Реагенты и наборы реагентов диагностических in vitro к автоматизированным приборам серий Phadia и ImmunoCAP (см. Приложение на 15 листах) — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
ImmunoCAP 100
Сложность CLIA:
d s D N A ЕхсеИепсе in AuWimmmity
Умеренная
Для диагностического использования в лабораторных условиях
ФТОРИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ПРОБА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ ГЛИАДИН АНТИТЕЛ
РУКОВОДСТВО ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
СОДЕРЖИМОЕ
В Eli А используется модульная система реактивов. Вся информация, необходимая для
понимания тестов ЕИА, в руководствах по использованию определенных аналитов и в
руководствах по использованию контрольных веществ EliA на данном CD.
ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ
Тест EliA глиадин представляет собой анализ, проводимый в лабораторных условиях {in vitro), который
предназначен для количественного измерения антител IgG к глиадину в сыворотке и плазме крови
человека (гепарин, ЭДТА, цитрат) в качестве дополнительного средства в диагностике красной
волчанки вместе с другими лабораторными и клиническими данными. Тест EliA Глиадин IgG
предназначен для использования методом EliA IgG на оборудовании ImmunoCAP 100.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ И ОБЪЯСНЕНИЕ ТЕСТА
Глютеновая болезнь - это пожизненное состояние, при котором переваривание глютена, не
растворимого в воде глиадина пшеницы и проламинов в ржи и овсе, приводит к хроническому
воспалению и повреждению слизистой оболочки тонкого кишечника. Заболевание очень
многостороннее, его симптомы варьируются от кишечно-желудочных проявлений до
асимптоматических, тихо протекающих и внекишечных форм.’ Герпетиформис, буллезное заболевание
кожи, вызывается глютеном.^ Сам термин «глютен» описывает целый ряд белков в так называемом
эндосперме, питательной ткани семян ржи, пшеницы, овса и ячменя. Спирторастворимые полипептиды
глютена, глиадины, ответственны за токсические последствия для слизистой оболочки кишечника.^ Так
как уровни антител глиадина хорошо коррелируют с морфологическим видом слизистой оболочки
тонкого кишечника, неинвазивная серологическая диагностика глютеновой болезни все чаще заменяет
собой процедуру биопсии, особенно у детей,®
ПРИНЦИПЫ ПРОЦЕДУРЫ
Лунки ЕИА Глиадин IgG покрыты антигеном глиадина. Если антитела к глиадину присутствуют в образце
крови пациента, антитела к глиадину связываются с их специфичными антигенами. После вымывания
несвязанных антител добавляют антитела, меченые энзимом, к антителам IgG человека (Конъюгат IgG
EliA), которые образуют комплекс антитело-конъюгат. После инкубации несвязанный конъюгат
вымывается, а оставшийся связанный комплекс затем инкубируется с проявляющим раствором. После
завершения реакции измеряется флуоресценция реакционной смеси. Чем выше значение реакции, тем
больше специфичного IgG присутствует в образце. Чтобы оценить результаты исследования, реакция
образцов крови пациентов сравнивается непосредственно с реакцией калибраторов,
РЕАКТИВЫ I МАТЕРИАЛ
Реактивы EliA упаковывают в отдельные блоки, каждый из которых приобретается по отдельности.
Для проведения теста ENA Глиадин IgG необходимы все блоки, кроме Положительный контроль EliA
Celiac 100 и Отрицательный контроль EliA Celiac 100.
Лунки для EliA Глиадин IgG упакованы в носители, которые хранятся в герметично упакованных
алюминиевых мешках с осушающим веществом.
Специфичные реактивы для теста EJiA Глиадин JgG
Лунка ЕИА Гпиадин IgG (N9 артикула. 14-5520-01)
Лунка Глиадин IgG Покрыта антигеном 4 нос14теля (12 лунок в Готов к использованию;
короткое глиадина каждом); достаточно для Хранить при 2-8 °С до
наименование: Ggl 48 определений истечения срока годности
Положительный контроль BiA СеПас 100 (№ артикула 83-1041-01)
Сыворотка человека в Многопараметрсеый б пузырьков для Готов к
фосфатно-бу фе рн о м контроль, содержащий одноразового использованию;
растворе, содержащем актшела IgG и IgA к tTG использования Хранить при 2-8 “С до
альбумин бычьей сыворотки, иглиадину (0.3 мл каждый); истечения срока
детергент и азид натрия (0.095 достаточно для 2-ух годности
%); символ: pos ______ определений на пузырек
Положительный контроль EliA Celiac 100 готовят из отобранной смеси сывороток крови человека.
Отрицательный контроль ЕИА Celiac 100 (№ артикула 83-1042-02)
Сыворотка человека в Мнопопара метровый 6 пузырьков для Готов к
фосфатно-буферном контроль, содержащий одноразового использованию;
растворе, содержащем сыворотку от здоровых использования Хранить при 2-8 “С до
альбумин бычьей сыворотки, доноров {0.3 мл каждый); истечения срока
детергент и азид натрия (0.095 достаточно для 2 -ух годности
%); символ: пед определений на пузырек
Отрицательный контроль EliA 100 готовят из отобранной смеси сывороток крови человека
Специфичные реактивы для метода EliA (ImmunoCAP 100)
Растворитель для образцов ЕПа (№ артикула 83-1003-01)
Растворитель для образцов 6 пузырьков (9 мл каждый); Готов к использованию;
(желтый цвет); фосфатно достаточно для 6 х 30 растворений Хранить при 2-8 °С до истечения
буферный раствор, содержащий (оборудование:растворение 1:100) срока годности
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0,095
%)___________________
Конъюгат IgG ЕИА (Ns артикула 83-1002-01)
Конъюгат IgG (синий цвет); 6 пузырьков {4.8 мл каждый); Готов к использованию;
В-Галактозидаза anTn^IgG достаточно для 6 х 48 определений Хранить при 2-8 ”С до истечения
(моноклональные антитела срока годности
мышей) в фосфатно-буферном НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
растворе, содержащем
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0.06 %);
символ: EI-G
Конъюгат IgG ЕПА (№ артикула 83-1005-01)
Конъюгат IgG (синий цвет); 2 пузырька {4.8 мл каждый); Готов к использованию
В-Галактозидаза анти-IgG достаточно для 2 X 48 определений Хранить при 2-8 °С до истечения
(моноклональные антитела срока годности
мышей) в фосфатно-буферном НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
растворе, содержащем
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия {0.06 %);
символ: Et-G
Калибраторы IgG EliA (N9 артикула 83-1000-01)
IgG человека (0,4,10, 20,100, б пузырьков для Готов к использованию
600 ug/l); в фосфатно-буферном одноразового использования Хранить при 2-8 °С до истечения
растворе, содержащем (0.3 мл каждый); срока годности
альбумин бычьей сыворотки, достаточно для одной
детергент и азид натрия {0.095 %) калибровочной фИВОЙ
СИМВОЛ'
Са1-0. СаК Само, Са1-20,
Са1-100, Са1-600
Произведено из сыворотки крови человека
Контроль кривой ЕПА IgG (№ артикула 83-1001-01)
IgG человека (20 уг/л1); в 6 одноразовых пузырьков (0 3 мл Готов к использованию;
фосфатно-буферном растворе, каждый); достаточно для 6 Хранить при 2-8 °С до
содержащем альбумин бычьей обработок истечения срока годности
сыворотки,
детергент и азид натрия (0,095
%)
символ: СС-1
Произведено из сыворотки крови человека
Калибраторная лунка ЕНА IgG (Ns артикула 14-5509-01)
Калибраторная лунка IgG, 4 носителя (12 лунок на каждый); Готов к использованию;
покрытая мышиными достаточно для 48 определений Хранить в сухом состоянии при
моноклональными антителами, 2-8 “С до истечения срока
краткое наименование: Gcal годности
НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Лунка-имитация ЕНА (№ артикула 14-5510-01)
Лунка-имитация, необходимая для 4 носителя (12 лунок на Готов к использованию;
системы ImmunoCAP 100 System каждый); достаточно для 48 Хранить в сухом состоянии при
для пустых позиций определений 2-8 °С до истечения срока
ГОДНОСТИ!____________________________
Общие реактивы ImmunoCAP 100
Раствор для проявки ImmunoCAP (№ артикула. 10-9478-01)
Раствор для проявки 6 пузырьков (6 мл each); Готов к использованию;
0.01 % 4-метилумбериферил-В- реактивы для 6 х 48 Хранить при 2-8 °С до
D-галактозид, <0,0010 определений истечения срока годности
консерванта** НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Стоп-раствор ImmunoCAP (№ артикула. 10-9479-01)
Стоп-раствор б флаконов (65 мл к); *реактивы Готов к использованию;
4 % карбонат натрия для 6 X 240 определений Хранить при 2-8 °С до
истечения срока годности
UC '^лкл>-мзлм;-1лрл-г1_1__
'В связи с pasrHMHbiMvi гроцессами анализа 1ттипоСАР и EliA ожидается небольшой обьем осадка.
"Консереакт: смесь 5-хлоро-2-метил-2Н-изотиаэол-3-он [ЕСМ2 247-500 5) и 2-метил-2Н-изотиазол-3-он [ЕС№ 247-239-6] {3,1)
Промывающий раствор ImmunoCAP (N2 артикула 10-9422-01/10-9202-01)
Дополнительная информация представлена на вкладышах в упаковках промывающего раствора.
Срок годности каждого набора реагентов указывается на внешней этикетке. Однако каждый
компонент сохраняет стабильность до даты, указанной на соответствующей этикетке пузырька.
Материал, не входящий в объем поставки; очищенная вода, градуированный цилиндр.
Предупреждения и предостережения
• Для диагностических целей в лабораторных условиях.
• Не используйте реактивы с истекшими сроками годности.
• Мы не рекомендуем смешивать реактивы.
• При использовании реактивов используйте защитные перчатки.
• Некоторые реактивы изготовлены из компонентов крови человека. Материал источника был
проверен при помощи иммунологической пробы на поверхностный антиген к гепатиту В, на
антитела к ВИЧ1, ВИЧ2 и вирусу гепатита С, результаты исследований - отрицательные. Тем не
менее, необходимо соблюдать рекомендации по работе с производными крови. См. публикацию
Службы здоровья человека (HHS) №(CDC) 93-8395 или прочие местные/национальные
руководства по безопасности при работе в лабораториях.
ВНИМАНИЕ! Осторожно обращайтесь с реактивами, содержащими азид натрия (NaNa) в качестве
консерванта. Азид натрия (NaNj) может вступать в реакцию со свинцом и медью а водопроводных
системах и образовывать высоко взрывчатые азиды металлов. При утилизации используйте
большое количество воды, чтобы предотвратить формирование азидов. См. Процедуры по
обезораживанию, указанные в руководствах Центров по контролю и предотвращению заболеваний
(CDC) и иными местными инструкциями.
Бутыль для отходов и контейнер для отработанных лунок ImmunoCAP/ENA могут быть заражена
потенциально инфекционным материалом. Предпринимайте соответствующие меры безопасности и
используйте защитные перчатки.
Признаки нестабильности
ПО ImmunoCAP 100 имеет встроенные предельные значения для калибровочной кривой и средства
контроля кривой. Дополнительная информация представлена в Руководстве по
Эксплуатации/Инструкции пользователя ImmunoCAP 100.
ОБОРУДОВАНИЕ
Реактивы EliA предназначены для использования с ПО ImmunoCAP 100, версия 2.0 или выше.
Оборудование ImmunoCAP 100 обрабатывает все этапы иммунологического исследования и
автоматически распечатывает результаты после завершения теста. Дополнительная информация по
настройке параметров анализа, оборудованию и ПО представлена в Руководстве по
Эксплуатации/Инструкции пользователя ImmunoCAP 100.
ОТБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Могут использоваться образцы плазмы или сыворотки крови {гепарин, ЭДТА, цитрат). Анализ трех
матриц сравнивали с сывороткой 53 доноров со значениями в рамках диапазона значений, при этом
влияния матрицы выявлено не было. Липемические, гемолизированные образцы или образцы с
микробным заражением могут давать плохие результаты и не должны использоваться. Не разрешается
повторно замораживать и оттаивать образцы крови. Температура хранения образцов должна
поддерживаться на уровне -20 "С (-4F") или ниже для повторных измерений.
Растворение образцов
Растворение образцов должно производиться при помощи растворителя для образцов EliA. Раствор 1:100
образцов необходим для проведения теста EliA глиадин. Растворение образцов может проводиться вручную,
однако, мы рекомендуем производить растворение на оборудовании, растворение включается в набор
насфоек ПО оборудования InnmunoCAP 100.
ПРОЦЕДУРА
Использование лунки EliA Глиадин IgG
Перед открытием мешочка из фольги необходимо довести его температуру до комнатной температуры. В
целях стабильности носители следует поместить в мешочки из алюминиевой фольги сразу после выемки
лунок. В связи с тем, что важно хранить лунки в сухих условиях при температуре 2-8 “С, мешочек должен
быть надлежащим образом герметизирован. Срок годности после первого открытия: 9 месяцев, если
данный срок не ограничивается сроком, указанным на носители и мешочке из алюминиевой фольги.
Код партии лунки ЕМА Глиадин IgG
Обязательно введите код партии лунки глиадин EliA Этот код указывается на носителе и мешочке из
алюминиевой фольги в виде (?.код(Ь, он зашифрован на штрих-коде мешочка из алюминиевой фольги
Предпочтительно использовать считывающее устройство для оггрих-кодов.
Код партии калибраторной лунки для ЕИА Глиадин IgG
Обязательно введите код партии калибраторной лунки для IgG глиадин EliA . Этот код указывается на
носителе и мешочке из алюминиевой фольги в виде (^код(!>, он зашифрован на штрих-коде мешочка из
алюминиевой фольги. Предпочтительно использовать считывающее усфойство для ил-рих-кодов.
Обязательно введите код партии конъюгата для IgG. Этот код указывается на носителе и мешочке из
алюминиевой фольги в виде CalCode, он зашифрован на штрих-коде мешочка из алюминиевой фольги.
Предпочтительно использовать считывающее усфойство для штрих-кодов для ввода кода калибровки.
Объемы для определения
Объемы реактивов для определения
Калибратор 90мкл
Конъюгат IgG EliA 90мкл
Раствор для проявки 90мкл
Стоп-раствор 200мкл
ручное разведение: 90 мкл разведенного образца
Разведение оборудованием (1:100): 22 мкл неразведенного образца
Мертвые объемы для пробирок у(<азамы в Инструкции по Эксплуатации/Руководстве пользователя ImmunoCAP 100.
Объемы реактивов на процедуру_____
Раствор для промывки 1 I*
Моющий раствор 1 I’
• Остаточный объем зависит от количества образцов и использованного метода разведения.
Комментарии по процедуре
•Из одного образца, разведенного оборудованием (1:100) проводится до 11 определений.
• При использовании функции ПО «по умолчанию» производится одна обработка образцов,
• Раствор для промывки при использовании должен быть комнатной температуры,
•Общее время обработки составляет 2,5 часов при обработке 48 лунок,
•Инкубация производится автоматически при 37 “С (98.6 °F) оборудованием ImmunoCAP 100.
• ПО > 2,1 / 022: Если вы хотите провести более одного анализа на пациента, вы можете использовать
следующие заранее установленные контрольные панели:
Панель Описание Включенные тесты EliA
Dccli Cciiac disease Celikev I2A. Cdikev IhG, Gliadin 1цА. Gliadin la(j
Dcda Cciiac disease lyG Celikev 1s>G. Gliadin IgG
pgli Gliadin Gliadin igA. (iliadin IgG
КАЛИБРОВКА И ЭТАЛОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Калибровочную кривую получают при использовании Калибраторов IgG EliA, которые обрабатываются
дважды. Кривая записывается, а результаты последующих анализов оцениваются в сравнении с сохраненной
кривой при использовании только Контроля кривой EliA IgG (обрабатываются дважды).
Калибровочные стандарты IgE контролируются посредством сплошной цепи калибровок на
соответствие с международным эталонным материалом (IRP) 67/86 Иммуноглобулинов сыворотки
человека А. G и М из Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ),
Новая калибровочная кривая составляется, если:
• Последняя калибровка проводилась более одного месяца назад, или
• Была введена новая партия Конъюгата IgG EliA, или
• Контроль кривой EliA IgG выходит за установленный диапазон (определенный в ПО ImmunoCAP 100).
I
и 1ие1мип<я nt: wicyivAyncipu^tncaiA uioiVAdMiuB. rcijyjibidibi ii|^m^■ o>M i7injia
виде отн.единиц Elia.
Контроль качества
Регистрация данных.
Лаборатории должны записывать номера партий использованных компонентов, даты открытия ампул
и оставшиеся объемы.
Контрольные образцы:
Лаборатории должны использовать контрольные образцы при каждой обработке образцов. Все
использованные материалы должны быть исследованы повторно, чтобы установить средние
значения и интервал приемлемых значений.
Для контроля измерений имеются контрольные образцы EliA.
РАСЧЕТ И ТОЛКОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Представление результатов
Оборудование ImmunoCAP 100 измеряет концентрации специфического !gG в мкг/л. При
использовании фактора пересчета в зависимости от кода лунки EliA Глиадин IgG, результаты
автоматически переводятся в МЕ/мл.
Толкование результатов теста
Диапазон результатов теста (отрицательный, допускающий двойное толкование, положительный).
Тест Единицы Отоииательный Двусмысленный Положительный
EliA глиадин измерения <7 7-10 > 10
МЕ/мп
Добросовестная практика рекомендует, чтобы каждая лаборатория устанавливала свои собственные
интервалы ожидаемых значений.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ
Определенный клинический диагноз не может основываться на результатах одного
диагностического метода, а может быть поставлен терапевтом только после оценки всех
клинических и лабораторных исследований.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Повышенные концентрации антител у аутоиммунных лиц зависит от области заболевания. Доля
сыворотки крови от здорового населения с положительной реакцией на глиадин антитела,
обнаруживаемая тестом EliA глиадин составляет менее 1 %^°. Ожидаемые значения варьируются в
зависимости от исследуемого населения.
Результаты, полученные для здоровых лиц
Распределение частоты антител к глиадину исследовалась на группе здоровых пациентов, в равной
мере распределенных по полу и возрасту при использовании сыворотки крови от представителей
европеоидной расы, полученной из банка крови. Результаты представлены в таблице далее.
Тест Единицы измерения Кол-во Среднее 95%- 99%-
образцов значение процентиль процентиль
EliA глиадин МЕ/мл 400 1.V 5,0 12,6
РАБОЧИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диапазон измерений
Диапазон измерений {лимит определения, верхний лимит) для EliA глиадин составляет от 0.2 до > 192 отн.
единиц Elia. Эффекта «ловушки» не наблюдается в концентрациях до 13-кратного увеличения диапазона
измерений.^’)
Только значения над лимитом определения могут рассматриваться как действительные результаты.
Верхний лимит наблюдаемых результатов может изменяться в связи с пересчетом в зависимости от
партии от мкг/л до отн. единиц Elia. Результаты над верхним лимитом указываются как «превышающие
лимит результаты».
Обращаем ваше внимание, что в связи с различными характеристиками связывания антител в образцах крови
пациентов, не вся сыворотка может линейно использоваться для определения диапазона измерений.
Специфичность
Тест EliA глиадин позволяет определять антитела IgG к антигену глиадина в соответствии с описаниями в
Разделе “Реактивы”,
Перекрестное взаимодействие
Следующие вещества в концентрациях, соответствующих тем, которые указаны на нерастворенных
образцах, прошли анализа на перекрестное взаимодействие с EliA Giiadin igG: билирубин F/C (18.8/20
мг/дл), лимфа (236.000 единиц/дл), гемоглобин (453 мг/дл) и ревматоидный фаю'ор 1дМ (550 МЕ/мл).
Перекрестное взаимодействие не наблюдалось.
Точность
Для определения точности анализа изменчивость оценивалась в исследованиях с использованием 26
обработок при анализе образцов по 2 повтора на 3-ёх системах на протяжении 9-и дней с калибровочной
кривой при каждой обработке. Статистическая оценка производилась посредством вариационного анализа.
Результаты представлены в таблице далее.‘^)
Тест Образец Единица Среднее Коэффициенты вариации (%)
измерения значение Внутри обработки Между обработками
1 EliA Е/мл 4.4 3.3 EliA 4.4
EliA глиадин 2 EliA Е/мл 14.6 5.0 EliA 14.6
3 EliA Е/мл 17.1 2.4 EliA 17.1
4 EliA Е/мл 32.0 4.8 EliA 32.0
ЛАБОРАТОРНАЯ ЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ
For analysis of agreement with Varelisa^'^ Giiadin IgG Antibodies 249 sera were measured.
Антитела IgG к глиадиму Varelisa™
i-i - 249 положительный двойное толкование отрицательные
EliA™ Giiadin IgG положительный 70 5 15
двойное толкование 4 9 12
fini
отрицательный 1 3 13Q
Согласие {%} ‘ 95% С1 (интервал доверия)
общие 92.6 nd
положительные 98.6 92.4 - 100 0 %
отрицательные 89.7 83.5 - 94.1 %
Результаты, допускающие двойное толкование, исключаются из расчета.
ГАРАНТИЯ
Рабочие характеристики, представленные здесь, были получены при использовании
вышеуказанной процедуры. Любые изменения и модификации процедуры, не рекомендованные
Phadia АВ, могут повлиять на результаты, в этом случае
Phadia АВ отказывается от всех выраженных гарантий, подразумеваемых или требуемых по
закону, включая гарантии годности для продажи и употребления.
Phadia АВи ее уполномоченные дистрибьюторы в этом случае не несут ответственности за
косвенный или последовательный ущерб.
Примечания
'’'Исследования проводились в Phadia Gmb, Фрайбург, Германия
СПРАВОЧНАЯ ЛИТЕРАТУРА
1, Maki М, Collin Р (1997) Coeliac disease. Lancet 349^ 1755-1759
2. Reunaia Т, Maki М (1993) Dermatitis herpetiformis: a genetic disease Eur J Dermatol 3, 519 526
j Howdle PD, Losowsky MS (1987) The immunology of coeliac disease Baillteres Clin Gastroenterol 1, b07-529
4 Bode S, Gudmand-Hoyer E (1994) Evaluation of the gliadin antibody test for diagnosing coeliac disease, Scand J Gastroenterol 29,
148-152
5 Bode S, WeiliS B, Krasiinikoff PA, Gudmand-Hoyer E (1Э93) The diagnostic value of the gliadin antibody test in celiac disease in children •
A prospective study J Pediatr Gastroenterol Nulr 17, 260-264
6 Catassi C, Ratsch IM, Fat^iani E et al (1994) Antigliadin antibody screening for coeliac disease Acta Paediatr Scand 83, 349-350
7 Scott H, f^ausa 0, Ek J, et at (1990) Measurements of serum IgA and IgG activities to dietary antigens A prospective study of the
diagnostic usefulness in adult coeliac disease. Scand J Gastroenterol 25, 287-292
8 Vitoria JC, Arrieta A, Astigarraga I et al (1994) Use of serological markers as a screening test in family members of patients with coliac
disease, J Pediatr Gastroenterol Nutr 19, 304-309
9 Lindberg T, Nilsson LA. Boruff S, et al. (1985) Serum IgA and IgG gliadin antibodies and small intestinal muco-sal damage tn children J
Pediatr Gastroenterol Nutr 4. 917-922
10 Dube C. Rostorn A Sy R Cranney A, Saloojee N Garritty С Sampson M, Zhang L, Yadzi F. Mamaladze V,
Pan I MacNeil J, Mack D Pale! D, Moher D (20Q6) The prevalence of celiac disease in average-nsk and
at-risk Western European populations: a systematic review Gastroenleralogy 128 S57-S67
Содержит азид
LOT Код партии Л
натрия
Содеожит X
Биологический риск V
X определений
т
Хранить при , Прочтите
ImeMnepanij/pei 1инстоук 14 ии
пользователя
а
s Дата истечеьия Производитель
срока годности
IVD Для лабораторных Не используйте
диагностических повторно
исследований
Phadia AB
SE-75 137 Аппсала,Швеция
C€ Тел: +46-18-16 50 60 • Факс +46-18-14 03 58
E-mail: autoimmunitv@phadia-Com / Internet; www phadia com
Опубликовано в ноябре 2008 года
© Phadia GmbH, Фрайбург, Германия
14^ W#-^l
Сложность CLIA;
d s D N A Excellence in Autoimmunity
Умеренная
Для диагностического использования в лабораторных условиях
ФТОРИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ПРОБА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ ЦИКЛИЧЕСКИХ
ЦИТРУЛИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ (ЦЦП) АНТИТЕЛ
РУКОВОДСТВО по ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
СОДЕРЖИМОЕ
в EliA используется модульная система реактивов. Вся информация, необходимая для
понимания тестов EiiA, в руководствах по использованию определенных аналитов и в
руководствах по использованию контрольных веществ ЕМА на данном CD.
ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ
Тест EliA ЦЦП представляет собой анализ, проводимый в лабораторных условиях (in vitro), который предназначен для
количественного измерения антител IgG к ЦЦП в сыворотке и плазмб крови человека в качестве диагностики
ревматоидного артрида. Тест EliA ЦЦП для использования методом EliA IgG на оборудовании
ImiminoCAP 250
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ И ОБЪЯСНЕНИЕ ТЕСТА
Ревматоидный артрит - одно из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний организма (уровень
заболеваемости - 1-2%). Заболевание хараетеризуется хроническим воспалением суставов и может приводить к
прогрессирующим эрозиям и повреждения связок. До недавнего времени ранняя диагностика ревматоидного артрита
основывалась, главным образом, на клинических проявлениях и на ревматоидном факторе в качестве
серологического маркера. Определение ревматоидного фактора является довольно чувствительным для
ревматоидного артрита (50-90%), однако, обладает ограниченной специфичностью (70-90%) Пациенты, страдающие
от разнообразных прочих заболеваний (например, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, системного
склероза, полимиозита/дерма-томиозита), и некоторые здоровые пациенты могут проявлять положительную реакцию
на ревматоидный фактор". В 1998 году были описаны высокоспецифичные антитела РА, которые были направлены к
цитрунилированным пептидам^ Анализ ИФА, изготовленный с первоначально описанной последовательностью ЦЦП,
не распространялся на рынке. Тест EliA ЦЦП содержит смесь синтетических пептидов, отобранных на основании
утвержденной эффективности по определению аутоантител РА В литературе препарат данного антигена часто
указывают как ЦЦП2 или второе поколение*. Тесты, в которых используется данный препарат, показывают
чувствительность 68% и специфичность - не менее 96%'"' Таким образом, анализ анти-ЦЦП представляет собой
инструмент в диагностике РА Дополнительно к этому. анти-ЦЦП антитела могут прогнозировать радиографическое
повреждение суставов^®^
ПРИНЦИПЫ ПРОЦЕДУРЫ
Лунки EliA ЦЦП покрыты цитрунилированными синтетическими пептидами (антиген второго поколения). Если антитела
к ЦЦП присутствуют в образце крови пациента, антитела к ЦЦП связываются с их специфичными антигенами. После
вымывания несвязанных антител добавляют антитела меченые энзимом, к антителам IgG человека (Коньюгат IgE
EliA), которые образуют комплекс антитело-конъюгат. После инкубации несвязанный конъюгат вымывается, а
оставшийся связанный комплекс затем инкубируется с проявляющим раствором. После завершения реакции
измеряется флуоресценция реакционной смеси. Чем выше значение реакции, тем больше специфичного IgG
присутствует в образце Чтобы оценить результаты исследования, реакция образцов крови пациентов сравнивается
непосредственно с реакцией калибраторов
РЕАКТИВЫ У МАТЕРИАЛ
Реактивы EliA упаковывают в отдельные бпоки, каждый из которых приобретается по отдельности.
Для проведения теста EliA ЦЦП необходимы все блоки, кроме Положительный контроль EliA ЦЦП 250 и
Отрицательный контроль EliA ЦЦП 250 .
Лунки для EliA ЦЦП упакованы в носители, которые хранятся а герметично упакованных алюминиевых пакетах с
осушающим веществом
I
Специфичные реактивы для теста ЕНА ЦЦП
Лунка ЕНА ЦЦП (№ артикула. 14-5515-01)
Лунка ЦЦП; Покрыта цитрун и лированными 4 носителя (12 лунок в Готов к использованию;
короткое синтетическими пептидами каждом); достаточно для Хранить при 2-8 °С до
наименованиехр (антиген второго поколения) 48 определений истечения срока годности
Положительный контроль EUA ЦЦП 250 (№ артикула 83-1035-01)
С"!ыЫвВоПрПоПтТкКаЯ чЦеРлПоПвИеРккЯа вR ККопннттрпоплпьь, ПсоПдПРеПрЖжЯаНщИиЛМй R6 ПпУуЧзыЫрПЬьКкОоВв дпгля Готов к
фосфатно-буферном ажшела IgG к Ц14П одноразового использованию;
растворе, содержащем использования Хранить при 2-8 °С до
альбумин бычьей сыворотки, (0.3 мл каждый); истечения срока
детергент и азид натрия (0.095 достаточно для 2-ух годности
%); символ: pos определений на пузырек
Положительный контроль EliA ЦЦП 250 готовят из отобранной смеси сывороток крови человека.
Отрицательный контроль BiA ЦЦП 250 (№ артикула 83-1037-02)
Сыворотка человека в Многопараметровый 6 пузырьков для Готов к
фосфатно-буферном коктроль, содержаний одноразового использованию;
растворе, содержащем сыворсптсу от здоровых использования Хранить при 2-8 °С до
альбумин бычьей сыворотки, доноров (0.3 мл каждый); истечения срока
детергент и азид натрия (0.095 достаточно для 2 -ух годности
7о); символ: neg определений на пузырек
Отрицательный контроль EliA ЦЦП 250 готовят из отобранной смеси сывороток крови человека.
Специфичные реактивы для метода EliA (IrrtmunoCAP 250)
Растворитель для образцов ЕПа (Ns артикула 83-1023-01)
Растворт-ель для образцов 6 пузырьков (9 мл каждый); Готов к использованию;
(>»«лтый цвет); фосфатно достаточно для 6 х 188 разведений Хранить при 2-8 X до истечения
буферный раствор, содержащий (оборудование: растворение 1:100) срока годности
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0,095
%)
Конъюгат IgG ЕНА 50 (№ артикула 83-1017-01)
Конъюгат IgG (синий цвет); 6 клиновидных пузырьков (5 мл Готов к использованию;
fi-Галактозидаза анти-IgG каждый); достаточно для 6x50 Хранить при 2-8 °С до истечения
(моноклональные антитела определений срока годности
мыщей) в фосфатно-буферном НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ'
растворе, содержащем
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0,06 %);
символ: EI-G
Конъюгат IgG ЕПА 200 (№ артикула 83-1018-01)
Конъюгат IgG (синий цвет); 6 клиновидных пузырьков (19 мл Готов к использованию
fi-Галактозидаза анти-IgG каждый); достаточно для 6 х 200 Хранить при 2'8 ”С до истечения
(моноклональные антитела определений срока годности
мышей) в фосфатно-буферном НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ'
растворе, содержащем
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0.06 %);
символ: EI-G
Калибраторные полоски IgG ЕНА (N9 артикула 83-1015-01)
IgG человека (0,4,10, 20,100, 5 полосок Готов к использованию
600 мкг/л1); в фосфатно 6 пузырьков для Хранить при 2-8 °С до истечения
буферном растворе, одноразового использования срока годности
содержащем альбумин бычьей (0.3 мл каждый);
сыворотки, достаточно для одной
детергент и азид натрия (0.095 %) калибровочной кривой (двойное
определение)
Произведено из сыворотки крови человека
Контроль кривой Eli А IgG (N9 артикула 83-1016-01)
IgG человека (20 мкг/л); в 5 полосок Готов к использованию;
фосфатно-буферном Каждая полоска содержутт 6 х Хранить при 2-8 “С до
растворе, содержащем 0,3 мл истечения срока годности
альбумин бычьей СС-1 (двойное определение)
сыворотки.
детергент и азид натрия
(0,095 %)
символ: СС-1
Произведено из сыворотки крови человека
Калибраторная лунка ЕИА IgG (№ артикула 14-5509-01)
Калибраторная лунка IgG, 4 носителя (12 лунок на Готов к использованию,
покрытая мышиными каждый); достаточно для 48 Хранить в сухом состоянии
моноклональными определений при 2-8 °С до истечения
антителами; краткое Срока годности
наименование: Gcal НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Общие реактивы ImmunoCAP 250
Раствор для проявки ImmunoCAP (№ артикула 10-9440-01)
Раствор для проявки 6 пузырьков (17 мл каждый); Готов к использованию;
0.01 % 4- реактивы для 6 х > 170 Хранить при 2-8 "С до
метилумбериферил-fi-D- определений истечения срока годности
галактозид, О 05 % Kathon СО НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ'
Стоп-раствор ImmunoCAP (№ артикула 10-9442-01)
Стоп-расггБор ' ' 6 флаконов (1 19 мл); Готов к использованию:
достаточно для 6 х >560 Хранить при 2-8 ‘С до
определений истечения срока годности
HF Г^АМПРАЖМРАТЫ____
Пластинки для растворения (Ыв артикула 12-3907-08)
Пластинки Microweli™, 0,5 60 пластинок на упаковку; Готов к использованию;
мл ка>едая; полипропилен достаточно для 6 х96 образцов НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Промывающий раствор ImmunoCAP {№ артикула 10-9422-01/10-9202-01)
Дополнительная информация представлена на вкладышах в упаковках промывающего раствора.
Предупреждения и предостережения
• Для диагностических целей в лабораторных условиях.
• Не используйте реактивы с истекшими сроками годности,
• Мы не рекомендуем смешивать реактивы.
• При использовании реактивов используйте защитные перчатки,
• Некоторые реактивы изготовлены из компонентов крови человека Материал источника был
проверен при помощи иммунологической пробы на поверхностный антиген к гепатиту В, на
антитела к ВИЧ1, ВИЧ2 и вирусу гепатита С, результаты исследований - отрицательные. Тем не
менее, необходимо соблюдать рекомендации по работе с производными крови. См. публикацию
Службы здоровья человека (HHS) №(CDC) 93-8395 или прочие местные/национальные
руководства по безопасности при работе в лабораториях.
ВНИМАНИЕ! Осторожно обращайтесь с реактивами, содержащими азид натрия (NaNs) в качестве
консерванта. Азид натрия (NaNs) может вступать в реакцию со свинцом и медью в водопроводных
системах и образовывать высоко взрывчатые азиды металлов. При утилизации используйте
большое количество воды, чтобы предотвратить формирование азидов. См Процедуры по
обезораживанию. указанные в руководствах Центров по контролю и предотвращению заболеваний
(CDC) и иными местными инструкциями.
Бутыль для отходов и контейнер для отработанных лунок ImmunoCAP/EliA могут быть заражена
потенциально инфекционным материалом. Предпринимайте соответствующие меры безопасности и
используйте защитные перчатки.
Признаки нестабильности
ПО ImmunoCAP 250 имеет встроенные предельные значения для калибровочной кривой и средства
контроля кривой. Пластинки EtiA являются влагочувствительными. Утрата активности, которая может
произойти в связи с неправильным использованием, может быть установлена при использовании
соответствующего Контроля EiiA. Дополнительная информация представлена в Руководстве по
Эксплуатации/Инструкции пользователя immunoCAP 250.
ОБОРУДОВАНИЕ
Реактивы EliA предназначены для использования с ПО ImmunoCAP 250, версия 1.05 или выше.
Оборудование ImmunoCAP 250 обрабатывает все этапы иммунологического исследования и
автоматически распечатывает результаты после завершения теста, Дополнительная информация по
настройке параметров анализа, оборудованию и ПО представлена в Руководстве по
Эксплуатации/Инструкции пользователя immunoCAP 250.
ОТБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Могут использоваться образцы плазмы или сыворотки крови. Валидационные исследования были
проведены при использовании гепарина лития, цитрата и ЭДТА плазмы*". Липемические,
гемолизированные образцы или образцы с микробным заражением могут давать плохие результаты и не
должны использоваться. Температура хранения образцов должна поддерживаться на уровне -20 °С (-4F )
или ниже для повторных измерений
Растворение образцов
Растворение образцов должно производмтьсн при пог.101ци раствори 1бля для образцов E!iA, Разве,-
1:100 образцов необходимо для проведения теста EliA ЦЦП. Растворение образцов может проводиться
вручную, однако, мы рекомендуем производить растворение на оборудовании, растворение включается в набор
настроек ПО оборудования ImmunoCAP 100.
ПРОЦЕДУРА
Использование лунки ЦЦП EliA
В камере хранения ImmunoCAP носители сохраняют стабильность в течение 28 дней Если вы не планируете их
использовать в течение указанного времени, носители необходимо зафузить через Поднос зафузки mmunoCAP
и для сохранения стабильности помещены в алюминиевый меоюк с десикантом сразу же после обработки.
В связи с тем, что важно хранить лунки в сухих условиях при температуре 2-8°С, мешок необходимо
надлежащим образом герметично упаковать. При хранении в данных условиях срок хранения с даты
первого открытия составляет 9 месяцев, если он не ограничивается датой истечения срока годности,
указанной на носителе и алюминиевом мешке.
Штрих-код партии лунки ЦЦП EliA
Используйте встроенное считывающее устройство для штрих-кодов, чтобы ввести информацию о партии
лунки ЦЦП EliA, калибраторной лунки ЦЦП EliA и конъюгата IgG ЦЦП EliA, В случае ручного ввода внесите
информацию, указанную под штрих-кодом.
Объемы для определения
Объемы реактивов для определения
Калибратор 90 мкл
Конъюгат IgG EliA
90 мкл
Раствор для проявки 90 мкл
Стоп-раствор 200 мкл
Ручное разведение: 90 мкл разведенного образца
Разведение оборудованием (1Ю0); 20 мкл неразведенного образца
Мертвые объемы для пробирок указаны в Инструкции по Эксплуатации/Руководстве пользователя ImmunoCAP 250
Объемы реактивов на процедуру
Раствор для промывки 5-7 л*
Моющий раствор 5-7 л*
"Остаточный обьем зависит от количества образцов и испопьэоаэнного метода разведения.
Комментарии по процедуре
»Из одного образца, разведенного оборудованием (1:100) проводится до 11 определений.
• При использовании функции ПО «по умолчанию» производится одна обработка образцов.
• Раствор для промывки при использовании должен быть комнатной температуры.
• Первыи результат готов приблизительно через 2 часа, а последующие результаты - через
одноминутные интервалы впоследствии. Постоянно можно загружать до 5 х 10 образцов, которые
обрабаываются по методу случайной выборки
• Инкубация производится автоматически при 37 °С (98,6 ®F)
КАЛИБРОВКА И ЭТАЛОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Калибровочную фивую получают при использовании Калибраторов IgG EliA, которые обрабатываются
дважды. Кривая записывается, а результаты последующих анализов оцениваются в сравнении с сохраненной
кривой при использовании только Контроля кривой EliA IgG (обрабатываются дважды)
Калибровочные стандарты IgE контролируются посредством сплошной цепи калибровок на
соответствие с международным эталонным материалом (IRP) 67/86 Иммуноглобулинов сыворотки
человека А. G и М из Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).
Новая калибровочная кривая составляется, если;
• Последняя калибровка проводилась более одного месяца назад, или
• Была введена новая партия Конъюгата IgG EliA, или
■ Контроль кривой EliA IgG выходит за установленный диапазон (определенный в ПО ImnnunoCAP 250).
Для антител глиадина не имеется международных стандартов. Результаты представляются в
виде отн.единиц Elia на мл.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Контрольные образцы;
Лаборатории должны использовать контрольные образцы при каждой обработке образцов. Все
использованные материалы должны быть исследованы повторно, чтобы установить средние
значения и интервал приемлемых значений.
РАСЧЕТ И ТОЛКОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Представление результатов
Оборудование immunoCAP 250 измеряет концентрации специфического IgG в мкгУл При
использовании фактора пересчета в зависимости от кода лунки EliA ЦЦП, результаты аЕгтоматически
переводятся в отн,единиц ENA/мл.
Толкование результатов теста
Диапазон результатов теста (отрицательный, допускающий двойное толкование, положительный),
рекомендованный для оценки результатов_______ ______ ___________ ____________
Тест Единицы Отрицательный Двойное Положительный
EliA ЦЦП измерения < 7 толкование > 10
________________МЕ/мл________________________________ 7-10
Добросовестная практика рекомендует, чтобы каждая лаборатория устанавливала свои собственные
интервалы ожидаемых значений,
ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ
Определенный клинический диагноз не может основываться на результатах одного
диагностического метода, а может быть поставлен терапевтом только после оценки всех
клинических и лабораторных исследований. Не все лица, у которых имеется ревматоидный артрит,
имеют определимые уровни анти-ЦЦП антител, а повышенные уровни анти-ЦЦП могут наблюдаться
у лиц без признаков клинического .заболе'?зния. Использование концентраций анти-ЦЦП антител для
контроля прогрессии и/или ремиссии РА установлены не были. Диагностическая ценность анти-ЦЦП
антител не была определена для артрита в подростковом возрасте
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Повышенные концентрации антител у аутоиммунных лиц зависит от области заболевания. Доля
сыворотки крови от здорового населения с положительной реакцией на ЦЦП антитела,
обнаруживаемая тестом ENA ЦЦП составляет менее 1 %. Ожидаемые значения варьируются в
зависимости от исследуемого населения.
Результаты, полученные для здоровых лиц
Распределение частоты антител ЦЦП исследовалось на оборудовании ImmunoCap 100 на группе
здоровых пациентов, в равной мере распределенных по полу и возрасту при использовании
сыворотки крови от представителей европеоидной расы, полученной из банка крови. Результаты
представлены в таблице далее,
Тест Единицы измерения Кол'ВО Среднее 95%- 99%-
образцов значение процентиль процентипь
EliA ЦЦП МЕ/мл 400 2,6 4 3 6,2
Клиническая чувствительность и специфичность
Клиническая чувствительность и специфичность для EliA ЦЦП, показанные в таблице далее, были
рассчитаны по результатам сыворотки 534 пациентов с клинически подтвержденным диагнозом
Результаты были получены при использовании оборудования ImnnunoCAP 100
г Руппа пациентов Количество пациентов Чувствитепьность 95% Интервал доверия
Ревматоидный ар! pH г 82 87,8% 78.7% - 94.0%
Группа пациентов Количество пациентов Специфичность 95% Интервал доверия
Контсольные заболевания 452 96.7% Э4.б% - Э8.1%
Кожные заболевания 120 92.5% 86.2% - 96.5%
Системная красная волчанка 30 100 0% 88 4% - 100 0%
С^слеродерма 39 92 3% 79 1% - 98 4%
Синдром Шефена 20 80,0% 44,4% - 97 5%
Прочие заболевания 31 90,3% 74 2% - 98 0%
Инфекции 185 98.4% 95.3% - ЭЭ.7%
Прочие 147 98.0% 94.2% - 99.6%
Остеоартрит 35 100.0% 90,0% - 100,0%
Васкулш иды 21 100 0% 71,5% - 100,0%
АутОИМ\1'.и-Ое 11 ?Г' Ч-ПП г-з/ ?3 - ■*00 0%
Заболевание Крона 20 100,0% 83,2% - 100.0%
Язвенный колит 20 100,0% 83.2% - 100.0%
Прочие 31 90,9% 75.7% - 98.1 %
Сравнительное исследование ме>еду ImmunoCAP 100 (х) и ImmunoCAP 250 (у) было проведено в
Phadia АВ, Аппсала, Швеция, на 36 образцах пациентов в целях оценки клинической
эффективности обеих систем. Лин/Лиин корреляция для EliA ЦЦП: угол наклона = 1.0275; г = 0.99.
РАБОЧИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диапазон измерений
Диапазон измерений (лимит определения, верхний лимит) для EliA ЦЦП составляет от 0,4 до > 340
отн.единиц EliA/мл. Эффекта «ловушки» не наблюдается в концентрациях до 10-кратного
увеличения диапазона измерений,*')
Только значения над лимитом определения могут рассматриваться как действительные
результаты. Верхний лимит наблюдаемых результатов может изменяться в связи с пересчетом
в зависимости от партии от мкг/л до отн.единиц Е11АУмл. Результаты над верхним лимитом
указываются как «превышающие лимит результаты».
Обращаем ваше внимание, что в связи с различными характеристиками связывания антител в
образцах крови пациентов, не вся сыворотка может быть линейно разведена для определения
диапазона измерений.
Следующие вещества в концентрациях, соответствующих тем, которые указаны на
нерастворенных образцах, прошли анализа на перекрестное взаимодействие с EliA Gliadin tgG;
билирубин F/C {18.8/20 мг/дл), лимфа (236.000 единиц/дл), гемоглобин (453 мг/дл) и ревматокадный
фактор IgiVl (550 МЕ/мл). Перекрестное взаимодействие не наблюдалось.
Специфичность
Тест EliA ЦЦП позволяет определять антитела IgG к антигену ЦЦП в соответствии с описаниями в
Разделе "Реактивы”.
Для определения точности анализа изменчиеость оценивалась в исследованиях с использованием 13 обработс
при оценке положительных образцов по 108 повторов на 3-ёх системах с калибровочной кривой при каждс
обработке. Статистическая оценка производилась посредством вариационного анализа. Результат
представлены в таблице далее.*')_________________________________________________________
Тест Образец Единица Среднее Коэффициенты вариации {%)
измерения значение Внутри обработки Между обработками
МЕУмп 9.1 10.5 7.7
EhA ЦЦП МЕУмл 15.7 7.9 5.7
МЕ/мл 63.3 6.0
'/'Исследования проводились в Phadia Gmb. Фрайбург. Германия
Исследования проЕзодились в Phadia АВ. Аппсапа. Швеция
ГАРАНТИЯ
Рабочие характеристики, представленные здесь, были получены при использовании вышеуказанной процедуры
Любые изменения и модификации процедуры, не рекомендованные Phadia АВ. могут повлиять на результаты, i
этом случае
Phadia АВ отказывается от всех выраженных гарантий, подразумеваемых или требуемых по закону, включая
гарантии годности для продажи и употребления.
Phadia АВи ее уполномоченные дистрибьюторы в этом случае не несут ответственности за косвенный или
последующий ущерб.
СПРАВОЧНАЯ ЛИТЕРАТУРА
1 Bas S, PernegerTV, Seitz М etal. (2002) Diagnostic tests for rheumatoid arthritis: comparison of anti cyclic citrulli-nated peptide
antibodies, anti-keratin antibodies and IgM rheumatoid factors, Rheumato'ogy 41 899-814
: M Mdlbyc OJ з' fl996) Rheumatoid Factors. In: Peter JB. Sboenf&'d Y ;eds) Autoantibodics, 7C(5 -
715, Elsevier Amsterdam
Г' Schellekens GA^ De Jong BAW, van den Hoogen FHJ et al. (1998) Citruiline is an Essential Constituent of Antigenic Determinants
Recognized by Rheumatoid Arthritis-specific Autoantibodies J Clin Invest 101, 273-281
4. Schellekens GA, Visser H, De Jong BAW et al. (2000) The diagnostic properties of rheumatcid arthritis anti bodies recognizing a cyclic
dtrullinated peptide. Arthntis Rheum 43, 155-163
5 Kroot EJJA. de Jong BAW, van Leeuwen MA et al. (2000) The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients
with recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 43, 1831-1835
6 Van Gaalen FA, Linn-Rasker S P, van Venrooij WJ et al. (2004) Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides (CCP) predict
progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study Arthntis Rheum 50, 709-715
7 Meyer 0, Labarre C, Dougados M et al (2003) Anticitrullmated protein/peptide antibody assays in early rheumatoid arthritis for
predicting five year radiographic damage. Ann Rheum Dis 62, 120-126
8. Visser H. ie Gessie S, Vos К et al (2002) How to diagnose rheumatoid arthntis early: a prediction model for persistent
(erosive) arthntis Arthritis Rheum 46, 357-365
9 Vossenaar ER, van Venrooij WJ (2004) Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (eariy) rheumatcid arthntis Clin Appl immuni
Rev 4, 239-262
[LOT Код партии А Содер.жиг
нагрия
Биологический , Содержи’ к
X риск V определений
Хранить при Прочтите
i температуре! т инструкции
2
попьователр
S Д ср а о т к а а и г с о т д е н ч о е с н т и и я ® ё Прйи:зводитель
ivo Для лабораторных Ие используйте
диагностических
повторно
исследований
j
Phadia AB
SE-75 137 Аппсала,Швеция
C€ Тел: +46-18-16 50 60 Факс: +46-18-14 03 58
E-mail: autoimnnunitv@phadia com / Internet: wwy^ phadia.com
Опубликовано в мае 2008 года
© Phadia GmbH, Фрг. Аг, Германия__________________
ImmunoCAP 100
Сложность CLIA:
d s D N A Вх€е1кп€€ т Ainoimmunitf
Умеренная
i
Для диагностического использования в лабораторных условиях
ФТОРИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ПРОБА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ ДцДНК АНТИТЕЛ
РУКОВОДСТВО ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
СОДЕРЖИМОЕ
В EliA используется модульная система реактивов. Вся информация, необходимая для
понимания тестов ЕМА, в руководствах по использованию определенных аналитов и в
руководствах по использованию контрольных веществ ЕМА на данном CD.
ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ
Тест EliA дцДНК представляет собой анализ, проводимый в лабораторных условиях (in vitro), который
предназначен для количественного измерения антител IgG дцДНК в сыворотке и плазме крови
человека {гепарин, ЭДТА, цитрат) в качестве дополнительного средства в диагностике красной
волчанки вместе с другими лабораторными и клиническими данными. Тест EliA дцДНК предназначен
для использования методом EliA IgG на оборудовании 1глтипоСАР 100.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ И ОБЪЯСНЕНИЕ ТЕСТА
Определение антинуклеарных факторов (АНФ) играет важную роль для клинического диагноза
заболеваний соединительной ткани Для диагностики красной волчанки антитела дцДНК считаются
более высоко специфичными маркерами, которые представляют собой один из критериев постановки
диагноза красной волчанки (критерий ACR).’ Более 90 % сыворотки крови от пациентов с красной
волчанкой содержат антитела дцДНК.^ В дополнение к этому, определение концентраций антител
дцДНК представляет собой инструмент для контроля клинического течения заболевания красной
волчанкой пациента, так как существует четко установленная взаимосвязь между титром анти-дцДНК и
активностью заболевания, в особенности, поражения почек.^
ПРИНЦИПЫ ПРОЦЕДУРЫ
Лунки ENA дцЦНК покрыты двухцепочечной плазмидной ДНК. Если антитела к дцДНК присутствуют в
образце крови пациента, антитела к дцДНК связываются с их специфичными антигенами. После
вымывания несвязанных антител добавляют антитела, меченые энзимом, к антителам IgG человека
{Конъюгат igE EliA), которые образуют комплекс антитело-конъюгат, После инкубации несвязанный
конъюгат вымывается, а оставшийся связанный комплекс затем инкубируется с проявляющим
раствором. После завершения реакции измеряется флуоресценция реакционной смеси. Чем выше
значение реакции, тем больше специфичного IgG присутствует в образце. Чтобы оценить результаты
исследования, реакция образцов крови пациентов сравнивается непосредственно с реакцией
калибраторов.
РЕАКТИВЫ / МАТЕРИАЛ
Реактивы EliA упаковывают в отдельные блоки, каждый из которых приобретается по отдельности.
Для проведения теста ENA дцДНК необходимы все блоки, кроме ENA ANA Control.
Лунки для EfiA дцДНК упакованы в носители, которые хранятся в герметично упакованных
алюминиевых пакетах с осушающим веществом.
Специфичные реактивы для теста EliA дцДНК
Лунка дцДНК; Покрыта 4 носителя (12 лунок в Готов к использованию;
короткое двухцепочечной каждом); достаточно для Хранить при 2-8 ‘’С до
наименование: dn плазмидной ДНК 48 определений истечения срока годности
Положительный контроль ЕНА ANA 100 (Ns артик]/ла 83-1038-01)
Сыворотка человека в Мнопопара метровый 6 пузырьков для Готов к
фосфатно-буферном контроль, содержащий одноразового использованию;
растворе, содержащем антупгела IgG к дцЦЬВ<, использования Хранить при 2-8 ”0 до
альбумин бычьей сыворотки, РНП, Sm.Ro, UScl-70, (0.3 мл каждый); истечения срока
детергент и азид натрия (0.095 CENPand Jo-1 достаточно для 2-ух годности
%); символ: pos определений на пузырек
Положительный контроль EliA ANA 100 готовят из отобранной смеси сывороток крови человека.
Отрицательный контроль ЕПА 100 (N9 артикула 83’1042-02)
Сыворотка человека в Многопараметровый 6 пузырьков для Готов к
фосфатно-буферном контроль, содержащий одноразового использованию;
растворе, содержащем сыворотку ОТТ здоровых использования Хранить при 2-8 "С до
альбумин бычьей сыворотки, доноров {0.3 мл каждый); истечения срока
детергент и азид натрия (0,095 достаточно для 2 -ух годности
%); символ: пед определений на пузырек
Отрицательный контроль EliA 100 готовят из отобранной смеси сывороток крови человека.
Специфичные реактивы для метода EliA (ImmunoCAP 100)
PacTBopm-ель для образцов 6 пузырьков (9 мл каждый); Готов к использованию;
(желтый цвет); фосфатно достаточно для 6 х 30 расгеорений Хранить при 2-8 “С до истечения
буферный растаор, содержащий (оборудование: растворение 1:100) срока годности
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0,095
%%))______________________________
Конъюгат IgG Eli А (№ артикула 83-1002-01)
ККпонн-ъцюшггаятт 1IgпGП f(nсMиHнiиfliйii цiifвwеiтT)V; f6i пузырьков ((4.8 мл каждый); Готов к использованию;
fl-Галактозидаза анти-IgG достаточно для 6 X 48 определений Хранить при 2-8 °С до истечения
(моноклональные антитела срока годности
мышей) в фосфатно-буферном НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ'
растворе, содержащем
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0,06 %);
символ: B-G
Конъюгат IgG EliA (Ns артикула 83-1005-01)
Конъюгат IgG (синий цвет); 2 пузырька (4.8 мл каждый); Готов к использованию
fi-Галактозидаза анти-IgG достаточно для 2 х 48 определений Хранить при 2-8 °С до истечения
(моноклональные антитела срока годности
мышей) в фосфатно-буферном НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ'
растворе, содержащем
альбумин бычьей сыворотки,
детергент и азид натрия (0.06 %);
символ: EI-G
Калибраторы IgG Eli А (№ артикула 83-1000-01)
IgG человека (О, 4,10, 20,100, 6 пузырьков для Готов к использованию
600 ug/l); в фосфатно-буферном одноразового использования Хранить при 2-8 '’С до истечения
растворе, содержащем (0.3 мл каждый); срока годности
альбумин бычьей сыворотки, достаточно для одной
детергент и азид натрия (0.095 %) калибровочной кривой
символ:
Cat-О, СаИ, СаИО, Са1-20,
Са1-100. Са1-600
Произведено из сыворотки крови человека
Контроль кривой ЕИА IgG (№ артикула 83-1001-01}
IgG человека (20 уг/л1); в 6 одноразовых пузырьков (0.3 Готов к использованию;
фосфатно-буферном мл каждый); достаточно для 6 Хранить при 2-8 ’С до
растворе, содержащем обработок истечения срока годности
альбумин бычьей
сыворотки,
детергент и азид натрия
(0,095 %)
символ; СС-1
Произведено из сыворотки крови человека
Калибраторная лунка ЕНА IgG (№ артикула 14-5509-01)
Калибраторная лунка IgG, 4 Н0с1ггеля (12 лунок на Готов к использованию;
покрытая мышиными каждый); достаточно для 48 Хранить в сухом состоянии
моноклональными определений при 2-8 °С до истечения
антителами; краткое срока годности
наименование; Gcal НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Лунка-имитация ЕИА (N9 артикула 14-5510-01)
Лунка-имитация, необходимая 4 носителя (12 лунок на Готов к использованию;
для системы InnmunoCAP 100 каждый); достаггочно для Хранить в сухом состоянии
System для пустых позиций 48 определений при 2-8 “С до истечения
гппкя гппнпгти
Общие реактивы ImmunoCAP 100
Раствор для проявки ImmunoCAP (№ артикула. 10-9478-01)
Раствор для проявки 6 пузырьков (6 мл each); Готов к использованию;
0.01 % 4- реактивы для 6 х 48 Хранить при 2-8 "С до
метилумбериферил-й-D- определений истечения срока годности
галаю-озид, 0.05 % Kathon CG НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Стоп-раствор ImmunoCAP (№ артикула. 10-9479-01)
Стоп-раствор б флаконов (65 мл к); Готов к использованию;
4 % карбонат натрия ‘реактивы для 6 х 240 Хранить при 2-8 °С до
определений истечения срока годности
HF ЯАМПРАЖИВАТН'
В связи с различными процессами анализа ImmunoCAP и EliA ожидается небольшой объем осадка.
Промывающий раствор ImmunoCAP {№ артикула 10-9422-01/10-9202-01)
Дополнительная информация представлена на вкладышах в упаковках промывающего раствора.
Срок годности каждого набора реагентов указывается на внешней этикетке. Однако каждый
компонент сохраняет стабильность до даты, указанной на соответствующей этикетке пузырька.
Материал, не входящий в объем поставки; очищенная вода, градуированный цилиндр.
Предупреждения и предостережения;
• Для диагностических целей в лабораторных условиях.
• Не используйте реактивы с истекшими сроками годности.
• Мы не рекомендуем смешивать реактивы.
• При использовании реактивов используйте защитные перчатки.
• Некоторые реактивы изготовлены из компонентов крови человека. Материал источника был
проверен при помощи иммунологической пробы на поверхностный антиген к гепатиту В, на
антитела к ВИЧ1, ВИЧ2 и вирусу гепатита С, результаты исследований - отрицательные. Тем не
менее, необходимо соблюдать рекомендации по работе с производными крови. См. публикацию
Службы здоровья человека (HHS) №(CDC) 93-8395 или прочие местные/национальные
руководства по безопасности при работе в лабораториях.
ВНИМАНИЕ' Осторожно обращайтесь с реактивами, содержащими азид натрия (NaNs) в качестве
консерванта. Азид натрия (NaNj) может вступать в реакцию со свинцом и медью в водопроводных
системах и образовывать высоко взрывчатые азиды металлов. При утилизации используйте
большое количество воды, чтобы предотвратить формирование азидов. См. Процедуры по
обезораживанию, указанные в руководствах Центров по контролю и предотвращению заболеваний
(CDC) и иными местными инструкциями.
Бутыль для отходов и контейнер для отработанных лунок ImmunoCAP/EliA могут быть заражена
потенциально инфекционным материалом. Предпринимайте соответствующие меры безопасности и
используйте защитные перчатки.
Признаки нестабильности
ПО ImmunoCAP 100 имеет встроенные предельные значения для калибровочной кривой и средства
контроля кривой. Дополнительная информация представлена в Руководстве по эксплуатации/Инструкции
пользователя ImnnunoCAP 100.
ОБОРУДОВАНИЕ
Реактивы EiiA предназначены для использования с ПО ImmunoCAP 100, версия 2.0 ипи выше.
Оборудование ImmunoCAP 100 обрабатывает все этапы иммунологического исследования и
автоматически распечатывает результаты после завершения теста. Дополнительная информация по
настройке параметров анализа, оборудованию и ПО представлена в Руководстве по
Эксплуатации/Инструкции пользователя ImmunoCAP 100.
ОТБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Могут использоваться образцы плазмы или сыворотки крови. Анализ матриц (гепарин, ЭДТА, цитрат) не
показал существенных отличий в результатах липемически, гемолизированных образцов или образцов с
микробным заражением при проведении теста EliA дцДНК. Не разрешается повторно замораживать и
оттаивать образцы крови. Температура хранения образцов должна поддерживаться на уровне -20 °С (-
4F’) или ниже для повторных измерений.
Растворение образцов
Растворение образцов должно производиться при помощи растворителя для образцов EliA. Раствор 1:10
образцов необходим для проведения теста EliA дцДНК. Растворение образцов может проводиться вручную,
однако, мы рекомендуем производить растворение на оборудовании, растворение включается в набор настроек
ПО оборудования ImmunoCAP 100.
ПРОЦЕДУРА
Использование лунки дцДНК EliA
Перед открьп"ием мешочка из фольги необходимо довести температуру до комнатной температуры. В целях
стабильности носители следует поместить в мешочки из алюминиевой фольги сразу после выемки лунок. В
связи с тем, что важно хранить лунки в сухих условиях при температуре 2-8 °С, мешочек должен быть
надлежащим образом герметизирован. Срок годности после первого открытия: 9 месяцев, если данный
срок не ограничивается сроком, указанным на носители и мешочке из алюминиевой фольги.
Код партии лунки дцДНК ЕИА
Обязательно введите код партии лунки дцДНК EIIA , Этот код указывается на носителе и мешочке из
алюминиевой фольги в виде йкод^, он зашифрован на штрих-коде мешочка из алюминиевой фольги.
Предпочтительно использовать считывающее устройство для штрих-кодов.
Код партии калибраторной лунки дня 1дСдцДНК EliA
Обязательно введите код партии калибраторной лунки для IgG дцДНК EIIA Этот код указывается на
носителе и мешочке из алюминиевой фольги в виде Вкодй, он зашифрован на илрих-коде мешочка из
алюминиевой фольги. Предпочтительно использовать считывающее устройство для штрих-кодов.
Обязательно введите код партии конъюгагта для IgG дцДНК EisA . Этот код указывается на носителе и
мешочке из алюминиевой фольги в виде Вкод(1, он зашифрован на шфих-коде мешочка из алюминиевой
фольги. Предпочтительно использовать считывающее устройство для илрих-кодов
Объемы для определения
Объемы реактивов для определения
Калибратор 90
Конъюгат IgG EliA мкп
Раствор для проявки 90мкл
Стоп-раствор 200мкл
Ручное разведение: 90 мкл разведенного образца
Разведение оборудованием 9 мкл неразведенного образца
/i-inv
Мертвые объемы для пробирок указаны в Инструкции по Эксплуатации/Руководстве пользователя
ImmunoCAP 100.
Объемы реактивов на процедуру
Раствор для промывки 1 Г
Моющий раствор 1 1*
Остаточный объем зависит от количества образцов и использованного метода разведения.
Комментарии по процедуре
• При использовании функции ПО «по умолчанию» производится одна обработка образцов.
• Раствор для промывки при использовании должен быть комнатной температуры.
• Общее время обработки составляет 2,5 часов при обработке 48 лунок.
• Инкубация производится автоматически при 37 °С (98.6 °F) оборудованием ImmunoCAP 100.
• ПО > 2,1 / 022; Если вы хотите провести более одного анализа на пациента, вы можете использовать
следующие заранее установленные контрольные панели;
Панель Описание Включенные тесты ЕМА
рапа Заболевания соединительной ткани дцЦНК, U1RNP, RNP70, Sm, Ro, La, Scl-70, CENP, Jo-1
psie Красная волчанка дцДНК, Sm, Ro, La
КАЛИБРОВКА И ЭТАЛОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Калибровочную фивую получают при использовании Калибраторов IgG EliA. которые обрабатываются
дважды. Кривая записывается, а результаты последующих анализов оцениваются в сравнении с сохраненной
кривой при использовании только Контроля кривой EiiA IgG {обрабатываются дважды).
Калибровочные стандарты IgE контролируются посредством сплошной цепи калибровок на
соответствие с международным эталонным материалом (IRP) 67/86 Иммуноглобулинов сыворотки
человека А, G и М из Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).
Новая калибровочная кривая составляется, если:
• Последняя калибровка проводилась более одного месяца назад, или
• Была введена новая партия Конъюгата IgG EliA, или
• Контроль кривой EliA IgG выходит за установленный диапазон (определенный в ПО ImmunoCAP 100).
diM ^LW4m\ luu mu|jut3ivy n«i vuu i oci«. < omc i-иглу ri\r:/t^yna\j\jfj,nKJnny ч^югчлоН'У anivi-
двухцепочечной ДНК под кодом Wo/80. Результаты представлены в Международных единицах
(МЕУмл).
Контроль качества
Регистрация данных
Лаборатории должны записывать номера партий использованных компонентов, даты открытия ампул
и оставшиеся обьемы.
Контрольные образцы:
Лаборатории должны использовать контрольные образцы при каждой обработке образцов. Все
использованные материалы должны быть исследованы повторно, чтобы установить средние
значения и интервал приемлемых значений.
Для контроля измерений имеются контрольные образцы EliA.
РАСЧЕТ И ТОЛКОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Представление результатов
Оборудование ImmunoCAP 100 измеряет концентрации специфического IgG в мкг/л. При
использовании фактора пересчета в зависимости от кода лунки EliA дцДНК. результаты автоматически
переводятся в МЕ/мл.
Толкование результатов теста
Диапазон результатов теста (отрицательный, допускающий двойное толкование, положительный),
Тест Единицы Отоииательный Двусмысленный Положительный
ЕГЛдцДНК измеоения < 10 10 - 15 > 15
МЕ/мл
Добросовестная практика рекомендует, чтобы каждая лаборатория устанавливала свои собственные
интервалы ожидаемых значений,
ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ
Определенный клинический диагноз не может основываться на результатах одного
диагностического метода, а может быть поставлен терапевтом только после оценки всех
клинических и лабораторных исследований.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Повышенные концентрации антител у аутоиммунных лиц зависит от области заболевания. Доля
сыворотки крови от здорового населения с положительной реакцией на дцДНК антитела,
! обнаруживаемая тестом EliA дцДНК составляет менее 1 %. Ожидаемые значения варьируются а
I зависимости от исследуемого населения.
I
I Результаты, полученные для здоровых лиц
i Распределение частоты антител дцДНК исследовалось на группе здоровых пациентов, в равной мере
i распределенных по полу и возрасту при использовании сыворотки крови от представителей
’ европеоидной расы, полученной из банка крови. Результаты представлены в таблице далее.
Тест Единицы измерения Кол-во Среднее 95%- 99%-
образцов значение процентиль процентиль
ЕГ|АД14ДНК МЕ/МЛ 400 2.4 6,3 17,3
РАБОЧИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диапазон измерений
Диапазон измерений (лимит определения, верхний лимит) для EliA дцДНК составляет от 0.5 до > 400
МЕ/мл. Эффекта «ловушки» не наблюдается в концентрациях до 10-кратного увеличения диапазона
измерений.'')
Только значения над лимитом определения могут рассматриваться как действительные результаты.
Верхний лимит наблюдаемых результатов может изменяться в связи с пересчетом в зависимости от
партии от мкг/л до МЕ/мл. Результаты над верхним лимитом указываются как «превышающие лимит
результаты».
Обращаем ваше внимание, что в связи с различными характеристиками связывания антител в образцах
крови пациентов, не вся сыворотка может линейно использоваться для определения диапазона
измерений.
Специфичность
Тест EliA дцДНК позволяет определять антитела IgG к антигену дцДНК в соответствии с описаниями в
Разделе “Реактивы".
Точность
Для определения точности анализа изменчивость оценивалась в исследованиях с использованием 36
обработок при оценке положительных образцов по 108 повторов на 3-ёх системах с калибровочной
кривой при каждой обработке. Статистическая оценка производилась посредством вариационного
анализа. Результаты представлены в таблице далее,
Тест Образец Единица Среднее Коэффициенты вариации (%)
измерения значение Внутри обработки Между обработками
1 МЕУмл 11.3 6.1 7.2
EliA дцДНК 2 МЕ/мл 18.6 3.6 3 7
3 МЕ/мл 56 6 4.1 3.3
А МЕ/мл 102 4 0 2,8
5* МЕ/мл 273.3 5.4 7 8
* Образцы 1 и 5 обрабатывались 18 раз по 54 повтора на трех различных системах с калибровочной
кривой для каждой обработки.
ГАРАНТИЯ
Рабочие характеристики, представленные здесь, были получены при использовании
вышеуказанной процедуры. Любые изменения и модификации процедуры, не
рекомендованные Phadia АВ, могут повлиять на результаты, в этом случае
Phadia АВ отказывается от всех выраженных гарантий, подразумеваемых или требуемых по
закону, включая гарантии годности для продажи и употребления,
Phadia АВ и ее уполномоченные дистрибьюторы в этом случае не несут ответственности за
косвенный или последовательный ущерб.
Примечания
‘^'Исследования проводились в Phadia Gmb, Фрайбург, Германия
СПРАВОЧНАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Hochberg МС (1997) Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the
classification of systemic Lupus erythematosus. Arthritis Rheum 40, 1725
2. Swaak AJG, Smeenk RJT (1996) Clinical aspects of antibodies to double-stranded DNA. In: Manual
of Biological Markers of Disease, Van Venrootj WJ, Maini RN (eds), KLUwer Academic Publishets,
Dordrecht, Boston, London
3. Linnik MD, Hu JZ, Heilbrunn KR et al (2005) Relationship between anti-double-stranded DNA
antibodies and exacerbation of renal disease in patients with systemic Lupus erythematosus. Arthritis
Rheum 52, 1129-1137
4. Kavanaugh AF, Solomon DH (2002) Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic
diseases: anti-DNA antibody tests. Arthritis Rheum 47, 546-555
5. Lopez Hoyos M, Cabeza R, Martinez Taboada VM et al (2005) Clinical disease activity and titers of
anti-dcDNA antibodies measured by an automated immunofluorescence assay in patients with
systemic Lupus erythematosus, LUpus 14, 505-509
Содержит азид
LOT Код партии
А натрия
l@) Биологический Содержит X
риск V определений
r Хранить при Прочтите
/температуре/ т инструкции
пользователя
s Дата истечения d Произнодитель
срока годности
|IVD Д ди л а я г н л о а с б т о и р ч а е т с о к р и н х ых Ф п Н о е в и т с о п р о н л о ьзуйте
исследований
Phadia AB
SE-75 137 Аппсала,Швеция
С € Тел: +46-18-16 50 60 Факс: +46-18-14 03 58
E-mail: autoimmunitv@phadia com / Internet: www phadia com
Опубликовано в мае 2008 года
© Phadia GmbH, Фрайбург. Германия
I