 при каадом определении было одним и тем же
препараты предполагается аналигировзть в Моноциты 5. В случае лейкоцитоза кровь следует разводить
течение ближайших 2 часов. !9G1" 12 0,360 0,01 1,4 ФСБ приблизитЕпано до концентрации
ПРИМЕЧАНИЕ; Во всех случаях препараты Г ранулоциты ......., i _ 5 X 10'’лейкоцитов Е1 л.
следует хранить лри температуре от 2до8°С в 6. При таких заболеваниях, как тяжелая почечная
защищенном от света месте. МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ недостаточность или гемоглоб/нолатия, пизис
ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ эритроцитов может идти кледпемно и бь^ть
ПАРАМЕТРЫ В течение одного и того же дня с использоаанием неполным или даже невозможным. В s^om случае
СПЕЦИФИЧНОСТЬ одной и той же целевой популяции наокрашиааемык рекомендуется выделять мононуклеарны? клетки с
Моноклональное антитело 679.1Мс7, принадлежащее клеток (лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов} было использованием градиента плотности (например,
к подклассу HSOTKina igG1, не связывается выполнено 12 измерений средней интенсивности Ficoll), а затем окрашиэать их
специфичеочи ни с оймшк w дифференцировочных флуоресценции (СИФ) отрицательных соБьлий
антигенов, присутствующих на поверхности силами двух лаборантов; препараты подверглись РАЗНОЕ
лейкоцитов и тромбоцитов человека. анализу на двух различных цитометрах. Полученные Примеры (Examples} и ссылки (References) смотрите в
результаты обобщены в следующих таблицах: Приложении (.Appendix).
СТОЙКОСТЬ
Митометр N“1:
Чтобы проаерить стойкость неспецифического ТОРГОВЫЕ МАРКИ
офашиаания образна нормальной цельной крови Отрицательные Число 1 СИФ SD CV
Логотип компании Beckman Coulter и названия
данным реактивом, использовали его двукратное и целевые (%)
десятикратное рвзаедения, а препарать! готовили igGr 12 0,140 0,00 COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Se;, lO'lbi, System Г,
лимфоциты VersaLyse и XL являются зарегистриро1занными
СОГЛ0СИО вышеописанной процедуре.
Результаты измерений чредней интенсивности 1аС1" 12 0,610 0,02 3,0 ■ 1 торговыми марками компани!' Beckman Coulter inc.
Моноциты
флуоресценции (СИФ) лимфоиитов, моноиитов и
igcr 12 0,S6O 0.01 1.4 BD FACGcan - зарегистрированная торговая марка
гранулоцитов приведены в нижеследующих таблицах; ГранупАЦиты компании BD Bioscienees and Company,
Отрицательные Число СИФ SD CV
целевые {%) Цитомегр №2: ИЗГОТОВИТЕЛЬ;
Лимфоциты
1 1 i 3 0,123 0,00 3,1 Отрицательные ЧиСПС СИФ SD CV IMMUNOTECH SAS
1 г 3 0-123 0,00 го;&“ иелввые (%) a Beckrnan Coiiller Company
IQ 3 0,126 0,DO 1.4 IgGl^ 12 0,240 0,00 1,2 130 avenue de Lattre de Tassigny
лимфоциты S,P. 177- 13276 Marseille Cedex9
Отрицатепоные Число 1 СИФ SD CV IgGr 12 0,750 0.01 1.4 Франция
ц М е о л н е о в ц ы и е тьг 1 {%} М Ig о s нс r циты 12 0,890 0,01 0,8 Отдел обслуживания клиентов: (33) 4 Si 17 27 27
1 : 1 3 0,565 0.01 г.2 г ранулоциты
1 :2 3 0,591 0,02 3,4 www.beohmancoulter-cosn
1 :10 3 о.эаг 0,01 0,6
BECKMAN
Couatit.
2/3 I-AQ7795 2006-12-01 RU
lOTest® Спецификации
HLA-DR-PE Специфичность HLA-DR
Клон Immu367
I КАТАЛОЖНЫЙ НОМЕР I iM1639
Гибридома P3-X83'Ag,8,653 X Balb/c
100 тестов, г МП
Иммуноген Клеточная линия, трансформированная вирусом Эпштейна-Барра
20 мкл /Т0СТ
Иммуноглобулин IgGI
Ф .
Вид ЖИЗРТНЫХ MЬJЩЬ
Источник Асциты
’• lOTtst Способ очистки Аффинная хроматография с иммобилизованным белком А
Конъюгаты антител Флуорохром Фикоэритрин (РЕ)
л аоэбуждения 46в нм
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€
IN VITRO Пик эмиссии 575 нм
Буфер PBS pH 7,2, БСА 2 мг/iwn, 0,1% NaNj
НАЗНАЧЕНИЕ Стабильность реагента в нераспечатанном • Автоматические пипетки с одноразовыми
Данная смесь конъюгированных с флаконе приводится на этикетке флакона. наконечниками на 20, 100 и 50Q мкл.
флуорохромами антител используется для Стабильность реагента в распечатанном • Пластиковые лробирхи для гемолиза
идентификации и под!^ета в образцах человека флаконе составляет 90 дней, • Калибровочные частицы: фпуоросферы Flow-
клеток, экспрессирующих антиген HLA-DR. Для Set™ (каталожный номер 6607007),
анапига используется метод проточной ВНИМАНИЕ
• Реагент для лизиса эритроцитов (с
цитомвтрии. 1, Не используйте реагент с истекшим сроком предусмотренной стадией отмывки после
Реагент не предназначен для определения годности. лизиса). Например, лизирующий реагент
тканевой группы HLA-DR. 2, Не замораживайте реагент, VersaLyse™ (каталожный номер Ай9777)
3. Перед использованием реагента необходимо
• Реагент для фиксации лейкоцитов, например
ПРИНЦИП АНАЛИЗА дождаться, пока температура реагента
реагент lOTest 3 Fixative Solution (каталожный
Данный тест основан не способности достигнет комнатной (16- 25'С). номер А07800).
специфических моноклональных антител 4. Воздействие света на реагент необходимо
• Изотипический контроль ЮТеьч.
связываться с антигенными детерминантами, свести к минимуму,
IgGl -PE (каталожный номер А0779в)
экспрессирующимися на поверхности 6. Избегайте контаминации реагента
пейкоцитов, микроорганизмами, в противном случае • Буфер (PBS: 0,01 М фосфат натрия; 0,145 М
При инкубации с реагентом rOTesi происходит возможно получение недостоБерных хлорид натрия; pH 7,2).
специфическое окрашивание лейкоцитов. Затем результатов. • Центрифугэ,
выполняется пизис эритроцитов Интактные 6, Растворы антител, содержащие азид натрия • Миксер (нортекс)
лейкоциты анализируются на проточном (NaNj}, требуют осторожного обращения. Не • Проточный цитофлуориметр,
проглатывайте, избегайте попадания на кожу,
цитофлуориметре.
Проточный цитометр измеряет светорассеянив на слизистые оболочки и в глаза. ПОДГОТОВКА ПРОБ
В кислой среде азид натрия способен
и флуоресценцию клвток. Он позволяет образовывать потенциально опасную взотистс- Замечание: Приведенную ниже процедуру
вылепить (гейтировать) интересующую водородную «ислоту. При утилизации можно использовать при работе со
популяцию на диафамме, отображающей соединений азида рекомендуется смывать их стандартными приложениями. Для выполнения
светорассеяние е боковом направлении (Side в водопроводно-канализационную систему некоторых приложений компании Beckman Coul­
Scatter или S3) и светорассеяние в прямом большим количеством проточной воды. Эти ter могут использоваться другие обьемы
направлении (Forward Scatter или FS), Для меры предосторожности позволят избежать образца и/или реагента VersaLyse. При работе с
гейтирования популяций также можно накопления азида натрия в металлических такими приложениями следуйте инструкциям,
использовать другие двупарамвтровые трубах и предотврат1лть образование приведенным в руководстве к приложению.
диаграммы в зависимости от используемого
взрывчатых веществ. При исследовании любого образца необходимо
приложении 7. Все образцы крови следует рассматривать подготовить две пробирки: одну для анализа
Затем выполняется анализ флуоресценции как потенциально инфицированные. При образца, а вторую для смеси клеток с
пэйтированньи клеток, позволяющий выявить работе с ними необходимо соблюдать ejcs изотипичвским контролем (каталожный номер
окрашенные и неокрашенные клетки. Результат меры предосторожности (в частности, А077Э6),
представляется в виде процентного содержания использовать защитные перчатки, халат и 1, В пробирки для анвлиза клинических образцов
положительных клеток от всех клеток очки), добавьте по 20 мкл конъюгатов антител lOTest, а
электронного гейта. 3. Никогда не отбирайте образец через пипетху в пробирки дли анализа контролей - по 20 мкл
Конъюгаты HLA-DR-PE можно использовать в ртом. Избегайте контакта образца с кожей, изотипического контроля,
смеси с другими одноцветными реагентагии. слизистыми оболочками и глазами. 2, Добавьте в пробирки по 100 мкл образца.
Рекомендуется использовать реагенты линии 9, После завершения работы пробирки с кровью Аккуратно перемешайте содержимое пробирок
lOTest. и все одноразовые материалы необходимо на вортвксе.
поместить в специальные контейнеры для 3, Инкубируйте в течение 15-20 минут при
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ утилизации, комнатной температуре (1S - 25°С) в
Молекула HLA-DR - это полезный маркер, защищенном от света месте,
использующийся в состава расширенной панели ОБРАЗЦЫ 4, Если требуется. выполните лизис
иммунофенотипирования для идентификации Венозную кровь или образцы костъюго мозга эритроцитов, следуя рекомендациям
определенных лимфопролиферативных необходимо отобрать в стерильные пробирки, изготовителя лизирующего реагента.
' синдромов. содержащие соль ЭДТА в качестве
Например, при использовании реагента
' Анализ экспрессии антигена HLA-DR позволяет антикоагулянта. Использование других VersaLyse (каталожный номер А09777)
охарактеризовать бластные клетки миелоидного актикоагулянгтов не рекомендуется, следуйте указаниям инструкции к этому
происхождения, для которь]х, как правило, Образмы должны )фвниться при комнатной реагенту. Рекомендуется выполнить лизис с
“ наблкздается фенотип HLA-DR*C07'CD45'“ “*- А температуре (19 - 25"C}, Встряхивание образцов одновременной фиксацией. Для этого добавьте
■» в случае лвйкоза с П1пергранупярнь]ми не допускается. Перед отбором аликвоты образец к образцу 1 мл свежеприготовленного раствора
промиелоцитами (подгруппа LAM-M3) следует гомогенизировать, аккуратно перемешав. для фиксации и лизиса 'Fix-and-Lyse”
наблюдается слабая экспрессия маркера HLA- Анализ образцов необходимо выполнить в Немедленно перемешайте содержимое
DR или его полное отсутствие (1). течение 24 часов после отбора. пробирки на вортексе в течение 1 оеку^щы
Инкубируйте 10 минут при комнатной
ХРАНЕНИЕ И СТАЁИЛЬНОСТЬ методикА температуре в защищенном от света месте,
До и после распечатки флакона жидкие НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ 5, Отцентрифугируйте при ког^натной
конъюгаты антител необходимо хранить при МАТЕРИАЛЫ температуре в течение 5 минут при 150 х д.
температуре 2 - 8°С а защищенном от света • Пробирки и материалы для отбора проб. 8. Удалите супернатант аспирацией,
маете.
7, Ресуспендируйте осадок клеток е 3 мл PSS.
1/3 1М1Й39СЕ_А 2005-01-06
АС-05-0085
8 Повторите шаг 5. ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
9. Удалите с/пернатакт аспирацией и Ка)кдая лаборатория должна определить 1, При неправильной настройке
ресуспендируйтв клетки: собственные диапазоны нормальных значений цитофлуоршетра, неверной компенсации
- в 0,3 или 1 мл PBS с 0.1% раствором на основании исследования образцов здоровых флуоресценции и неправильном
формальдегида, если подготовленная проба донороа местной популяции. При этом следует расположении регионов могут быть получены
будет храниться от 2 до 24 часов. {Данный учитывать возраст, пол и этническую недостоверные результаты.
раствор можно получить разведением 12 6 принадлежность доноров, а также другие 2, Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов
икл реагента lOTest 3 Fixative Solution особенности местного населения. с отмывкой, поскольку данный реагент не
(каталожный номер А07800) в 10-кратной В наших лабораториях с использованием оптимизирован для процедуры без отмывки,
концентрации в 1 МП PBS.) данного реагента было проведено 3, Для получения точных и воспроизводимых
- в 0.5 или 1 мл PBS без формальдегида, если исследование образцов 50 взроспьгх людей. В результатов необходимо соблк^дать все
подготовленная проба будет следук:щей таблице представлены результаты приведенные инструкции и следовать
проанализирована в течение 2 часое. подсчета положительных событий. нормативам лабораторной работы.
Замечание: Независимо от способа подготовки, 4 Коньюгаты антител данного реагента
_ подготовленные пробы должны храниться при Количество Среднее CV откалиброваны для получения наилучшего
” температуре 2 - 8'С s защищенном от света месте. Лимфоциты образцов (%) (%) соотношения специфического и
HLA-OR+ SO 3Q.12 10-95 36.37 нвспецифического сигнала. Поэтому а «аждом
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ исследовании необходимо строго соблюдать
соотношение объеме реагента и обьема
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ
образца.
Моноклональные антитела Immu357 распознают ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ
эпитоп мономорфного белка HLA-DR с в один день на одном цитометре определялась 5. При гиперлейкоцитоав разведите образец
молекулярной массой 29 - 33 кДа. содержание положительных кле^ток в образце PBS так, чтобы получить примерную
концентрацию лейкоцитов 5 х 10%.
Система Н1Л (Human Leucocyte Antigen - Общий периферической крови, отобранном у одного
антиген лейкоцитов} - эта название, которое донора. Измерение выполнялось 12 раз. 6 При некоторых заболеваниях, таких как
было присвоено главному комплексу Полученные результаты представлены е тяжелая пачечная недостаточность или
гистосовместимости (МНС) человека, Молекулы следующей таблице: гемоглобинопатии, лизис эритроцитов может
HLA класса II кодируются пятью локусами (DM, происходить медленно, не полностью или
DO, DP, DQ и DR), еходяи|ими в состав D-локуса, Количество Среднее CV совсем не происходить. В этом случае перед
и носят назнамип антигенов HLA-DM, HLA-DO, Лимфоциты изнер0ни1А (%) 5D (%) окрашиванием рекомендуется выделить
HLA-DP, HLA 0Q и HLA-DR (2, 3}. мононуклеарные клетки в градиенте
HLA-DR+ 12 20.01 0.44 2-19 плотности (например, фикола),
Экспрессия антигенов класса II ограничивается
антиген-првзектирующими клетками, то есть
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
В-лимфоцитами, моноцитами/макрофагами, МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ
дендритными клетками и эпителиальными ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ В приложении приводится пример диаграммы и
клетками Лангерганса (3, 4). Т-пимфоцты в один день на двух цитометрах двумя список литературы.
экспрессируют антиген HLA-DR только после специалистами определялось содержание
активации (5). Стволовые клетки и положительных ш1еток в образце ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
гемопоэтические предшественники периферической крови, отобранном у одного Логотип BECKMAN COULTER, Beckman Coutter,
экспрессируют этот антиген до определенной донора. Измерение выполнялось 12 раз. Plow-Set, lOTest и VersaLyse являются
стадии дифференцировки (3, 6). Полученные результаты суммированы в зарегистрированными торговыми знаками
следующих таблицах: компании Beckman Coulter Inc.
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ
Для проверки линейности окрашивания данным Цигометр # 1 ИЗГОТОВЛЕНО:
реагентом быпи в различных пропорциях
смешаны положительные клетки линии DAUD1 и Количество Среднее CV 1MMUN0TECH
отрицательные клетки пинии HPBALL, Общее Лимфоциты измерений (%) SD (%) a Beckman Coulter Company
п ко о л ст и о ч я е н с н т ы во м . к С ле о т о о тн к ош в е ни о е б р п а о зц л а о жит о е с л та ьн в ы ал х а сь и HLA-DR+ 12 20,01 0,44 2.19 B 13 .P 0 , a 1 v 7 e 7 n - u 1 e 3 d 2 e 7 L 6 a t M tr a e r d se e i l T le a s C s e ig d n e y x 9
отрицательных клеток изменялось от О до 100%. France
Цитоматр # 2
Аликвоты были окрашены а соответствии с Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
описанной выше методикой. На основании Количества Среднее CV www.beqkrnaocoulter.com
полученных и ожидаемых значений Лимфоциты измерений (%) SO {%)
вычислялась линейная рвфессия.
HLA-DR+ 12 16.16 0.52 3.21 ^^BEOCMAN
COUUER.
MapK«p Линейная регрессия Линейность (R”)
CD19 Y^ra074X 1,2344 Q.9S93
2УЗ 1М1639СЁ A 2005-01-06
AC-05-0085
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № IM1639
ПРИМЕР ДИАГРАММЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показана двупараметровая диаграмма (светорассеяние в 1. Jenning, C.D., Foon, К.А., "Recent advances in flow cytometry: Applica­
боковом направлении - интенсивность флуоресценции), полученная tion to tne diagnosis of tiematologic matignancy", 1997, Blood, 8, HQ,
при анализе лизированмого образца нормальной цельной крови, 2663-2892,
окрашенного конъюгатами антител [OTest HLA-DR-PE {каталожный 2. Krertsky. A.IVI., "Ttie HLA system, antigen processing and presentation",
номер 1М163Э)- 1997, Kidney interriationai, suppi, SB, 51, 2-7-
На диаграмме показаны все популяции лейкоцитов. 3. Lee, J., Dupont, B,0,, "The HU\ system: An introduction”, 1990, Ttie
Счиггыаание и анализ данных выполнены с помощью проточного Hi-A system: A new approacli, Springer-Verlag. 1-26.
цигтофлуориметра Cytomics FC 500 с программным обеспечением 4. Uckun, F.M., "Regulation of human S-cell ontogeny", 1990, Blood,10,
СХР. 76, 1908-1923,
LEUCOCYTES 5. Kontny, E., Ryzewska, A., "Surface markers on human activated T lym­
phocytes iV. Comparison of high-affmity E-rosette receptor expression
With the expression of other activation markers (receptor for Interleukin
2, MHO class II (antigens)", 1960, Archivum Immunologiae et Ther. Ex-
perimentalis, 38, 421-431
6. Huang, S., Terstappen, L.W.M.M., "Lymphoid and myeloid differentiation
of single human CD34+. HLA-DR+, CD38-hennaiopoietlc stem cells".
1994, Blood, 6, 63, 1515-1526.
(Й
(Л
Ю» 101 |о2 Vo* 10-*
HLA-DB-PE
3/3 IM1639CE„A 2005-01-06
AC-05-0085
lOTest® Спецификации
CD45-APC Специфичность CD45
Клон J33
IКАТАЛОЖНШНОМЁ^ IM2473
Гибридома NS1 X Ва1№
100 тестов; 1 мл
Иммуноген Линия клеток Laz 221
10 мкп / тест
Иммуноглобулин lgG1
©вИЖМЛА!
CaUUER. Вид животных Мышь
Источник Асциты
tOTcst Способ очистки Аффинная хроматография с иммобилизованным белком А
Конъюгаты антител Флуорохром Аллофикоцианин (АРС)
А возбуждения 633 нм
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€
IN VITRO Пик эмиссии 675 нм
Буфер PBS pH 7.2, 6СА 2 мг/мл, 0.1% №N3
НАЗНАЧЕНИЕ Стабильность реагента в нераспечатанном • Автоматические пипетки с одноразовыми
Данная смесь конъюгированных с флаконе приводится на этикетке флакона. наконечниками на 20, 100 и 500 мкл.
флуорохромами антител используется для Стабильность реагента в распечатанном • Пластиковые пробирки для гемолиза.
идентификации и подсчета в образцах человека флаконе составляет 90 дней, • Калибровочные частицы, Например, набор
клеток, экспрессирующих антиген CD-IB. Для реагентов ДРС (676/833) Set-up Ki1
анализа используется метод проточной ВНИМАНИЕ (каталожный номер 6607120)
цитометрии 1. Не используйте реагент С истекшим сроком • Реагент для лизиса эритроцитов (с
годности. предусмотренной стадией отмывки после
ПРИНЦИП ДИАЛИЗА 2. Не замораживайте реагент. лизиса). Например, лизирующий реагент
Данный тест основан на способности 3. Перед использованием реагента необходимо VersaLyse (каталожный номер АП9777).
специфических моноклональных антител дождаться, пока температура реагента
■ Реагент для фиксации лейкоцитов, например
связываться с антигенными детерминантами, достигнет комнатной (18 - 25°С).
реагент [OTest 3 Fixalive Solution (каталожный
экспрессирующимися на поверхности 4. Воздействие света на реагент необходимо
номер AQ7B0D).
пейкоиитов. свести к мииимуму-
• Изотипический контроль IOT?st.
При инкубации с реагентом lOTest происходит 5. Избегайте контаминации реагента
IgGI-APC (каталожный номер IM2475)
специфическое окрашивание лейкоцитов. Затем микроорганизмами, в противном случае
выполняется лизис эритроцитов. Интаюиые возможно получение недостоверных • Буфер (PBS: 0.01 М фосфат натрия; 0,145 М
лейкоциты анализируются на проточнам результатов. хлорид натрия: pH 7 2)
цигофлуоримвтре. е. Растворы агггител, содержащие азид натрия • Центрифуга.
Проточный цитометр измеряет светорассеяние (NaNj), требуют осторожного обращения. Не • Миксер (вортекс).
и флуоресценцию клеток. Он позволяет проглатывайте, избегайте попадании на кожу, • Проточный цитофлуориметр.
на слизистые оболочки и в глаза.
выделить (гейтировать) интересующую
популяцию на диаграмме, отображающей В кислой среде азид натрия способен ПОДГОТОВКА ПРОБ
образовывать потенциально опасную азотисто-
светорассеяние в боковом направлении (Side всйороднун! кислоту. При утилизации Замечание: Приведенную ниже процедуру
S на c п a р tt а e н r п е и н л и и и S (F S o ) rw и a rd с ве S т c о a р t а te сс r ея и н л и и е в F S п ), р я Д мо л м я соединений азида рекомендуется смывать их можно использовать при работе со
в водопроводно-канализационную систему стандартныии приложениями. Для выполнения
гейтирования популяций также можно
использовать другие двупараметровые больщим количеством проточной воды. Эти некоторых приложений компании Beckman
меры предосторожности позволят избежать Coulter могут использоваться другие объемы
диаграммы в зависимости от используемого
приложения. т н р а у и б п а л * е вии и ази п д р а е до н т а в т р р а и т я и ть в ме о т б а р л а л з и о ч в е а с н к и и е х о та б к р и а м з и ц а п и р /и и л л и о ж р е е н а и ге я н м т и а V с e л r е ^ д a у L й y т a е e . и П н р с и т р р у а к б ц о и т я е м с .
Затем выполняется анализ флуоресценции взрывчатых веществ. приведеннь1м в руководстве к приложению,
ГЕЙтированных клеток, позволяющий выявить
7. Все образцы крови следует рассматривать При исследовании любого образца необходимо
окрашенные и неофашанные клетки. Результат
как потенциально инфицированные. При подготовить две пробирки: одну для анализа
представляется в веде процентного содержания работе с ними необходимо соблюдать все образца, а вторую для смеси клеток с
положительных клеток от всех клетои гейта.
меры предосторожности (в част>10сти, изотипическим контролем {каталожный номер
использовать защитные перчатки, халат и 1Ма475)
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
очки). 1. 6 пробирки для анализа клинических образцов
Иэоформы молекулы CD45 в различной степени 8. Никогда не отбирайте образец через пипетку добавьте по Ifl мкл конъюгатов анттел JOTtat, а
эхспрессируются лимфоидными (1-3) и ртом. Избегайте контакта образца с кожей, в пробирки для анализа контролей - по 10 мкл
миелоидными клетаами (4). Уровень экспрессии слизисть|ми оболочками и глазами. изотипическаго хонфоля,
коррелирует со стадией дифференцировки 9. После завершения работы пробирки с кровью 2. Добавьте в пробирки по 100 мкл образца.
клеток. Таким образом, оценка плотности и все одноразовые материалы необходимо Аккуратно перемешайте содержимое пробирок
экспрессии CD45 полезна при выявлении
поместить в специальные контейнеры для на ворп'вксе,
нормальных и зпокачесгеенных лейкоцитов (2, 4-
утилизации, 3. Инкубируйте в течение 1S - 20 минут при
7). В случае острого миелоидного лейкоза
у э р то о м ве у н ь п э р к и с з п н р а е к с у ш и з C ло D к 4 а 5 ч ес н т е в з е н н а н ч ы и е т елен к . л ет П ки о ОБРАЗЦЫ з ко а м щ н и а щ т е н н о н й о м т о е т м с п в е е р т а а т у м р е е с те. (ia - 25°С) в
отличаются от нормальных (8) Более того, в
н
В
е
е
о
н
б
о
х
з
о
н
д
у
и
ю
м о
к р
о
о
т
в
о
ь
б р
и
а
л
т
и
ь в
о бр
с
а
т
з
е
ц
р
ы
и ль
к
н
о
ы
с
е
тн о
п
г
р
о
о б
м
и
о
р
з
к
г
и
а
,
4. Если требуется. выполните лизис
ч случае острого лимфобластного лейкоза уровень эритроцитов, Следуя рекомендациям
содержащие соль ЭДТА в качестве
^ экспрессии CD4S может иметь прогностическое изготовителя лизирующвго реагента.
антикоагулянта. Использование других
значение в отнощении прогрессирования Например, при использовании реагента
антикоагулянтаа не рекомендуется.
заболевания (2, 9). VersaLyse (каталожный номер А09777)
, И наконец, монокпонаг^ьные антитела к CD45 Образцы должны храниться при комнатной следуйте указаниям инструкции к этому
^ позволяют, используя диаграмму, на которой температуре (19 - 25"C). Встряхивание образцов реагенту. Рекомендуется выполнть лизис с
представлено светорассеяние в боковом не допускается. Перед отбором аликвоты образец одновременной фиксацией. Для этого добавьте
направлении и флуоресценция CD45, оценить следует гомогенизировать, аккуратно перемешав. к образцу 1 мл саежепригоговленнога раствора
возможную нелейкоцитарную контаминацию Анализ образцов необходимо выполнить в для фиксации и лизиса "Fix-and-Lyse".
гейта лимфоцитов (10). течение 24 часов после отбора, Немеиленно перемешайте содержимое
пробирки на всртексе в течение 1 секунды.
МЕТОДИКА Инкубируйтч 10 минут при комнатной
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ температуре в защищенном от света месте.
До и после распечатки флахона жидкие
конък:гаты антщ-ел необходимо хранить при МАТЕРИАЛЫ 5. Отцентрифугируйте при комнатной
температуре 2 - 8°С в защищенном от света • Пробирки и материалы для отбора проб-
6.
т
У
е
д
м
а
п
л
е
и
р
те
а т
с
у
у
р
п
е
е
в
р н
т
а
е
т
ч
а
е
н
н
т
и е
а с
5
п и
м
р
и
а
н
ц
у
и
т
е
п
й
р
.
и 150 х д.
месте.
7. Ресуспендируйте осадок клатск в 3 мл PBS-
1М2473СЕ_А 2004-10-13
АС-04-1029
ft, Повторитй шаг 5. В наших лабораториях с использованием ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
9. Удапкте супернэтэнт аспирацией и данного реагента было проведено 1. При неправильной настройке
ресуспецдируйте клетки: исследование образцов 50 взрослых лкздей. В цитофлуориметра, неверной компенсации
в 0,5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором следующей таблице представлены результаты флуоресценции и неправильном
формальдегида, если подготовленная проба подсчета положительных событий, расположении регионов могут быть получены
будет храниться от 2 до 24 часов, {Данный недостоверные результаты.
раствор можно получить разведением 12 5 Количество Среднее CV 2 Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов
Мкп реагента lOTest 3 Fixative Solution Лимфоциты образцов (%) SD (%) с отмывкой, поскольку данный реагент не
(каталожный номер А07600) в 10-кратной CD45+ 50 93 69 4.44 4.7 оптимизирован для процедуры без отмывки.
концентрации в 1 мл PBS,)
3. Для получения точных и воспроизводимых
- в 0.5 или 1 мл PBS без формальдегида, если ВНУТРИЛАЕОРАТОРНАЯ результатов необходимо соблюдать все
подготовленная проба будет воспроизводииость результатов приведенные инструкций и следовать
проанализирована в течение 2 часов. в Один день на одном цитометре определялось нормативам лабораторной работы.
Замечание: Независимо от способа подготовки, содержание положительных клеток в образце 4. Коньюгаты антител данного реагента
' подготовленные пробы должны храниться при периферической крови, отобранном у одного откалиброваны для получения наилучшего
температуре 2 - 8"С; в защищенном от света места. донора. Измерение выполнялось 12 рва соотношения специфического и
Полученные результаты предстаелены в неспецифического сишала. Поэтому в каждом
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ следующей таблице: исследовании необходимо строго соблюдать
СПЕЦИФИЧНОСТЬ соотношение объема реагента и объема
Моноклональные антитела J33 окрашивают есе КЬличесгво Среднее CV образча
иаоформы молекулы CD45 (с молекулярным Лимфоциты измерений (%) SD (%) 5. При гиперлейкоцитоэе разведите образец
ведом от 160 до 220 кД), поэтому они считаются PBS так, чтобы получить примерную
общим лейкоцитарным маркером. В 19S6 г. на CD4S+ 12 99.02 0,21 0,21 концентрацию лейкоцитов 5 х 10’/л,
Третьем ме>вдународном рабочем соаещании 6. При некоторых заболеваниях, таких как
по дифференцироаочным антигенам МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ тяжелая почечная недостаточность или
лейкоцитов человека в Оксфорде, Англия, было ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ гемоглобинопатии, лизис эритроцитов может
подтверждено, ЧТО моноклональные антитела В один день на двух цитометрах двумя происходить медленно, не пегнОСГьЮ или
J33 направлены против CD4S (W5 Code: 81S, специвлистами определялось содержание совсем не происходить В этсм случае перед
Section ML) (11). положительных клеток в образце окрашиванием рекомендуется выделить
периферической крови, отобранном у одного моконуклеарные клетки в градиенте
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ донора. Измерение выполнялось 12 раз. плотности (например, фикола),
Для проверки лине(!1нйсги окрашивания данным Полученные результаты представлены в 7. Были описаны случаи острого
реагентом были в различных пропорциях следующих таблицах: лимфобластного лейкоза с отрицательной и
смешаны положительные клетки линии
слабоположительной реакцией по CD45, В
NAMALWA и отрицательные клетки линии Цитометр # 1 этих случаях лимфоцитарное происхождение
FRN3,<1,14, Общее количество 1слвток в образце бластных клеток следует подтвердить
оставалось постоянным. Соотношение Количество Среднее CV
положительных и отрицательных клеток Лимфоциты измерений {%) SD {%) другими маркерами.
изменялось от О до 100%.
CD46+ 12 99 В9 0.07 0.07 ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Алмквоты были окрашены в соответствии с
В приложении приводится пример диаграммы и
описанной выше методикой. На основании
Цитометр # 2 список литературы.
полученных и ожидаемых значений
вычислялась линейная регрессия. количество Среднее CV ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
Лимфоцитн измерений (%) SD (%)
Маркер Линейная регрессия Линейность (R*) Логотип BECKMAN COULTER, Веоктэп Coulter,
С045+ 12 9S.G2 0,52 0.53 Beciiman Couiter, СХР, iOTast являкэтся
CD4B Y=0.9924X-0.5B1 0.9996
компании Becl<man Coulter inc.
0ЖИДАЕМЬ1Е ЗНАЧЕНИЯ
ИЗГОТОВЛЕНО:
Каждая лаборатория должна определить
собственные диапазоны нормальных значений IMIVIUNOTECH
на основании исследования образцов здоровых а ВесЯптап Couller Company
доноров местной популяции. При этом следует 130 avenue de Lattre de Tassigny
учить1вать возраст, пол и этническую B.P. 177 - 13276 Marseiiie Cedex9
принадлежность доноров, а также другие France
особенности местного населения. Отдел no работе с клиентами; (33) 4 91 17 27 27
www,bech;mancoul(er.cam
тВЕСКМАЫ
COULTER.
2/3 iM2473CE_A 2004-10-13
AC-04-1029
русский Спецификации
lOTest®
Специфичность CD45
CD45-PC5 Клон J33
Гибридона NS1 X Ва1Ь/с
I REF I A077S5
100 определений; 1 мл Иммуиоген Линия клеток Laz 221
10 мкл /определение
Иммуноглобулин IgGI
Вид Мышь
ВЮШАН
coiAmt. Источник Асцит
Очистка Аффинная хроматография на белке А
lOTest
Конъюгирован нов Флуороуром R-Фикоэритрин-цианин 5.1 (Ф145)
‘антитело X возбуждения 488 нм
С€
Пик эмиссии 670 нм
Буфер ФСБ pH 7,2 плюс 2 мг / МП БСА и 0,1 % NaN^
ПРИМЕНЕНИЕ Стабильность в невскрытом флаконе: см. срок » Реактив для лизиса эритроцитов с отмывкой после
Данное антитело, конъюгированное с фпуорохроном, годности на флаконе. лизиса. Например: VersaLyse™ (Ref, А09777).
позволяет идентифицировать популяции клеток, Стабильность после вскрытия флакона: рвактиа • Реактив для фиксации лейкоцитов. Например:
экспрйосирующих антиген CD46. * подсчитывать ил сохраняет стабильность е течение 90 дней- lO'1'esl 3 Fixative Solution {Ref, А07800).
количество в биолигичших образцах человека с МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ • Изотипический контроль: Реактив ЮТеат,
помощью проточной цитометрии. 1. Не используйте реакткв после истечения срока lgG1-PC5(Ref.A0779B),
ПРИНЦИП годности. ■ Буфер (ФСБ: 0,01 М фосфат натрия: 0,145 М
хлорид натрия: pH 7,2).
Данный тест основан на способносш специфичешх 2. Не замораживайте.
моноклональных антнтел связываться с антигенными 3. Перед использованием доведите температуру • Центрифуга
детерминанташ, которые эк(Л1рес№рованы реактива до комнатной (18 - 25“С), » Автоматический встряхиватель (типа Vortex).
лейкоцитами. 4. Минимизируйте воздействие света. • Проточный цитометр.
Специфическая окраоа пейкоцитоа осуществляется 5. Избегайте микробного загрязнения реактивов во ПРОЦЕДУРА
путем инкубации образца С реактивом TOTest. После избежание ложных результатов. Примечание: Описанная ниже процедура
этого эритроциты лизируют, а лейкоциты, на которые Б. Растворы антител, содержащие азид натрия (NaNs), действительна для стандартных приложений. Для ряда
процесс лизиса не оказывает воздействия, исследуют требуют осторожного обращения. Не принимайте приложений Becl(man Coulter объемы образца и
методом проточной цитометрии. внутрь и избегайте попадания на кожу, слизистые реактива VersaLyse могут различаться. В таких случаях
Проточный цитометр измеряет рассеивание света оболочки и глаза. необходимо следовать инструкциям, приведенным в
клетками и ил флуоресценцию. Он позволяет Кроме того, в кислой среде из азида натрия может описаши приложения.
устанавливать границы целевой полуллции клеток образоваться потенциально опасное соединение Для каждого анализируемого образца помимо тест-
внутри эпектрйнно'о окна, задаваемого на азотистоводорадная кислота. Во избежание пробирки необходимо иметь контрольную пробирку, з
гистограмме, которая соотносит рассеивание света под накопления взрывоопасных производных азида которой клетки Образца смешивают с изотипическим
прямым углом (боковое рассеивание - Side Scatter или натрия на поверхности металлических труб контролем (Ref. A0779fi).
SS) с рассеиванием света под малым углом (прямое рекомендуется перед удалением реактива в отходы 1. В какщую тест-пробирку добавляют по Юмкл
рассеивание - Forward Scatter или FS). На этапе развести его большим объемом воды, а затем специфического конъюгированного антитела
гайтинга можно воспользоваться и другими слить в СГОК. lOTest, а в каждую контрольную пробирку-по
гистограммами, котсфые содержат по wa различных 7. Все образцы кроаи следует рассматривать как 10 мкп изотипического контропя.
параметра, измеряемых цитометром, в зависимости от потенциально инфицированные и принимать 2. В тест-пробирку и контрсльнун} пробирку вносят по
приложения, избранного пспьэобатвлем. сйответстаующие меры предосторожности 100 мкл образца- Осторожно встрихиаагат пробирки
Флуоресценция ограниченной популяции клаток (работать в защитных перчатках, халатах и очка*). на приборе Vortex.
анализируется, чтобы отличить положительно 8. Запрещается набирать раствор в пипетку ртом, 3. Инкубируют в течение 15 - 20 мин при комнатно(!
окрашенные события от неокрашенных. Резулыать! Следует избегать попадания образцов на кожу, температуре (16-25°С) в защищенном от света
выражают в виде доди флуоресцирующих клшок в слизистые обопочки и глаза. месте,
процентах от общего числа событий, 9. Для удаления в отходы пробирок из-под образцов 4. Затем производят лизис эритроцитов, при
зарегистрированных при помощи гайтинга. крови, а также одноразовых материалов, необходимости пользуясь рекомендациями по
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКИХ использованных при обработке образцов, их использованию реакл^ва для лизиса.
ПРИЛОЖЕНИЙ помещают в слециальные контейнеры и Например, если используется VersaLyse
направляют на сжигание. (Ref. А09777), следует обратиться к лисшу-
Молекула CD45 и ее различные изоформы имеют ОБРАЗЦЫ вкледышу и рекомендуется воспользоваться
различные уровни экспрессии на лимфоидных (1 -3) и
Венозную кровь или образцы костного мозга собирают процедурой «с одновременной фиксацией», которая
1ЛИ6Я0ИДНЫХ клетках (4). Уроеень экспрессии
в стерильные пробирки, содержащие соль ЭДТА в состоит в добавлении 1 ил смеси ‘Fix-and-Lyse”
коррелирует со стадией дифференцировки
качестве антикоагулянта. Испопьзсвание других приготовляемой вх (етро/е. Немедленно
исследуемых клеток. Таким образом, определение
плотности экспрессии CD45 может помочь отличить антикоагулянтов не рекомендуется. встряхивают на Vortex в течение одной секунды, а
нормальные лейкоциты от злокачественно измененных Образцы следует хранить при комнатной температуре затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной
температуре в защищенном от света месте.
(г, 4-7), Низкая плотность дароссии CD45 (1в-2б°С), не встряхивая. Перед забором аликвоты
Если образец не свдержит зритроцитоа, добавпяют
наблюдается при острых миелоидных лейкозах, что для исследования образец следует перемешать путем
2 мл ФСБ.
позволяет отличить злокачественно измененные легкого встряхивания пробирки, чтобы обеспечить
клатли от нормальных (В). Более того, степень однородное распределение клеток по объему. 6. Центрифугируют в течение 5 минут при Т50 g при
комнатной температуре.
экспрессии CD45 в случаях острого лимфобластного Образцы подлежат анализу в течение 24 часов после
6. Удаляют супернатант аспирацией.
' лейкоза может иметь прогностическую ценность, венепункции.
7. Ресуспендируют клеточный осадок а 3 мл ФСБ.
> позволяя Судить о прогрессировании заболевания МЕТОДИКА
8. Повторяют этап 5.
(2.9). НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ 9 Удаляют супернатант асгк^ацией и ресуспендируют
■, Наконец, моноклональное антитело (мАт) позволяет ВХОДЯЩИЕ В КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИ рсадои кпеток, используя для этого:
оценить возможную примесь непайкоцитарных клеток к
• Пробирки для образцов и материалы для забора - 0,5 мл или 1 мл фСё, содержащего 0,1%
* гейту лимфоцитов лри фафичвском анализе
образцов. формальдегида, если препараты предполагается
прямоугольного рассеивания света (Side Scatter)
• Автоматические пипетки и одноразовые хранить в течение 2-24 часов, (ФСБ, содержащий
против флуоресценции конъюгата специфического
наконечники вместимостью 10,100 и 500 мкл. 0,1% формальдегида, можно получить путем
антитела к CD45 (10).
• Пластиковые пробирки для гемолиза. разведения 12,5 мкл фиксирующего раствора
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ • Калибровочные микросферы: Фпуоросферы IOTest3 Fixative Solution {Ref А07800), имеющего
Жидкие конъюгаты до и после рскрытия флакона Flow-Set™ Fluorospheres (Ref. 6607007). концентрацию 10Х, в 1 мл ФСБ.)
следует хранить при тэмпературе от 2до8'С в
защищенном от света месте.
1/3 1-А07765 2007-06-01 RU
- 0,5 мл ипи 1мл ФСБ без формапьдегцца, аопи ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ 4. Конъюгированное антитело в составе данного
препараты предполагается анализировать в ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ реактива откалибровано таким образом, чтобы
течение блихайшик 2 часов. В течение одного и того же дня с использованием обеспечить наилучшее отношение специфического
одного и того же цитометра было выполнено сигнала к неслецифическому. Позтому важно,
ПРИМЕЧАНИЕ'. Во вое* случаях препараты 12 измерений процентного содержания окрашенных чтобы соотнсшение объемов реактива и образца
следует хранить при температуре от 2доЗ‘С в ететок в целевой лолупяции (пим<|юциты). Полученные при каждом определении было одним и тем же.
защищенном от света месте. результаты обобщены в следующей таблица: 5. В случае лейкоцитоза кровь следует разводить
ФСБ приблизительно до концентрации
Целевая Число Средняя SD CV 5 X10* лейкоцитов в 1 л.
ПАРАМЕТРЫ
популяция величина (%) 6. При таких заболеваниях, как тяжелая почечная
^СПЕЦИФИЧНОСТЬ (%) недостаточность или гемоглобинопатия, лизис
МАт J33 окрашивает все иэоформы молекулы CD45+ 12 99,39 О.ОЭ 0,09 эритроцитов может идти медленно и быть
СО45(1В0-220ф): поэтому данное антитело лимфоциты неполным ипи даже невозможным. S этом случае
’ считается панлейкоцитарным маркером, рекомендуется выделять мононуклеарные клетки с
«Специфичность мАт J33s отношении CD45 была МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ использов0н»1ем фадиента ппотности (например,
установлена III Рабочим coвeu^aниeм Общества по ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ Flcoil), а затем окрашивать их.
диффереицировочным антигенам лейкоцитов человека В течение одного и того же дня С использованием 7, Описано отсутствие о)(рашивания на С045или
(HLDA) а г. Оксфорде, Великобритания, в 198Б г. (код одной и той же целевой популяции клеток (лимфоциты) чрезвычайно слабое окрашивание при остром
WS:8ia, раздел NL) (11). было выполнено 12 измерений процентного лимфобластном лейкозе. В таких случаях
содержания окрашенных кпеток силами двух принадлежность бпастоа к лимфоидному ряду
ЛИНЕЙНОСТЬ лаборантов, каздый из которых работал на отдельном следует подтверждать с помощью других маркеров,
Чтобы проверить линейность окрашивания для данного цитометре. Полученные результаты обобщены в
реактива, клетки положительной пинии (NAMALWA) и следующих таблицах: РАЗНОЕ
клетки отрицательной линик (FRN 3.4.14) смешали в Цитометр №1; Примеры (Examples) и ссылки (References) смотрите в
различных пропорциях так, чтобы все полученные
смеси содержали одно и то же конечное чиспо клеток, Целевая Число Средняя SD CV Приложении (Appendix).
популяция величина (%)
а стношение числа положительных «лето» к числу
(%) ТОРГОВЫЕ МАРКИ
отрицательных клеток находилось в диапазоне от CD45-I- 12 99,еэ 0,09 й,й9
О до 100%. лимфоциты Логотип компании Beckman Coulter и названия
Аликвоты окрашивали в соответствии с COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Set, lOTest, System il,
вышеописанной процедурой, и вычисляли параметры VersaLyse и XL являются эарегисгрировакными
(Дитометр №2:
линейной регрессии между ожидаемыми и торговыми марками компании Beckman Cojller Inc,
наблквдаемыми значениями. ЦелеБая Число Средняя SD CV
популяция величина {%) BD FACScan и BD LVSYS II являются
Специфичность Линейная Линейность <%) зарегистрированными торговыми марками компании
регрессия (R2) CD4S+ 1! 99,80 0,09 0,09 BD Biosciences and Company,
лимфоциты
CD45 У = 0,99Х + 1,06 0,99
ИЗГОТОВИТЕЛЬ;
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
IMMUNQTECH SAS
Каждой лаборатории необходимо набрать массив 1. Проточная цитометрия может дать ложные a Beckman Coulter Company
справочных значений путем исследования здоровых результаты, если цитометр идеально на юстирован, 130 awnue de Lattre de Tassigny
доноров из числа местного населения. Это следует рассеивание флуоресценции правильно не B.P. 177 - 13276 Marseille Cadex 9
делать с учетом возраста, пола, этнической скомпенсировано, а области тщательно не Франция
принадлежности, а также любых иных местных /отановпены. Отдел обслуживания клиентов: (33) 4 91 17 27 27
отличий. 2. Предпочтительно использовать метод лизиса
В наших лабораториях реактовом, описанным выше, эритроцитов с отмывкой, посколы<у данный реактив vww.beckmancoulter.com
было обработано 10 образцов крови адорооых не оптимизирован для методов пизиса без опгмывки,
взрослых людей. Результаты определения числа 3. Точные и воолроизводнмые результаты ВЕСКМАЫ
положительных целевых событий с использование» получаются, если использованные процедуры CoutXEIt.
данного реаиива приведены а нижеследующих вь1№лняк1тсн в соответствии с требованиями
таблицах; прилагаемой инструкции и стандартами
надлежащей лабораторной практики.
Лимфоциты Число Средняя SD CV
величина (%)
(%)
с 045+ 10 97,17 3,57 3,67
Моноциты Число средняя SD CV
величина (%)
(%)
CO-iS''' Г 10 05,89 S.70 6.03
Гранулоциты Чиспо Средняя SD CV
величина (%)
(%)
CD46+ 10 99,01 0,Э7 0,Э7
3/3 1-А07785 2007-06-01 RU
Спецификации
rOTesr
CD45-PE Специфичность CD45
Клон J33
I КАТАЛОЖНЬИД номер IA077S3
Гибрмдома NS1 X Ва1Ь/с
lOb тестов; 2 мл
Иммуноген Линия клеток Lai 221
20 и*кп / тест
О Иммуноглобулин IgGl
BECKMAN
Вид животных Мышь
ооыгаг*
Источник Асциты
lOlest Способ очистки Аффинная хроматография с иммобилизованным белком А
Конъюгаты антител Флуорохром Фикоэркгрин R (РЕ)
А возбуждения 4Sa нм
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€
IN VITRO Пик эмиссии 575 нм
Буфер PBS pH 7,2, БСА 2 мг/мл, 0. NaNj
НАЗНАЧЕНИЕ ВНИМАНИЕ лизиса). Например: VersaLyse™ (каталожный
Данные хонъюгироранныб с флуорохромом 1, Не используйте реагент с истекшим сроком номер А09777}.
антитела позволяют идентифицировать и годности, • Реагент для фиксации пейкоцитов. Например:
подсчитать клетхи, экспрессирующие антиген CD45. 2, Не замораживайте реагент, lOTest 3 Fixative Solution (каталожный номер
Для анализа исяользуются биологические 3, Перед использованием реагента необходимо А07300)
образцы человека. Исследование проводится дождаться, пока температура реагента • Изотипический контроль: реагент lOTtst
методом проточной цетофлуоримвтрии, достигнет комнатной (18 - 26“С) IgGI-PE (каталожный номер А07796).
4, Воздействие света на реагент необходимо
• Буфер (PBS: 0.01 М фосфат натрия. 0.145 IVI
ПРИНЦИП АНАЛИЗА свести к минимуму хлорид натрия; pH 7,2),
Данный гест осюван на способносш специфичва<их 5, Избегайте контаминации реагента
• Центрифуга.
монокгюнальны* актитвл связываться с антиенными микроорганизмами, в противном случае
детерминантами на поверхности лейкоцитов. бозможно получение недостоверных ■ Миксер (вортекс),
При инкубации образца с реагеигам ЮТея происходит результатов, • Проточный цитофлуориметр.
окрашивание лейкоцетов. Затем выполняется лизис 6, Растворы антител, содер5кащие азид натрия
эритроцитов Интактные neHKOyWTbi анализируются (NaNi), требуют осторожного обращения. Не ПОДГОТОВКА ПРОБ
на проточном цт-офлуориметрв- проглатывайте, избегайте попадания на кожу, Замечание; Приведенная ниже процедура пригодна
на слизистые оболочки и в глаза. для стандартных исследований. При выполнении
Проточный цитометр измеряет светорассеяние и
В кислой среде азид натрия способен образовывать некоторых приложений Beckman Coulter обьем
флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить
потенциальна опасную азотисто-всдиродную образца и/или реагента VersaLyse может отличаться.
интересующую популяцию на диафамме.
кислоту- При утилизации соединений азида В этом случае следуйте указаниям руководства для
ото6раж0Ю1Л0й светорассеяние в боковом
рекомендуется смывать их в водопроводно- конкретного приложения.
направлении (Side Scatter или SS) и светорассеяние
канализационную систему большим количеством При исследовании любого образца необходимо
е прямом направлении под малыми углами (Forward
проточной еады. Эти меры предосторожности также проанализировать контрольный образец
Sisatter или FS), Для выбора популяций можно
позволят избежать накопления азида натрия в (исследуемый образец плюс изотипический
использовать различные двупараметровые
металлических трубах и предотвратить контроль, каталожный номер А07796),
диаграммы в зависимости от используемого
приложения. образование взрывчатых веществ. 1- В пробирки для анализа клинически* образцов
7, Все образцы крови следует рассматривать как добавьте по 20 мкл конъюгатов анттел [OTesi, а в
Прибор выполняет анализ флуоресценции потенциально инфицированные При работе с пробирки для анализа контролей - по 20 мкл
выбранной популяции, распознавая окрашенные и ними необходимо соблюдать вое мары состветствующегс изотипического контроля
неокрашенные клетки. Результат представляется в предосторожности (а частности, использовать
2. В лробирки для анализа образца и для анализа
виде процентного содержания положительных защитные перчатки, халат и очки).
изотипического контроля добавьте по 100 мкл
клеток от всех клеток выбранной популяции, 8, Никогда не отбирайте образец через пипетку
образца. Аккуратна перемешайте на вортексе.
ртом. Избегайте контакта образца с кожей,
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ слизистыми оболочками и глазами. 3. Инкубируйте в течение 15-20 минут при
комнатной температуре (18 - гй^С) в защищенном
Изоформы мaлeкyльJ CD45 имеют различную 9, После завершения работы пробирки с кровью и
степень экслрессии на лимфоидных (1-3) и все одноразовые материалы необходимо от света месте.
мивлоидных клетках (4), Уровень экспрессии поместить в специальные контейнеры для 4. Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
коррелирует со стадией дифференцировки клеток. утилизации. следуя рекомендациям изготовителя
Таким образом, оценка плотности экспрессии CD46 лизирующего реагента.
полезна при выявлении нормальных и ОБРАЗЦЫ Например, при испопьювании реагента VtssaLyse
злокачественных лейкоцитов (2, 4-7), В случае Венозную кровь или образцы костного мозга (каталожный номер А09777) следуйте указаниям
острога миепоидного лейкоза уровень экспрессии необходимо отобрать в стерильные пробирки, инструкции к этому реагенту. Рекомендуется
CD45 незначителен. По этому признаку ссдержащие соль ЭДТА в качестве антикоагулянта. выполнить лизис с одновременной фиксацией.
злокачественные клетки отличаются от нормальных Использование других антикоагулянтов не Для этого добавьте к образцу 1 мл
(6), Более того, в случае острого лимфобластнопэ рекомендуется. свежеприготовленнопз раствора для фиксаций и
лейкоза уровень экспрессии CD45 может иметь лизиса ("Fix-and-Lyse"), Немедленна
Образцы должны храниться при комнатной
прогностическое значение в отношении перемешайте на вортекое в течение 1 секунды.
температуре (13 - 25°С), Встряхивание образцов не
профессироаания заболевания (2, 9).
допускается. Перед отбором аликвоты образец
||1нку6ируйтв 10 минут при комнатной
температуре в защищенном от света месте.
И наконец, моноклональные антитела к CD4S следует гомогенизировать, аккуратно перемешав
* позволяют, используя диаграмму, на которой Если образец не содержит эритроцитов,
* представлено светорассеяние е бокоеом Анализ образцов необходимо выполнить в добавьте 2 мл PBS.
течение 24 часов после отбора.
направлении и флуоресценция CD46, оценить 5. Отцентрифугируйте при комнатной температуре
^ возможную нелейкоцитарную контаминацию гейта в течение 5минутпри150хд
МЕТОДИКА
* лимфоцитов (10),
НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ
6. Удалите супернатант аспирацией.
7. Ресуспендируйте осадок клеток в 3 мл PBS,
МАТЕРИАЛЫ
* ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ • Пробирки и материалы для отбора проб- а. Повторите шаг 5,
До и после распечатки флакона жидкие конъюгать! 9, Удалите супернатант аспирацией и
антител необходимо хранить при температуре 2 - • Автоматические пипетки с одноразовыми ресуспендируйте кпетки:
в'С в защищенном от света месте. наконечниками на 20, 100 и 5й0 мкл. -в 0.5 или 1 мл PBS с 0.1% расгеором
• Пластиковые пробирки для гемолиза,
Стабильность реагента в нераспечатанном формальдегида, если подготовленная проба
флаконе приводится на этикетке флакона. • Калибровочные частицы: флуоросфвры Flow- будет храниться от 2 до 24 часов, (Данный
S e t(каталожный номер 6607007).
Стабильность реагента в распечатанном флаконе раствор можно получить разведением 12,6 мкл
составляет 90 дней- • Реагент для лизиса эртроцитов (с реагента (O Test 3 Fixative Solution (каталожнь]й
предусмотренной стадией отмывки после номер A0780D) в Ю-кратной концентрации S 1
мл PBS)
1/3 А07783СЕ 0 2006-02-01
- в 0.5 ИЛИ 1 мл PBS без формальдегида, если ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
лодготоаленная проба будет проанализирована ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ 1. При неправильной настройке цитофлуориметра,
6 течение 2 чесое. В один день на одном цитометре определялось неверной компенсации флуоресценции и
процентов содержание офашенных положительных неправильном расположении регионов могут
ЗАМЕЧАНИЕ; Независимо от спасаба подготовки, клеток (лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 быть получены недостоверные результаты.
подпэтовлвнные пробы необходимо хранить при раз. Полученные результаты преяставпены в 2. Рекомендуется выполнять пизис эритроцитов с
температуре 2 - S°C в защищенном от свегта месте. спещукяцей таблице: отмывкой, поскольку данный реагент не
оптимизирован для процедуры без отмыеки.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Положительные Количество Среднее CV 3. Для получения точных и воспроизводимых
СПЕЦИФИЧНОСТЬ клетки образцов (%) SD (%) результатов необходимо соблюдать все
с М о о в н с о е к м ло и н и а з л о ь ф ны ор е м а а н м т и и т м е о л л а е к J у 3 л 3 ы в а з н а т и и м ге о н д а е й C с D тв 4 у S ю (с т CD45+ 12 9Э.43 0,24 0.24 п н р о и р в м е а д т е и н в н а ы м е л абор и а н т с о тр р у н к о ц й и и ра бот и ы . следовать
Лимфоциты
молв1{улярным весом от ISO до 220 кД), поэтому 4. Конъюгаты антител данного реагента
они считаются общим лейкоцитарным маркером, откалиброваны для получения наилучшего
I g 1986 г. на Третьем мемщународном рабочем МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ соотношения специфическопо и
совещании по дифференцировочным аитмгвнам РЕЗУЛЬТАТОВ неспецифического сигнала Поэтому в каждом
лейкоцитов человека в Оксфзвдв, Англия, было В один день на двух цитометрах двумя исследовании необходимо строго соблюдать
подтвер)ндено, что моноклональные антитела J33 специалистами определялось процвнтное соотношение объема реагента и объема
направлены против С045 (Code WS: в18, Section содержание окрашенных положительных кпеток образца.
NL)(11}. (лимфоцитов). Измерение выполнялось 12 раз. 5. При гиперлейкоцигазе разведите образец PBS
Полученные результаты представлены в
так. чтобы получить примерную концентрацию
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТУ! следующих таблицах: лейкоцитов 5 X 10“/л.
Для проверки линейности окрашивания данным
реагентом были в различных пропорциях Цитометр # 1 6. При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
почечная недостаточность или
смешаны клетки положительной пинии
Поломмгепьные Количоетво Среднее С\/ гемоглобинопатии, пизис эритроцитов может
(NAMALWA) и клетки отримательной линии (FRN
клетки образцов {%) SD (%) происходить медленно, не полностью или
3.4.1')}. Общее количество клеток в образце
совсем не происходить. В этом случае перед
оставалось постоянным. Соотношение кпеток CD4S+ 12 99,4в 0.24 0,24 окрашиванием рекомендуется выделить
положительной линии и клеток отрицательной Лимфоциты мононукпеарные клетки в градиенте плотности
пинии изменялось от О до 100%.
(например, фикола).
Аликвоты были окрашены в соответствии с Цитоматр # 2 7. Были описаны случаи острого лимфобластного
описанной выше методикой. На основании
лейкоза с отрицательной и
полученных и ожидаемых значений вычислялась Положительные Копичвсгва Среднее CV
слэбоположительной реакцией по CD45, В этих
линейная регрессия. клетки образцов (%) SD (%)
случаях лимфоцитарное происхождение
С0<1Бт 12 90,53 0.25 0.25 бластных клеток следует подтвердить другими
Маркер Линейная регрессия Линейность (R“) Лимфоциты маркерами.
CD45 Y = 0,99 X - 0.42 0.9Э ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
В приложении приводятся примеры диаграмм и
список литературы.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Каждая лабораторий должна определить
ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
собственные диапазоны нормальных значений на
основании исследования образцов здоровых Логотип Becknian Coulter, COULTER, EPICS,
доноров местной популяции. При атом следует EXPO, Flow-Set, IOlE5i, System И, VersaLyse и XI
учитывать возраст, поп и этническую являются зарегистрированными торговыми
принадлежность доноров, а также другие знаками компании Beckman Coulter Snc,
особенности местного населения.
BD FACScan является зарегистрировэнным
В наших лабораториях с использованием данного
торговым знаком компании BD Biosciences and
реагента было проведено исследование образцов
Company.
цельной крови 10 взрослых лкщей. В следующей
таблице представлены результаты подсчета
ИЗГОТОВЛЕНО:
клеток, окрашенных данным реагентом:
IMMUNOTECH
а Beckman Coulter Company
Количество Среднее CV
130 avenue de Lattre de Tassigny
Лимфоциты образцов (%) SD (%)
B,P, 177- 13276 Marseitie Cedex9
CD45+ 10 ЭЭ.ОЗ 0,78 0,78 France
Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
Количество Среднее CV WAfw,beckmanco ulter, com
Моноциты образцов (%) SD (%)
CD45+ 10 99.26 0,68 0.53 ^БШ СМАЛ!
СоиНЕЯ.
Количество Среднее CV
Г ранулоциты образцов (%) SD (%)
CD4S+ 10 99.39 0,08 о.оэ
\
2/3 A077B3CE □ 2006-02-01
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № А07783
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двупараметровые диаграммы (светорассеяние в 1. Роррета, S.. Lai, R., VIsser, L., Yan, X.J . 'CD45 (Leucocyte
боковом направлении - интенсивность флуоресценции), полученные Common Antigen) expression in r and В lymphocyte subsets",
при анализе лизированного образца нормальной цельной крови. Для 19Э6. Leuk. Lymphoma, 20, 217-222.
окрашивания использовались конъюгаты антител lOTesi СР45-РЁ 2. Caldwell, C.W., Patterson, W.P., "Relationship of T200 antigen
(каталожный номер А07783). Выполнялось гейтирование популяции expression to stages of B-cell differentiation in resurgent hyperplasia
лейкоцито!!, Изотипический контроль (каталол1ный номер АО7706) на of bone marrow", 1907, Blood, 70,1165-1172.
диаграммах не показывается
3. Caldwell, C.W,. Patterson, WP., "Relalionship between CD45 anti­
gen expression and putative stages of differentiation In B-cell malig-
Диаграмма 1. Считывание и анализ данных выполнены с помощью nancies". 1991, Am. J. Hematol, 36, 111-115
проточного цитофлуориметра COULTER® EPICS® XL'^“ в программном 4. Caldwell, C.W., Patterson, W.P., Toalson, B,D,, Yesus, Y.W-, "Sur­
обеспечении System II™. face and cytoplasmic expression of CD45 antigen isoforms in normal
and maltgnant myeloid cell differentiation", 1991, Am, J. Clin.
LEUCOCYTKS Pathol , 95, 1В0-1Б7.
5. Hoffkes, H.G., Schmidtke, G., Uppenkamp, М., Schmucker, U.,
"Multiparametric immunophenotyping of В cells in peripheral bload
of healthy adults by flow cytometry", 1996, Clin. Diag. Lab Immu­
nol., 3, 30-36,
6. Lacombe, F., Durrieu, F., Briais, A,, Dumain, P., Belloc, Bascans, E.
Reiffsrs, J., Doisseau, M.R., Bemard, P., "Flow cytometry CD45 gat­
ing for immunDphenotyping of acute myeloid leukemia", 1Э97, Leu­
kemia, 11, 1873-1886.
7. Schneider, U„ van Lessen, A., Huhn, D„ Serke, S., "Two subsets of
peripheral blood plasma cells defined by differential expression of
CD45 antigen", 1ЭЭ7, Br. J. Haematol., 97, 68-64.
3. Borowitz, M.J., Guenther, K.L., Shults, К F,, Stalzer, G.T., “Immuno­
phenotyping of acute leukemia by flow cytometric analysis. Use of
CD45 and right-angle light scatter to gate on leukemic blasts in
three-color analysis", 1993, Am. J. Clin. Palhol., lOO, 634-540.
1 16 lee 1ВВв Э, Bahm, F.G., RaimondL S.C., Schell, M.J., Look, AT, Rivera, G,K,,
CD45-PE Pul, C.H., "Lack of CD45 antigen an blast cells in childhood acute
lymphoblastic leukemia is associated with chromosal hyperdiploidy
and other favorable prognostic features', 1992, Blood, 79, iQii-
Диаграмма 2 Считывание данных выполнено с помощью проточного 1016.
цитофлуориметра Becton Dickinson FACScan™. Анализ еь1полнен в
10. Nicholson, J K.A., Hearn, T.L., Crciss, G.O., White, M.D., "1997
программном обеспечении ЕХРО™-
Revised guidelines for performing C04+ T-cell determinations in
persons Infected with human immunodeficiency virus {HIV)", 1997,
Morbidity and Mortality Weekly Report, RR-2, 46, 1-29
IEUCOCYTES 11. Cobbold, S., Hale, G,, Waldmann, H., "Non-lineage, LFA-1 family,
and leukocyte common antigens. New and previously defined clus­
ters", 19Й7, Leucocyte Typing 111,, Wtiile Cell Differentiation Anti­
gens, McMlchael A,J,, et al., Eds , Oxford University Press, 783-803.
г
(J
lo»' lioi ' ' lloJ .........lio3 104
FL241d4litlCD45-PE
t
J
*
3/3 A077S3CE_D 2006-02-01
РУССКИЙ Спецификации
lOTest’'
Специфичность CD45
CD45-ECD
Клон J33
A07784 Гибридом^ NS1 X Ва[Ь.'с
1 DO определений; 1 мл
10 мкл/определение Иммуноген
Линия клетах 1аг й21
Иммуноглобулин
lqG1
^eraCMAN
COULTER. Вид Мышь
Источник Асцит
“ iOIfsi
.^Конъюгированное Очистка Аффинная хроматография на белке А
антитело
С€ Флуорохром R Phyeoerythrin-Taxas Rsd'^'-X (ЕСР'^*-*)
4S3 нги
IVD
Пик эмиссии 613 нм
Буфер ФСБ pH 7,2 плюс 2 мг/ г^<п БСА и 0.1% NaN.-;
ПРИМЕНЕНИЕ ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ МЕТОДИКА
Данное антнтепр, конъюгированное с флуорохромом, Жидкие кс«ъюпзты до и после вскрытия флакона НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ
позаеляет идентифицировать популяции клеток, следует хранить при lewnepari^pe от 2 до 8°С в ВХОДЯЩИЕ 0 КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИ
зкспрвссирующи)! антиген CD45, и подсчитывать и* защищенном от света месте. » Пробирки для образцов и материалы для заоорг
количество в биологических образцах человека с Стабильность а невскрытом флаконе: см, срок образцов.
помощью проточной цитометрии, годности на флаконе. • Автоматические пипетки и одноразовые
ПРИНЦИП Стабильность после вскрытия флакона: реактив наконечники вместимостью 10, 100 и 500 м;(п
Данный тест основан на способное™ специфических сохраняет стабильность в течение 90 дней • Пластиковые пробирки для гемолиза,
моноклональных ангитеп связываться с антигенными МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ • Калибровочные микросферы: Флуоросферы
детерминантами. которые экспрессированы 1. Не используйте реактив после истечения срока Flow-Set"' Fluorospheres (Ref 6607D07),
лейкоцитами. годности. • Реактив для лизиса эритроцитов с отмызкой после
Слецифическая окраска лейкоцитов осу1цествляется 2. Не заморауивайтб гизиса. Например: VersaLyse'^' (Ref. .А09777).
путем инкубации образца с реактиадм lO Ttst. После 3. Перед использованием доведите температуру • Реактив для фиксации лейкоцитов. Например
этого зритроциты пизируют, а лейкоциты, на которые реактива до комнатной (1В - 25‘С). [O'1'csi 3 Fixative Solution (Ref, А07800),
процесс лизисе не оказывает воздействия, исследуют 4. Минимизируйте воздействие света. • Изотипический контроль Реактив ИЛ^.ч!.
методом проточной цитометрии. 5. Избегайте микробного загрязнения реактивов во IgG^eCD (Ref,A07797)
Проточный цитометр измеряет рассеивание света избежание ложны* результатов. « Буфер (ФСБ: 0.01М фосфат натрия, 0,145 Г<1
кпеткаии и и> флуоресценции. Он позволяет 6. Растворы антител, содержащие азид натрия хлорид натрия; pH 7,2)
устанавливать границь! целевой полуляции клеток (MbNj), требуют осторожного обращения Не • Центрифуга.
внутри эле(гтронного окна, задаваемого на принимайте внутрь и избегайте попадания на кожу, • Автоматический встряхиватель Гт>1па Vortex).
гистограмме, которая соотносит рассеивание света слизистые оболочки и глаза. • Проточный цитометр,
под прямым углом (боковое рассеиеание - Side Scatter Кроме того, в кислой среде из азида натрия может ПРОЦЕДУРА
или SS) с рассеиванием саета под малым углом образоваться потенииально опасное соединение Примечание: Ог1исэнная ниже процедура
(приг/ое рассеивание - Forward Scatter или FS), На азотистоводородная кислота Во избежание действительна для стандартных приложений. Для
этвпе рейтинга можно воспользонатыя и другими накопления взрывоопасных производных азида ряда приложений БесКтал Couiter объемь' образца и
гистограммами, которые содержат по два различных натрия на поверхности металлических труб реактива VersaLyse могут различаться. В таких
параметра, измеряемых цитонетром, а зависимости рекомеччуется перед удалением рвашва в случаях необходимо следовать инструкция,ч,
от приложений, избранного пользователем. отходы развести его большим объемом воды, а приведенным а описании приложения
Флуоресценция ограниченной популяции клеток затем слить в сток, Для каждого анализируемого образца помимо тест-
анализируется, чтобы отличить положительно 7. Все образцы крови следует рассматривать как пробирки необходимо иметь контропьчу.ю пробирку, э
окрашенные события от неокрашенньх. Результаты потенциально инфицированные и принимать которой клетки образца смашизают с. изотипи^еским
выражают о виде доли флуоресцирующих клеток в соотаетствугащие меры предосторожности контролем (Ref А07797).
процентах от общего числа событий, (работать в защитных перчатках, халатах и очках). 1. В каждую тест-пробирку дсбэвлвют по 10 мкл
зарегистрированных при помощи гейтинга. 3. Запрещается набирать раствор к пипетку ртом. специфического конъюгированного антитела
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКИХ Следует избегать попадания образцов на кожу, lOTgst, е в каждую контрольную пробирку - по 10
ПРИЛОЖЕНИЙ слизистые оболочки и глаза. мкл изотипичеексго контроля
Молекула CD45 и ее различные изоформы имеют 9. Для удаления в отходы пробирок из-под образцов 2. В тйст-пробирку и контрольную пробирку эносят по
различные уровни экспрессии на лимфоидных (1 - Э) крови, а также одноразовых иатериалов, 100 мкл образиа. Осторожно эстряхивают
и млелоидных клетках (4) Уровень экспрессии использованных при обработке образцов, их пробирки на приборе Worlex.
коррелирует со стадией дифференцировки помещают в специальные контейнеры и 3. 1<1нку6ируют в течение 15-20 мин при комнатн011
направляют на сжигание.
исследуемых плеток. Таким образом, определение температуре (1в - 25“С) в защищенной зт света
плотности экспрессии CD45 может помочь отличить ОБРАЗЦЫ месте
нормальнь1в лейкоциты от злокачественно Венозную кровь или образцы костного мозга собирают 4. Затем производят лизис эритроцитов, при
измененных (2,4-7), Низкая плотность экспрессии а стерильные пробирки, содержащие соль ЭДТА в необходимости пользуясь рекомендациями по
CD45 наблюдается при острых иивлоидных лейкозах, качестве антиюагулянта. Использование других использованию реактива для лизиса
что позволяет отличить злокачественно измененные антикоагулянтоа не рекомендуется. Например, если используется Versat.yse
, клетки От норг^альных (0}, Более того, степень Образцы следует хранить при комнатной температуре (Ref, A0S777). следует обратиться к листку-
зкспрессии С045 в случаях острого лимфобластного (18-25°С), не встряхивая. Перед забором аликвоты вкладышу и рекомендуется воспсльзоватьсд
лейкоза может иметь прогностическую ценность, дпя исследования следует перемешать образец путем процедурой «с одновременной фиксацмейв,
‘ позволяя судить о прогрессировании заболевания лвгеого встряхивания пробир|{и, чтобы обеспечить которая состоит в добавлении 1 мл смеси ' Fix-and-
S Р,Э). однородное распределение клеток по объему. Lyse” приготовляемой ex leinpoie. Нек'едленно
Наконец, моноклональное антитело (мАт) позволяет Образцы подлежат анализу в течение 24 часов после встряхивают на Vortex в течение одг'ой се.-:ур,ды. а
^ * оценить возможную примесь нелимфоиитарных клеток венепункции. затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной
1 гейту лимфоцитов при фафическом анализе температуре в защищенном от света месте
прягйоугольного рассеивания свата (Side Scatter; Если образец не содержит аиитооаитов,
пропт флуфесценции конъюгата специфического добавляют 2 мл ©СЕ
антитела к С045 (Ю). 5. 1(ентрифугиру10т в течение 5 минут при 160 п при
комнатной температуре,
6. Удаляют супернатант аспирацией,
7. Ресуспендируют клеточный осадок в 3 ып ФСБ.
1 /3 I-A07784 2006-12-01 RU
8 Повторяют Sian 5. В наших лабораториях реактивом, описанным выше, ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
Э. Удапяйт супернатант аспирацией и было обработано SO образцов крови здоровых 1. Проточная цитометрия дает дать ложные
ресуспенду^рую! осадок кдеток- пользуясь: взрослы* людей. Результаты опредапения числа результаты, если иито«*етр иде0.льно не
- 0-5 мл или 1 мл ФСБ, юдержащеп: 0,1% положительных целевых собь^ий с использованием юстирован, рассеивание флуоресценции
формальдегида, если препараты предполагается данного peaifTHEa приэедены а нижеследующих правильно не скомпенсировано, е oonac™
хранить в течение 2-24 часов. (ФСБ, содержащий таблицах: тщательно не установлены
0,1% формальдегида, можно получить путем 2. Предпочтительно использовать метод лизиса
разведения 12,5 ллкп фиксирующего раствора Лимфоциты Числа Средняя su'l CV эритроцитов с отмывкой, поскольку данный
величина
lOlcsO FiMive Solution (Ref, А07800), имеющего реактив не оптимизирован длй .методов лизиса без
(%)
концентрацию 10Х, в 1 мл ФСБ,) 3-0 ОТМЫВИИ-
- 0,6 мл или 1 мл ФСБ без формальдегида, если CD4S+ 50 95,39 3.21 о 3. Точиь1в и воспроизводимые результаты
препараты предполагается анализировать в палучаются, если использованные процедуры
L течение ближайших 2 часов Моноциты Число Средняя SO CV выполняются в соответствии с требованиями
i ПРИМЕЧАНИЕ; Во ежх случал)! препараты беличк^на 1%} прилагаемой инструкиии и стандартами
JSL
'*’^следует хранить при температуре от 2 до S“C а CD45+ 50 95,85 I 4,00 4,00 I надлежащей лабораторной практики
защищенном от света месте, 4. Конъюгированное антитело s составе данного
Гранулоцитн Число 1 Средняя SD CV 1 реашев откапибровано таким образом, чтобы
ПАРАМЕТРЫ 1 величина (%) обеспечить наилучшее отношеяие cпeJифичecкoro
(%)
СПЕЦИФИЧНОСТЬ CD45- 50 98,49 2.5S 2,00 сигнала к неспецифичэскому. Поэтому важно,
МАт J33 скрашивает асе изоформы молекулы чтобы соотношение объемов реактива и образца
ССМ5{1В0- 220 кДа); поэтому данное антитело при каадог^ определении 5ыпа одним и тем же,
ВНУТЙИЛАБОРАТОРНАЯ
считается панлейкоцитарным маркером. ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ 5- В случае лейкоцитоза кровь опвдует разводить
Спеиифичнссть мЛт J33 в отношении CD45 была ФСБ приблизительно до вонцектрации 5 х 10"
установлена III Рабочим соьещанием Общества по В течение одного и того же дня с испольгованием лейкоцитов а 1 л,
дифференцировочным антигенам лейкоцитов одного и того же цитометрз было выполнено 12 6 При таких заболеваниях, как тяжелая почечная
человека (HLDA) в г. Оксфорде, Великобритания, в измерений процентного содержания окрашенных недостаточносггь или гемоглобинопатия, лизис
1Э86 г (код WS: 818, раздел NL) (11). клеток 3 целевой популяции (лимфоииты). аритроцитоа может идти медленно и Зыть
Полученные результаты обобщены в следующей
ЛИНЕЙНОСТЬ неполным или даже невозможным, й этом спучае
таблице:
рекомендуется вьщепять монснукпеарнь1е клетки с
Чтооы проверить линейность окрашивания для
использованием градиенте плотности (например
данного реактива, клетки положительной линии Целевая Число Средняя SD CV
Ficoll), а затем окрашиаать их.
(ТНР1) и клетки отрицательной линии (FRN 3.4.14) популяция величина (%)
7. Описзно отсутствие окрашивания на CD45 тл
смешали й различны* пропорциях так, чтобы асе 1%)
полученные смеси содержали одно и то же конечное СР45+ 12 93.98 Q.65 0,7 чрезвычайно слабое окрашивание при остром
число клеток, а отношение числа положительных лимфоциты лимфовластном лейкозе, В таких случаях
клеток к числу отрицательных клеток находилось в принадлежность бластов к лимфоидному ряду
диапазоне от О до 100% МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ следует подтверждать с помощью друих
Аликвоты окрашивали в соответствии с ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ маркероа
вышеописанной процедурой, и вычисляли параметры в течение одного и того же дня t использоааниам
линейной регрессии между ожидаемыми и сщнйй и той же целевой популяции клеток РАЗНОЕ
наблюдаемыми значениями. (лимфoцитbi) было выполнено 12 измерений Примеры (Examples) и ссылки (References) смотрите
' Сп9цифичпость Линейная регэксий процентного содержания окрашенных клеток силами в Приложении (Appenaixl
двух лабораитой, каждый из которых работал на
CD45 Y = 0.S8Xf0,30 1 0.99^J
отдельном цитометра. Полученные результаты ТОРГОВЫЕ МАРКИ
обобщены е следующих таблицах:
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ Логотип компании Beckman Coulter и названия
Каждой лаборатории необходимо набрать иеосив Цитометр N21; COULTER, ECD, EPICS, ЁХРО, Fiow-Set. ЮТсчг,
справочных гначений путем исследования здоровых Целевая Числа Средняя SD CV System II, VersaLyse и XL являются
доноров из числа местного населения. Это следует популяция величина (%) эарвгистрироаанными торговыми гваркам/ компании
делать с учетом возраста, пола, этнической (%) Beckman Coulter Inc,
принадлежности, а также любых иных местных CD45+ 12 эз,эз 0,65 0,7
отличий, лимфоциты Texas Red - зарегистрированная торговая марка
компании Molecular Probes in с,
Цитометр №2:
Целевая Число 1 Средняя SD CV ИЗГОТОВИТЕЛЬ:
популяция величина (%) IMMUNOTECH SAS
(%)
A Beckman Coulter Company
CD45+ 1. 99,15 0,29 0,3 130 avenue de Lattre de Tassigny
лимфоциты 1 B,P, 177 - 13275 Marseille Cedex 9
Франция
Отдел обслужиеания клиентов:
(33)4 91 17 27 27
wv™.becl(mancoulter,coni
со
Веасткмгл.лг
У
2/3 1-Д07784 2006-12-01 RU
Спецификации
lOTest®
CD3-FITC Специфичность CD3
Клон UCHT1
[ КАТАЛОЖНЫЙ НОМЕР | А07746 Гибридема NS1 хВа1Ыс
10Q тестов; 2 МП
Иммуноген Лимфоциты периферической ((рови
2Q мкл / тест
Иммуноглобулин lgG1
О Beckman Вид животных Мышь
С01ЛЛЯ,„
Источник АСЦ1ТГЫ
Способ очистки Аффинная хроматография с иммобилизованным белком А
tOTest
Конъюгаты антител
Флуорохром Флуоресцинизотиоцианат (FITC)
А возбуждения 4в6 нм
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ С€
IN VITRO Пик эмиссии S25 нм
Буфер PBS pH 7,2, БСА 2 мг/мл, 0,1% NaNa
НАЗНАЧЕНИЕ ВНИМАНИЕ • Проточный цитофлуориметр
Данные конысгированные с флуорохромом 1. Не используйте реагент с истекшим сроком
антитела позволяют идентифицировать клетки, годности. ПОДГОТОВКА прое
экспрессирующие антиген CD3, и выполнить их 2. Не замораживайте реагент. Замечание: Приведенная ниже процедура пригодна
подсчет. Для анализа испопьзуются биологические 3. Перад использованием необжздимо уравновесить для стандартных исоледований, При выполнении
oQpaaubj человека. Исследование гроводится реагент при комнатной температуре (1 а - 25'С). некогтарых приложений Beckman Coulter обьем
методом проточной цитофпуориметрии, 4. Воздействие света необходимо свести к образца иЛти реагента VersaLyse может отличаться,
минимуму. а этом случае следуйте указаниям руководства для
ПРИНЦИП анализа 5. Избегайте контаминации микроорганизмами, в конкретного приложений.
Данный тест оснойан на способности противном случае возможно получение При исследовании любого образца необходимо
спвц;^фич«скиж моноклональных антител недостоверных результатов также проанализировать контрольный образец
связываться с антигенными детерминантами на е, Раетворь! антител, содержащие азкд натрия (исследуемый образец плюс изотипический
поверхности лвйксцитов. (NaNj), требуют осторожного обращения. Не контроль, кат. №А07795).
При инкубации 0бреа4а с реагентом lOTest происходит проглатывайте, избегайте любого контакта с кпжвй, 1- а пробирки для анализа клинических образцов
окрашивание лейкоцитов. Затем выпопняется лизис слизистой оболочкой и глазами. добавьте по 20 нкл конъюгатов антител ЮТи(, а в
эритроцитов, Интакгные лейкоциты анализируются В кислой среде азцц натрия способен сбразоаыватъ пробирки дпя анализа контрппей - по 20 мкл
на проточном цитофпуоримвтре. взрывоопасную ааот«спз-водсродмую кислоту. При соответетвующего изотипическсго контроля.
Проточный цитометр измеряет светорассеяние и утилизации перед сливом в водопровод Z В пробирки для анализа образца и для анализа
флуорвсценчию кпвток. Он позволяет выделить рекомендуется развести реагент большим объемом изстипического контрол» добавьте по 100 мкл
интересующую популяцию на диаграмме, воды, Эго позволит избвхать накопления азида образца. Аккуратно перемешайте на аортексе.
отображающей светорассеяние в боковом натрия в металлкмеских трубах и предотвратит 3. Инкубируйте 6 течение 15-20 минут при момнатиой
направлении (Side Scatter или $$) и сбрэзоаание взрывчатого вещества. температуре (18 - 25‘С) в защищенном от света
светорассеяние в прймом направлении под 7. Все образцы крови следует рассматривать как месте.
малыми углами (Fonward Scatter или FS), Для
потенциально инфицированные. При работе с 4. Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
выбора анвпизирубмых популяций можно ними необходимо соблюдать все меры следуя рекомендациям изготовителя
использовать различные двулвраметровые
предосторожности (в частности, использовать лизирующего реагента.
диаграммы в зависимости от используемого
защитные перчатки, халат и очки}, Например, при использовании реагента
приложения. в. Никогда нй отбирайте образец через пипетку VersaLyse {кат. № А0Э777) следуйте указаниям
Прибор выполняет анализ флуоресценции ртом. Избегайте контакта образца с кожей, инструкции к этому реагенту, Рокомвндуйгсл
выбранной популяции, распознавая оирашемные и слизистой оболочкой и глазами. БЬ1Полни-:. процедуру «с о^:-'о;^рег>1еннои
нвофашенные ететкм. Результат представляется а 9. После завершения работы пробирки с кровью и фикоаци^;^м. ^‘пя эт0:'0 дсба!5ьте к ci5pj>.i4y i мл
виде процентного содержания положительных все одноразовые материалы необходимо сБожеп;мготаеленмого раствосй для фикс;у,|1П1 и
клеток от всех клеток выбранной популяции, поместить в специальные контейнеры для лизиса. Немедленно перемещайте на еортексе в
утилизации. течение 1 секунды Инкубируйте 10 минут при
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ комнатной температуре в защищенном от света
Антиген CD3 представляет собой белковый ОБРАЗЦЫ месте.
комплекс, состоящий из 5 попипвлту^дных цепей (у,
Венозную «ровь или образцы костного мозга Если образец не содержит эритроцитов,
В, е, 5, п) V. связанный с Т-клетичным рецептором необходимо отобрать в стерильные пробирки с солью добавьте 2 мл PBS,
(1, 2). СОЗ экспрессируется только на Т'
EDTA в качестве антикоаг^лянта. Использование 5. Отцентрифугируйте а течение 5 минут при ISO х
лимфоцитах и на сублопуляции тимоцитов (3), Й
периферической крпаи 67 - 7в% лимфоцитов других ангикоагулянтов не рекомендуется. 0 при комнатной температуре.
СОЗ"^: это значение зависит от возраста, у детей т 0 е 6 м p п a е з р ц а ь т i уре д о (1 л 8 ж н ~ ы 3 S‘C х ) р . ан В и с т т ь р с я я х ива п н р и и е об к р о а м зц н р ат в н о н й е 6 7. . У Р д е а су л с и п т е е н с д у и п р е у р й н т а е т о а с н а т д а о с к п и кл р е а т ц о и к е й в , 3 мл PBS,
младшего возраста оно меньше {4). допускается. Перед отбором аликвоты образец а. Повторите шаг S.
Данный реагент позволяет охарактеризовать и следует гомогенизировать, акк/ратно перемешав.
9, Удалите супернатант аспирацией и ресуспендируйте
выполнить подсчет Т-лимфоцитов при Анализ образцов необходимо выполнить в течение клетки:
расстройствах иммунной системы; 24 часов после отбора.
иммунодефицитных состояниях, аутоиммунных - в 0,Ь или 1 мл PBS с 0.1% раствором
заболеваниях, реакциях гиперчувствигтельности, МЕТОДИКА формальдегида, если подготоаленная проба
вирусных инфекциях, восстановлении иммунного будет храниться от 2 до 24 часов, (Данный раствор
ответа после трансплантации костного мозга и/или НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ можно получить разаадением 12.5 мкл реагент^
органов. Также реагент используется в случав МАТЕРИАЛЫ lOTsst 5 Fixative Solution (кат № А07В00) 5 10-
^ злокачественных звбопевамий крови, таких как • Пробирки и материалы для отбора проб. кратной концентрации в 1 мл PBS,)
лейкоз и пимфома, для фенотипирования ■ Автоматические пипетки с одноразовыми - в 0.5 или 1 мл PBS без формальдегида, если
наконечниками на 2D, 100 и 50D мкл, подготовленная проба будет проанализирована
• ^ популяций СОЗ'''-кпеток и контроля хода пачения
(5-8). • Пластиковые пробирки для гемолиза. в течение 2 часов.
• Калибровочные частицы; флуоросферы Flow-
ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа подготовки
V ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ Set™ (кат. Ns 6607007), подготовленные пробы необходимо хранить при
* До и после распечатки флакона жидкие конъюгаты • Реагент для лизиса эритроцитов (с температуре 2 - В'С в защищенном от света месте.
антител необходимо хранить при температуре 2 - предусмотренной стадией отмывки после лизиса).
Й"С в защищенном ОТ света месте. Например: VeraaLyse (кат № А09777).
СтаВильмость нераспечатанного реагента • Реагент для фиксации лейкоцитов. Например:
приводится на этикетке флакона. lOTest 3 Fixative Solution (кат, Ыг А0780а).
Стабильность распечатанного реагента 90 дней. » Изотипический контроль: Ю'Гезг reagent.
lgG1-FITC (кат, №А07795),
• Буфер (PBS: 0,01 М фосфат натрия; 0.14S М
хлорид натрия; pH 7.2).
• Центрифуга,
• Миксер (вортекс).
1/3 A07746EN_A 2003-10-21
АС-03-аэб8
СПЕЦИАЛЬНЫЕ характеристики ВНУТРИЛДеОРАТОРНАЯ 3. Для получения точных и воспроизводимых
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ результатов необходимо соблюдать все
Монокпональныв антитела (мАт) UCHT1 реагируют в един демь на одном цитометрй определялось приведенные инструкции и следовать нормам
с Е-цепью комплекса CD3 (9), процентное содержание окрашенных лабораторной работы.
положительных клеток (CD3 лимфоцитов
В 1982 г. на Первом международном рабочем 4. Антитела данного реагента откалиброваны для
периферической крори). Измерение выполнялось
сйаещаниъ! по дифферен14ировачным антигенам
12 раз. Полученные результаты суммированы в
получения наилучшего соотношенир
лейкоцитов человека в Париже, Франция, было специфического и иеспецифического сигнала.
следующей таблице:
подтверждено, что мАт UCHT1 направлены против Поэтому в каждом исследовании необходимо
CD3 (WS Code-. 3, SKttOT Т) (10). строго дозировать yKasaHHbju объем реагента с
Положительные Количество Среднее CV учетом количества клеток в образце.
лимфоциты измерений (%) SD 5. При гиперлейкоцитозе разведите образец P8S
д Дл и я а п п а р з о о ве н р к л и и н ли е н й е н йн о о с с т т и и окрашивания данным CD3+ 12 6S.7 1.D3 1.6 т л а е к й , к о ч ц т и о т б о ы в 5 п о X л 1 у 0 ч ® и / т п ь . примерную концентрацию
реагентам были в различных проп[>р1|Иях смешаны
Й, При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
положительные клетш линии HPBALL и
отрицательные клетки линии RAMOS, Общее МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ почечная недостаточность или гемоглобинопатии,
лизис эритроцитов может происходить
количество клеток в образце оставалось РЕЗУЛЬТАТОВ медленно, не полностью или совсем не
постоянным, Соотиощение положительны* и В один день на двух цитомвтрах двумя происходить, S этом случае перед
отрицательных клеток изменялось <эт О до 100%, лаборантами определялось процентное
окрашиванием рекомендуется выделить
Аликвоты были окрашены в соответствии с содержание окрашенных клеток одной популяции иононуклеарные клетки в градиенте плотности
описанной выше методикой. Ка основанми (CD3 лимфоцитов периферической крови).
{например, фикопа),
получанны* и ожидаемых значений вычислялась Измерение выполнялось 12 раз. Полученные
линейнай регрессия, Уравнение регрессии можно результаты суммированы в следующих тайпицах:
использовать для определения линейности и
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
диапамна измереиий. Цитометр # 1 В приложении приводится описок литературы и
Положительные Количество Среднее CV примеры диаграмм,
Маркер Линейная Линейность Диапазон лимфоцить] измерений (%) SD 1%)
регрессия (%)
ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
CD3+ 12 65.7 1.03 1.6
СРЗ Y = 0.991 Х+1,28 0.999 1-99 Логотип Beckman Coulter COULTER, EPICS, EXPO,
Flojtf-Set, lOTesi, Syslem II, XL являются
Цитометр # 2 зарегистрированными торговыми знаками
ожидаемые значения Положительные Количество Среднее CV
компании Beckman Coulter Inc-
Каждая лаборатория должна определить лимфоциты измерений (%) SD (%)
собственные диапазоны нормальных значений на
основаиии исследования образцов нормальных CD3+ 1! 08 0 0.5 21 ИЗГОТОВЛЁНО:
доноров местной популяции. При этом следует IMMUNOTECH S,A,
учитывать возраст, пол и этническую a Beckman Coulter Company
принадлежность доноров, а таюке другие местные 13Q avenue de Lattre deTassigny
особенности населения. ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ B.P. 177 - 13276 Marseille Cedex 9
Й наших лабораториях с использованием данного 1, При неправильной настройке цитофлуориметра, France
неверной компенсациь^ флуоресцаниии и
реагента было проведено исследование образцов неправильном расположении регионов могут Отдел no работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
SD взрослых людей. В следующей таблице
быть получены недостоверные результаты.
приставлены результаты подочета www.beckniancoulter com
положительны* событий; 2, Рекомендуется вьшолнять лизис эритроцитов с
отмывкой, поскольку данный реагент не
оптимизирован для процедуры без отмывки. О BECKMAN
Сойот ,.
Количество Среднее CV
Лимфоциты образцов (%) SO т
CD3+ 50 72.9 9.1 12,5
г
V
2/3
A07746EN_A 2003-10-21
AC-03-D96S
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № А07746
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЯИТ6РАТУРЫ
Нижа показаны однопарамвтровыв гистограммы (копичество клеток - 1, Thibault, G., Bandos, P., "Compared ICR and CD3fi expression on (*|5 and yfi
интенсивность флуоресценции), полученные при анализе лизированното ce/ls_ Evidence for the association of two ICR heteroijimefs with three CD3s
образца нормальной цельной крови. Для окрашивания ислользоеались chains in the TCR/CD3 complex”, 1996, J. Imnnjnot.,154, 3814-3820.
конъюгаты антител lOTest CD3-FITC {кат. Ms А07746). Выполнялось
2, Shores, g.W., Love. P.E., "ICR <-chain in T cell development and selection'',
выделение лимфоцитов программными средствами. Имтипический контроль
1997, Cur, Opin. Immunol., 9, 380-389,
Т, - коныетаты FITC с мышиным SgGI (кат. N» А077Э5) показаны 6вль]М цветом.
3, van Agthoven, A., Terhorsi, C., Reinheri, E L,, Schlossman, S.F., “Charac­
terization of T all surface glycoproteins Tl and T3 present on all human pe­
Считывание и анализ данны* выполнены с помощью проточного ripheral T lynnphocytBs and functional mature T lymphosytes", 1931, £ur J.
цитофлуориметра COULTER® EPICS® XL™ в программном обеспечении Immunol., 11,18-21.
System и™. 4, Hannet. I., Erkelfer-Yuksel, p., Lydvard, P., Deneys, V.. DeBfuyere, М., "De­
velopmental and mafuratlonal changes in human blood lymphocyte subpopu­
lations", 1992, Immunol. Today, S, 13, 21S-21B.
LYMPHOCYTES
5, Rothe, G, Schtnilz, G., Adorf, D., Barlage, S., Gramatiki, M,,
Hoffkea, H.G., Janossy, G., KnUchel. R., Ludwig, W.D., Nebe, T, Nerl, C.. Or-
fao. A., Serke, S., Sonnen, R., Tichelli, A,, Wdrmann, Б,, “ConBensus protocol
for the flow cytometric immunophenotyping of hHinatopoietIc malignanciBs".
1996, Leukemia, ID, 877-895,
6, Nicholson, J.K.A., Hearn, T,L., Crass, G.D., White, M.D., "1997 Revised
guidelines tor performine CD4f T-cell determinations in persons infected with
human immunodeficiency virus (HIV), 1997, Morbidity and Mortality Weekly
Report, RR-2, 46, 1-29,
7, Bray, R,A,, Gebel, N.M., "Applications of flow cytometry to transplantation of
solid Drgans",1990, Labmedica,Feb/Marcfi, 20-30,
a. Velafdi, A., Terenzi, A.. Cucciaioni, S., WIillo, R,, Grossi, C.E.,
Grignani, F., Martejlt, M,F„ "Imbalance within the peripheral blood T-helper
(CD4+) and T-suppressDf (CDB+) celt populations in the reconstitution phase
after human bnne marrow tt«nsplantatlon", 1Э8В, Blood, 5,71, 1196-1200.
9, Tunnaclrffe, A., Olsson, C., Traunecker, A,, Krissansen. G.W..
Karjalainen, K,, Oe fa Hera, A„ "The majority of CD3 epitopes are conferrad
by the с chain", 1983, Leucocyte Typing IV, White Cell Differentiation Anti­
gens. W, Knapp, et at,, Eds., Oxford University Press, 295-296,
10. Bernard, A., Brottier, P., Georget, E,, Lepage, V., Boumsell, L„ "Joint report of
the first international wort<shop on human leucocyte differentiation antigens by
the investigators of the participating laboratories", 1984, Leucocyte Typing 1,
Bernart, A. B< al,, Springer Veriag, 9-135.
CD3-F1TC
3/3 А0774беЫ A 2003-10-21
AC-03-0968
lOTest® Спецификации
CD45-FITC Специфичность CP4S
Клон J33
I КАТАЛОЖНЫЙ НОМЕР | AD77S2
Гибридома NS1 к Вв(Ыс
100 тестов; 2 мл
Иммуноген Клетки линии Lai 221
20 Mun I тест
Иммуноглобулин lgG1
_ 'BEOiMAN
Coulter,. Вид животных Мышь
Ч.
Источник Асциты
lOTfst Способ очистки Лфф|^нна!; хроматография с иммобилизованным белком А
Конъюгаты антител
Флуорохром Флуарасцжимтиоиианэт {F1TC)
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ л возбуждения 488 нм
IN VITRO Пик эмиссии 525 нм
Буфер PSS pH 7 2, БСА 2 мг/мл, 0.1% NaN,
НАЗНАЧЕНИЕ ВНИМАНИЕ * Проточный цитофлуориметр,
Данные конъюгировэниыв о фпуорохромон 1. Не используйте реагент с иств!<шим сроком
аититйлэ позволяют идентифицировать клетки. годности. ПОДГОТОВКА ПРОЕ
экспр?ссир/Ю11|Нв антиген CD45, и №1полниГгь их 2. Не замораживайте реагент, Замечание: Приведенная ниже процщ(ура пригодна
подсчет Для анализа ислользуются биологические 3. Перед использованием необходимо уравновесить для стандартных иооледований При выполнении
образцы человека. Исследойаниб проводится раагенг при комнатной температуре (18 - 25'С). некоторых приложений Beckman Coulter обьем
методом проточной цитофлуоримвтрии. 4. Воздайствив света необходимо свести к образца и/или реагента VersaLyse может отличаться,
минимуму. В ЭТОМ случае следуйте указаниям руководства для
ПРИНЦИП АНАЛИЗА конкретного приложений.
5. Избегайте контаминации микроорганизмами, в
Данный тест основан на способности противном случае возможна получение При исследовании любого образца необходимо
специфических моноклональных антител недостоверных результатов, таюке проанализировать контрольный образец
связываться с антигенными детерминантами на (исследуемый образец плюс изотипический
6. Растворы антител, содержащие азид натрия
поверхности лейкоцитов (NaNj), требуют осторожного обращения. Не контроль, кат, Ns А077Э5).
При инкубации образца с реагентом ЮТеа происходит проглатывайте, избегайте любого контакта с кожей, 1. Б пробирки для анализа клинических образцов
окрашивание лейкоцитов. Затем выполняется лизис слизистой оболочкой и глазами. добавьте по 20 мкл конъюгатов антител lOTcsi, а в
эритроцитов. Интактныв лейкоциты анализируются пробирки для анализа «онтролей - по 20 мкл
В кислой среде азид натрия способен образовывать
на проточнам цитофлуориметре. взрывоопасную азотисто-аЦдородную кислоту. При соответствующего изотипического контроля,
Проточный цитоиетр измеряет светорассеяние и утилизации перед сливом в водопроаод 2. В пробирки для анализа образца и для анализа
флуоресценцию клеток. Он поанопявт выделить рекомендуется разаесги реагент большим объемом изотипического контроля добавьте по 100 мкл
интервс/ощую популяцикз на диаграмме, 8СЩЫ, Эт^ позволит избежать накопления азида образца. Аккуратно перемешайте на еортексе,
отображающей светорассеяние в боковом натрия в металлических трубах и предотвратит 3. Инкубируйте в течение 1S- 20 минут при комнатной
направлении (Side Scetler илр SS) и светорассеяние в образование взрывчатого вещества температуре (1В - 25“С) в защищенном от света
прямом направлении под малыми углами (Fonvard 7. Все образцы крови следует рассматривать как месте,
Scatter или FS). Для выбора популяций можно потенциально инфицированные. При работе с 4. Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
использовать различнь« двупараметровые ними необходимо соблюдать все меры опедув рекомендациям изготовителя
диаграммы в зависимости от используемого предосторожности (в частности, использовать лизирующего реагента.
приложения. защит>+ыв перчатки, капат и очки). Например, при использовании реагента
Прибор выполняет анализ флуоресценции В. Никогда не отбирайте образец через пипетку VersaLyse (кат. № А09777) следуйте указаниям
выбранной популяции, распознавая окрашенные и ртом. Избегайте контакта образца с кожей, инструкции к атому реагенту. Р^кочяп.пуе! си
неокрашенные клетки. Результат пp(V1Cтaвлflвгтcя в слизистой оболочкой и глазами. выполнить процздуоу f?C
виде процентного содержания положительных 9. После завершения работы пробирки с кроеью и фиксацией», Для этого добавьте к обрвзщ' ' мп
клеток от все* клеток выбранной популяции. все одноразовые материалы необходимо свежеприготсапеимого piSCTsnpa длр фиксэ41{й и
поместить е специальные контейнеры для лизиса. Немедленно перемешайте на вортексе в
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ утилизации, течение 1 сехунды. Инкубируйте 10 минут при
Молекула CD4S и ее различные изоформы пп комнатной температуре а защищенном от света
разному экспрессируются на лимфоидных (1 - 3) и ОБРАЗЦЫ месте,
миелоидчы* клетка* (4), Экспрессия коррелирует Венозную кровь или образцы костного мозга Если образец не содержит эритроцитов,
со стадией дифференцировки клеток. Таким необходимо отобрать в сгерильныа пробирки с солью добавьте 2 мл PBS
образом, характеристика плотности CD45 полезна EDTA в качества антииоэг/лянта, Использование 5. Отцонтрифугируйте в течение 6 минут при 1BQ х
при дискриминации нормальны* клеток и друтх антикоагулянша не рекомевдуется. g при комнатной температуре
элои^чвственных лейкоцитов (2, 4 - 7). Плотностъ
Образцы должны храниться лри комнатной S. Удалите супернатант аспирацией.
экспрессии CD45 невелика при остром
температуре (18 - 25'С). Встряхивание образцов не 7. Ресуспендируйте осадок клеток в 3 мл PSS.
миелолейкозе, что позволнет отличить опухолевые
клетки от нормальных (8). Более того, степень допускаенсй Перед отбором аликвоты образец 8 Повторите шаг 5.
следует гомогенизировать, аккуратно перемешав.
«кспрессик CD45 при остром лимфобластном 9. Удалите супернатакг аспирацией и ресуслендируйте
лейкоза может имвгь Прогностическое значение в Анализ образцов необ*одимо вьщалнить в течение клетки:
отношении прогрессии заболевания (2, Э). 24 часов поспе отбора. - в 0,5 или 1 глл PBS с 0,1% раствором
И наконец, моноклональный антитела (мАт) к CD45 формальдегида, если подготовленная Проба
МЕТОДИКА
позволяют оценить возможную контаминацию будет храниться от 2 до 24 часов. (Данный раствор
нвлайкоцитами популяции лимфоцитов на диаграмме НЕОБХОДИМЫЕ. НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ можно получить разведением 12.S мкл реагента
светорассеяния в боковом направлении - матёриалы ЮТем 3 Fixahve Solution (кат № AO78D0) в 10-
флуоресценции CD4S, окрашенного специфическими • пробирки и материалы для отбора проб. кратт4ой к-онцентрации в 1 мл PBS.)
* конъюгатами антитап (10). • Автоматические пипетки с одноразовыми ~ в О.Ь или 1 мл P0S без формальдегида, если
■? наконечниками на 20,10D и S00 мкл. подготовленная проба будет проанализирована
i ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ • Пластиковые пробирки для гемолиза. в течение 2 часов.
4 До И после распечатки флакона жидкие конъюгаты • Калибровочные частицы: флуоросферы Flow-
’ч антител необходимо хранить при температуре 2 - ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа подготовки
Sel™ (кат Na 6607007),
^ 8‘С в защищенном от света месте. лодготоаленные пробы необходимо хранить при
Стабильность нвраслйчатаннсго реагента • Реагент для лизиса эритроцитов (с температуре 2 - в°С а защищенном от света месте
предусмотренной стадией отмывки после лиаиса).
приводится на этикетке флакона.
Например; VersaLyse (кат, Na А09777),
Стабильность распечатанного реагента 90 дней
• Реагент для фиксации лейкоцитов. Например:
lOTeat3 Fixative Solution (кат, Ns A078D0),
• Изотипический контроль: lOTesi reagent,
IgGl-FlTC (кат Ns АоГ7э£).
• Буфер (PBS; D,01 М фосфат натрия; D,14S М
хлорид натрия; pH 7.2).
• [Дентрифуга.
• ИЛихеер (вортекс).
1/3 A07782EN_A 2003-10-27
АС-03-1004
СПЕЦИАЛЬНЬГЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 4. Антитела данного реагента откалиброваны для
СПЕЦИФИЧНОСТЬ получения наилучщего соотношения
МАт J33 окрашивают асе изоформы молекулы ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ специфического и неспацифического сигнала.
CD45 (от 130 до 220 кДа), являющейся ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ Поэтому в каждом исследовании необходимо
панлейкоцитарныи маркером. В 1966 г. на Третьем В Один день на одном цитйметрв определялось строго дозировать указанный объем реагента с
мвжаумародном рабочем совещании по процентное содержание опрашенных учетом количества клеток в образце,
диффврвнцирййочным антигенам лейкоцитов положительных клеток (лимфоцитов). Измерение 5. При гиперлвйкоцитозе разведите образец PBS
человека в Оксфорде, Англия, Выло подтверждено, выполнялось \2 раз. Полученные результаты так, чтобы получить примерную концентрацию
что мАт BL'.a направлены против CDS (Code WS: суммированы в следующей таблице: лейкоцитов 5х 10®/л,
aiB, Section NL)(ID-
6. При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
Положт-ельные Количество Среднее CV почечная недостаточность или гемоглабинапатии
лимфоциты измерений (%) SD (%> лизис эритроцитов может происходить
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ
Дли проверки линейности окрашиваиия данным С045+ 12 9S.32 0.07 0.07 медленно, не полностьк! или совсем Кб
происходить, В этом случае перед
реагентам были в различных пропорциях смешаны
окрашиванием рекомендуется выделить
положительные тетки линии NAMALWA и
мононуклеарные клетки в градиенте плотности
отрицательные клетки пинии FRN 3.4.14, ОВщее
МЕЖПАЕОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ (например, фикола),
количество клеток а образце оставалось
постоянным. Соотношение положительных и РЕЗУЛЬТАТОВ 7. Были описаны острые лимфобластные пнйкоЛч,
0 один день ка двух цитометрах двумя
отрицательных клеток изменялось от Q до 100%. отрицательные по CD45 и е очень слабой
AnHKBOTbi были окрашены в соответствии с л со а д б е о р р ж ан а т н а и м е и окраш о е п н р н е ы д х е л п я о л л о о сь ж ительн п ы р х о це к н л т е н т о о е к экспрессией CD45. В зтих случаях
о п п о и л с у а че н н то н й ы х и в ы о ш ж е и да м ем ет ы о х д и з к н о а й ч . аки Н й а выч о и сн сл ов я а л н а и сь и ( П л о и л м у ф че о н ц н и ы то е в ). И р з е м з е ул р ь е т н а и т е ы вып с о у л м н м ял и о р с о ь в ан 1 ы 2 раз в . л кл и е м т ф ок о ц с и л т е а д р у н е о т е подт п в р е о р и д с и х т о ь ж д с е н п и о е м ощь в ю л а д с р т у н г ы их х
линейнвя регрессия. Уравнение регрессии можно следующих таблицах: маркеров,
использовать для определения линейности и
диапазона измерений. Цитометр # 1
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Маркер р Л е и г н р е е й с н с а и я я Лине (R й = н ') ость Диа { п % а ) зон Лимфоциты К и о зм ли е ч р е е с н т и в й о Ср ( е % дн ) ее 3D < C % V ) п В р п и р м и е л р о ы ж д ен и и а и гр п а р м и м в , одится список литературы и
CD45 Y = 0,99 X +0,62 0.9998 2-Э8 CD45+ 12 93.аб 0,09 0,09 TOPrOBbtE ЗНАКИ
Логотип Bedtman Couller, COULTER, EPICS, EXPO,
Цитометр # 2 Flow-Set, lOTcsi, System II, XL явпяются
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ зарегистрированными торговыми знаками
Количества Среднее CV
Каждая лаборатория должна определить кампании Beckman Coulter Inc,
собственные диапазоны нормальных значений ка Лимфоциты измерений (%) 3D {%)
основании исследования образцов нормальных CD45+ 12 99,?Г 0,21 0,21 BD FACScan и BD LVSVS II являются
доноров местной популяции. При этом следует зарегистрированными торговыми знаками
учитывать возраст, пол и зтническую компании BD Biosciences and Company,
принадлежность доноров, а также другие местные
особенности насвлення. ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
В наших лабораториях с использованием данного 1. При неправильной настройке цитпфлуориметра. ИЗГОТОВЛЕНО;
реагента было проведено исследований образцов неверной компенсации флуоресценции и IMMUNOTECH S,A
цельной крови 10 взрослых людей. В следующих неправильном расположении решонов могут a Beckman Coulter Company
таблицах представлены результать! подсчета быть получены недостоверные результаты. 130 avenue de Lattre de Tassigny
положительных событий: 2. Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов с B.P. 177 - 13276 Marseille Cedex 9
ог41ыекйй, посколь!<у данный реагент не Егалсе
оптимизирован для процедуры баз отмЫвКИ.
Копичество Среднее CV Отдел no работе о кпиентами: (33) 4 91 17 27 27
Лимфоциты образцов (%) SD (%) 3. Для получения точных и воспроизводимых
результатов необходимо со5пк1дать все www.beckmancDulteTCom
CD4E+ ID da.eo 0.15 0,16 приведенные инструкции и следовать нормам
лабораторной работы.
BECKMAN
соииш.
2/3 A077B2EN_A 2003-10-27
AC-03-1004
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № А07782
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ниже показаны двупарзметровые диаграммы (светорассеяние в боковом 1. Poppema, S., Lai, R., Visaer, L.. Van, X J., "CP45 (Leucocyte Common
напраяленйи - интенсивность флуоресценции), напученные лри анализе Antigen) e!i:prBss(on (n T and В lymphocyte subsets". 1996. Leuk. Lym­
лигированного образца нормальной цвпьмой крови. Для окрашивания phoma, 20, 217-222.
иопользовались конъюгаты антител lOTest CD45-FITC (кат. № А077ВЭ),
2. Caldwell, C.W.. Patterson, W.P., "Relationship of T200 antigen expres­
Выполнилось выделение лейкоцитов профаммными средствами.
sion to stages of B-cell differentiation In resurgent tiyperplasia iif bone
Изотипичвский контроль (кат, N» А07Г96) на диаграммах не похаэывается.
marroiv", 1987, Blood, 4, 70, 11S5-1172.
h 3. Caldwell, C.W,, Patterson. W.P., "Relationship between CD^S antlsen
Д„.и—аг рга-м...м..а. 1... С--ч-и--т-ы---в-а--н--и-е- „и —анализ данных выполнены С помощью expression and putative stages of «iitferentiation in B-cell malignancies’',
\ проточного цитофлуоримвтра COULTEfi* EPICS® XL™ н программном 1991, Am. J. her!1atol,, 36, 111-115.
обеспечении System II™. 4. Caldwall, C.W„ Patterson, W.P., Toalson, B.D., Yeaus, Y.W., "Surface
and cytoplasmio expression of CD4S antigen isoforms in nonnal and ma­
lignant myetoid cell differentiation", 1991, Am. J. Clin, Pathoi,, Э5, 1B0-
187.
6, Hoffkes, H.G., Sohmidtke, G,, Uppenkamp, M,. Scfimucker, U,, "Multi-
parametric immunopheriotyping of 0 cells in peripheral Wood of healthy
adults by flow cytometry", 199S, Clin. Diag, Lab, Immunol,, 1.3, 30-36,
6. Lacombe, F,, Durrieu, F., Briais, A,, Dumain, P., Belloc, Bascans, E.,
Reiffers, J„ BoiEseau, M,R„ Bernard, P., "Flow cylometry CD4S gating
for Immunophonoiyping of acute myeloid leukemia", 1997. Leultemla, 11,
1878-1S86,
7. Schneider, U., Van Lessen. A., Huhn, D., Ser1<e, S., "Two subsets of
peripheral blood plasma cells defined by differential expression of CD+5
antigen", 1ЭЭ?, Br. J. Haematol,, 97, 56-64.
6, Borowitz, M.J., Guenther, K.L., Shults, K.E.. Stelzer, G.T., "IrrnTiunoplne-
notyping of acute leukemia by flow cytometric analysis. Use of CD45 and
1н 1ни 1ИНИ
cftert птс right-angle light scatter to gate on leukemic blasts In three-color analy­
sis", 1993, Am. J. Clin, Palfiol,, 5, IDD, 534-540,
9, Bertm, F,G,, Raimondi, S C., Schell, M.J., Look, A,T,, River*, G,k:,, Pui,
Диаграмма 2. Счтывание данных выполнено с помощью проточного C.H , "Lack of CD45 antigen On blast cells In childhood acute lym-
цитрфлуориметра Весйп Dickinson FACScan^'', Анализ выполнен в phoblaslic leukemia is associated with chromosal hyperdiploidy and other
профзмымом обеспечении LYSYS II favorable prognostic features', 1S92, Blood, 4, 7Э, 1D11-1016,
10, Nicholson, J.K.A., Hearn, T.L., Cross, G.O., White, M,D., “1997 Revised
guidelines for performing CD4+ T-cell determinations in persons infected
with human immunodeficiency virus (HIV), 1997, Morbidity and Mortality
Weekly Report, RR-2.4S, 1-2Э,
11, CobtiDld, S,, Hale. G.. Waldmann, H., "Non-lineage, LFA-1 family, and
leukocyte common antigens: New and previously defined clusters", 1987,
Leucocyte Typing III,, White Cell Differentiation Antigens, McMlehael A,J,,
et al,, Eds,, Oxford University Press, 788-893,
"lFiI p|..ГГ.1Г.;,.| .M4-M11ii W. .? ..CWTii.Fel'lf.....iii>'" ■
3/3 A07782EN_A 20Q3-1Q-27
AC-03'1004
РУССКИИ Спецификации
lOIest'
CD45-PC7 1 Спецчфичность CD45 ...... ......................... .......... ••••'1
Кпон JM ■■■■ ... ............ .............. ------------
[ref] IM3548 Г ибридома NS1 X 6а1Ь/с
100 определений; 1 мл Иммупогэн Пиния клеток Laz 221
10 мкл / определение
BECXMAN Иммуноглобулин Г igGI
ахюнг,
Вид Мышь
Источник Асцит
lOl'fSl
' Очистка Аффинная хроматография на белке А
^Конъюгированное антитело
Флуоролром Фикоэритрин-цианин 7 (с&Ц7) ..... ......
к возбуждения 488 нм
IVD С€ Пик эмиссии 770 нм ........... :
Буфер ФСБ pH 7,2 плюс 2 мг / мл 1БСА и 0,1% NaN;,
ПРИМЕНЕНИЕ
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ • Автоматические пипетки и одноразоаью
Данное антитвпо, «онъилмроввнное с флуороиромом, наконечники вместимостью 10, 10D и 50а мкл.
Жидкие конъюгаты до и после вскрытия флакона
позволяет идентифицировать популяции клеток, • Пластиковые пробирки для гемолиза
следует хранить при температуре от 2 до 8”С в
эиспрессирующкл антиген CD45, и подсчитывать их
защищенном от саета месте.
• Калибровочные микроссреры: Непример: РС7
копичестао в биологически* образцах чепоаека с Стабипьность в невскрытом флаконе: см. срок (770/488) Sel-up Kit (Ref. 6607121)
помощью проточной ццтометрии, годности на флаконе. • Реактив для лизиса аритроцитов с оттывкой поспе
ПРИНЦИП Стабильность после вскрытия флакона: реактив лизиса Например: VersaLyse'''
(Ref А097 77).
Двнный тест основан на способности специфических сохраняет стабильность в течение ЭО дней.
• Реактив для фиксации лейкоцитов Напвимер:
моноклонапьны* антител связываться с антгенньили МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
lOTcsi .1 Fixative Solytion (Ref. A07800)
детер[йинзнтами, которые экспрессированы 1. Не используйте реактив после истечения срока • Изотипический контроль: Реактиа lO'l csi.
Лейкоцитами. годности. lgG1-PC7 (Ref. 6Б070ЙЗ).
Специфическая сжраскэ лейкоцитов осуществляется 2, Не замораживайте, • Буфер (ФСБ: 0,0ш фосфат натрия; 0,146 М
путем инкубации образца с реактивом КП «t. После J. Перед использованием доведите температуру хлорид натрия; pH 7.2).
Этого эритроциты лизируют, а лейкоциты, на которые
реактива до комнатной (18 - 25”С), • Центрифуга.
процесс пизиса не оказьвает воздействия, исследуют
4. 1\1инимизируйте воздействие овета. • Автоматический встряхиватель (типа Vortex).
методом проточной цитометрии 5 Избегайте микробного загрязнения реактивов во
• Проточный иитометр.
Протснный цитоматр изиеряет рассеивание света избежание ложных результатов.
клетками и их флуоресценцию. Он позволяет 6, Растворы антител, содержащие азид натрия ПРОЦЕДУРА
устанаалиаать границы целевой популяции клеток (NaN-j), требуют осторожного обращения. Не Примечание; Описанная ниже процедура
внутри мктронного окна, задамемого на принимайте внутрь и избегайте попадания на кожу. действительна для стандартных приложений Для
гмстсфамме, которая соотносит рассеивание света Слизистые оболочки и глаза. ряда приложений Secisman Couiter объемы образца и
под прямым углом (боковое рассеивание - Side Scatter Кроме того, а кислой среде из азида натрия может реактива VersaLyse могут различаться, В так!»»
или SS) с рассеиванием саета под малым углом образоваться поп-енциально опасное соединение случаях необходимо следовать инструкциям,
(прямое рассеивание - Forward Scatter иш Я5). На азотиотоаадороднэя кислота, Во избежание приведенным в описании приложения
этапе гейтинга можно воспользоваться и другими накопления взрывоопасных праимодных азида Для каждого анализируемого образца помимо тест-
гистограммами, которые содержат по два различных натрия на поверхности металлических труб пробирки необходимо иметь контрольную пвобирку, а
параметра, изнервемых цитометром, s зависимости рекомендуется перед удалением реактизв в которой клетки образца смешивают с изотипетеским
от приложения, избранного пользователем. отходы развести его большим объемом воды, а контролем (Ref. Ёс07099).
Флуоресценция ограниченной популяции клеток затем слить в сток. 1. В каждую тест-пробирку добавляют по "lO мкл
анализируется, чтобы отличить положительно 7 Все образцы кроаи следует рассматривать как специфического кон-ьюгированнсго антитепа
окрашенные события от неокрашенных. Результаты потенциально инфицированные и принишать lOIcst, а а каждую ко.чтрольную пробирку -
аыражают а виде доли флуоресцирующих клеток в соответствующие меры предосторожности по Юикл соотаетствующего изотипического
процента* от общего числа событий, (работать в защитных перчатках, халата* и очкзх}, контроля
зарегистрированных при помощи гейтинга. 8. Запрещается набирать раствор в пипетку ртом, 2, В тест-пробирку и контрольную пробирку вносят по
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКИХ Сладует избегать попадания образцов на кожу, 100 мкл образца, Осторожно встряхивают
ПРИЛОЖЕНИЙ слизистые обопоч*и и глаза, пробирки на приборе Vortex,
9. Для удаления в отходы пробирок иа-под образцов 1 1^нку5ируют в течение 15-20 мин при комнатной
Мопекула CD45 и ее различные изоформы имеют
крови, а также одноразовых материалов, температуре (18-25''С} в защищенном от света
различные уровни зкспрессии на лимфоидных (1^3)
использованных при обработке образцов, их месте,
и миелоидных клетках (4). Уровень экспрессии
помещают в специальные контейнеры и 4, Затем производят лизис эритроцитов, при
коррелирует со стадией дифферени^роаки
направляют на сжигание, неабходигшости пользуясь рекомендациями по
исследуемы* клеток. Таким образом, определение
использованию реаетиее дпя пизиса.
плотности экспрессии CD45 может помочь отпичить ОБРАЗЦЫ
Например, если используется VorsaLyse
нормальные лейкоциты от злокачественно Венозную кровь или образцы костного мозга собирают
(Ref. А09777), следует обратиться к
измененных (2,4-7).Ншкая плолчость экопреесии в стерильнь1е пробирки, содержащие соль ЭДТА е листку-вкладышу и рекомендуется
CD45 наблюдаетср при острых миепоиднык лейкозах, качестве антикоагулянта. Использование других Еоспользояаться процедурой «с одновременной
что позволяет отличить злокачественно измененные антикоагулянтов не рекомендуется
фиксацией», которая состоит в добавлении 1 мл
клти от нормальных (8), Более того, степень Образцы следует хранить при комнатной температуре
смеси 'Ffx-and-Lyse‘ приготовляемой е* ютрогй.
мс^ресоии С 045 в случаях острого лимфобластного (18-25"С). не встряхивая. Перед забором аликаоты Немедленно встряхивают на Vortex в течение
пейкиа может иметь прогностическую ценность, для исследования образец следует перемешать путем одной секунды, а затем инкубируют в течение
^ позволяя судить о прогрессировании заболевания легкого встряхивания пробирки, чтобы обеспечить 10 мин при комнатной температуре 9 защищенном
\ (2,9). однородное распределение клеток по объему. от света месте.
Наконец, моноклональное антитело (мАт) позволяет Образцы подлежат анализу в течение 24 часов после Если образец не содержит эритроцитов,
^ оценить аоэшожную примесь нелейкоцитарных клеток венепункции добавляют Z мл ФСБ.
к гейту лимфоцитов при графическом анализе
МЕТОДИКА 5. Центрифугируют а течение 5 минут при 150 g при
прямоугольного рвссеивания света (Side Scatter)
НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ комнатной температуре.
протир флуоресценции конъюгата специфического
ВХОДЯЩИЕ В КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИ д. Удаляют супернатант аспирацией.
антитела к CD45 (10i_
7, Реоуспендируют клеточный осадок 9 3 мп ФСБ.
• Пробирки для образцов и материалы для забора
8. Повторяют этап 5,
образцов.
1/3 i-it^3S48 2U06-12-01 RU
3. Удвпню': супернатант аспирацией и В наши* шбораторинх реактивом, описанным выше, 3. Точные и воспроизводимые результдть.
ресуспендируют осадок клеток, используя для было обработано 50 образцов крови здоровых получаются, вели использованные процедуры
Этого: взрослых людйй. Результаты определения числа выполняются в соответствии с требоаанияии
- 0.5 мд иш 1 МП ФСБ, оодержацего 0,1% положительных целевых событий приведены в прилагаемой инструкции и стандартами
формапвдйгида, если препараты предполагается нижеследующих таблицах: надлежащей лабораторной практики,
хранить Б гбчение 2 - J4 часов, (ФСБ, содержащий 4 Конъюгированное антитело в состлае данного
0.1% формальдегида, можно получить лутел* Лимфоциты Число i Средняя SD CV реашва откалибровано такии образом, чтобы
рааведе*^ия 12,5 (^кл фиксирующего раствора ввпичима [%) обеспечить наилучшее отношение
КЗ Cisi J Fixative Solution (Ref. A07$00), имеющего ш . специфического сигнала к неслецифическому
концектрзцию lOX. з 1 ыл ФСБ,) 1 CD45' 50 ЭЗ.бЙ 4.44 I 4,7 Поэтому важно, чтобы соотношение объемоз
- 0.6 мл или 1 мл ФСБ без формальдегида, если реактива и образца при каждом определении
npenapaThi предполагается анализировать в ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ было одним и тем же,
течение ближайших 2 часов. ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ 5 В случае лейкоцитоза образец следует разводить
Э течение одного и того же дня с иелопьзованием ФСБ приблизительно до концентрации 5 х 10‘‘
I ПРИМЕЧАНИЕ: Во все* случаях препараты следует одного и того те цитоматрэ было выполнено 12 лейкоцитоа н 1 л.
хранить при температуре от 2 до 8°С в защищенном измерений содержания положительно окрашенные; 6. При таких заболеваниях, как тяжелая почечная
от света месте, клеток в образце периферической крови одного и того недостаточность или гемоглобинопатия, пиэис
же донора. Полученные результаты обобщены а эритрсцитоа (может идти медленно и быть
ПАРАМЕТРЫ следуюи^ей таблице: неполным или даже неаозможным. В этом случае
СПЕЦИФИЧНОСТЬ рекомендуется выделять мононуклеарные клетки
Средняя с использованием градиента плотности
МАт J,33 окрашивает все иэоформы молекулы величина (например, Ficoll), а затем окрашива'ь их.
CD45 {1Й0 - 220 кДа) и поэтошу считается __Ш..... 7. Описано отсутствие окрашивания нез CD45 или
панлейкоцигарным маркером. Специфичность мАт эа,э5 чрезвычайно слабое окрашивание при остром
J.33 в отношении CD45 была устаноепена III Рабочим лимфобластном лейкозе. В таких cn•/^^aяf.
совещанием Осшестрэ по дифференцировочньш МЕЖПАБОРАТОРНАЯ лринздлежнооть бластов к лимфоидному ряду
антигенам лейкоцитов человека (HLDA) в г, Оксфорде, ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ следует подтверждать с помощью flpyrti;<
Велитбритания, в 19BS г (код WS; 018, раздел NL) В течение одного и того же дня с использованием маркеров
(11) одного и того же образца периферической крови В, В связи с тандемной структурой флуорохрома
одного и того же донора было выполнено 12 PC? также излучает свет при 576 нм. Этот
ЛИНЕЙНОСТЬ измерений содержания положительно окрашенных вторичный Пик эмиссии различен в разных серия»
Чтобы проверить Линейность окрашивания для клеток силами двух лаборантов; препараты РС7. Поэтому для цепей миогоцгетного анализа
данного реактива, клетш положительной линии подверглись анализу на двух различнык цитометрах. компенсационную матвицу следует тщательно
(NAMALWA) и клетки отрицательной пинии (FRN Полученные результаты обобщены в следующих контролировать при смене серии РС7-йОиъгогата,
3 4 14) смешали з различны* пропорциях так, чтобы таблицах:
все полученные смеси содержали одно и то же РАЗНОЕ
Цитометр N51
конечное числа клеток, а отношение числа Примеры (Examples) и ссыпки (Refersilces}
положительных клеток к числу отрицательных клеток Лимфоциты Число Средняя величина SD GV смотоите в Приложении (Appendix;.
находилось в диапазоне от О до 100%. (%)
Аликвоты скрашивали в соответствии с CD45* i2 99.95 0.05 0,06 ТОРГОВЫЕ МАРКИ
вышеописанной процедурой, и вычисляли параметры
линейной регрессии между ожидаемыми и Цитометр №2: Логотип компании BECKMAN CGiJLTEP. и названия
наблюдаемыми аначенияии. Лимфоци™ 1[Число ' Средняя величина SD CV Beckman Coulter, СХР, [OTe.st и VersaLyse являются
зарегистрированными торговыми мэрками компании
("/,) (%)
Специф1^чность Линейная регрессия i Линейность CD'tS- 12 97,93 0.77 B,7S Beckman Coulter Inc,
LCD45 I 1.004 X-Д.404 0,399 ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА ИЗГОТОВИТЕЛЬ;
1, Проточная цитометрия может дать ложные IMMUNOTECH SAS
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ a Becknian Coulter Company
результаты, если цитаметр идеально не
Каждой лаборатории необходимо набрать массив юстирован, утечка флуоресценции правильно не 130 avenue cfe Lsttre de Tassigny
спрааочны)! значений путем исоледовдния здоровы* йкомпенсироаана, а области тщательна не B,P, 177 - 13275 Marseilie Cedex 9
донарра MJ числе местного населения Это следует установленьг Франция
делать о учетом возраста, попа, этнической 2. Предпочтительно использовать метод лизиса Отдел обслуживания клиентов: (33) 4 31 17 27 27
принадлежности, а гаюке любых иных местных эритроцитов с отмывкой, поскольку даниык!
отличий. реактив не оптимизирован для методов лизиса vftvw.beckmKncDulter, com
бэз отмывки
BliCKMAN
COULTER.
A
r
?
2/3 1-1M3548 2006-12-01 RU