Тест-системы диагностические in vitro для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний (см. Приложение на 1 листе) — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
Микропланшет, покрытый антигеном к gG-2 вируса HVS.
Специфические антитела к gG-2 из пробы пациента выборочно связываются с антигеном.
Конъюгированные пероксидазой античеловеческие IgG- антитела связьшаются с gG-2 (Р
= пероксидаза).
Инкубация с субстратом ТМВ (*). Реакция останавливается добавлением серной кислоты.
Результат считывается фотометрически.
Преимущества теста
• С помощью дозировочной системы контроля можно визуально отслеживать
каждый шаг пипетки благодаря изменению цвета.
• Ломающиеся микротитровые стрипы обеспечивают оптимальное использование
теста.
• Возможна автоматизация на открытых системах ELISA.
Содержимое упаковки Кат. №.: 136-PKS
1. МТР
Микропланшет; 12 стрипов по лунок, маркированных белым цветом (с рамкой и
8
влагопоглотителем в запаянном вакуумном алюминиевом чехле), ломающихся, U-
образных, покрытых рекомбинантным антигеном вируса HVS, В А(альбумин
8
бычьей сыворотки) и рН-индикатором, готов к использованию.
2. CONTROL-
Отрицательный контроль: 1 флакон 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов^
использованию, содержит альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол, ProCIin™
300 и гентамицина сульфат.
3. CONTROL +
Положительный контроль: 1 флакон 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, содержит FKS, альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол,
РгоСИп™ 300 и гентамицина сульфат.
4. WB
Промьш)чный буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (IQx), pH 7,2 - 7,4, содержит
ProClin™300.
5. VIR-DIL
Буфер для разбавления проб: 1 флакон 110 мл, PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, готов
к использованию, содержит ProClin™ 300.
CON
Конъюгат: 3 флакона по 4,5 мл, козьи античеловеческие IgG-антитела, HRP-
коньюгированные, готов к использованию, окрашен в зеленый цвет, содержит
альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол, РгоСИп^ 300 и гентамицина сульфат.
тмв
Субстрат ТМВ: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
8. STOP
Стоп-раствор: 2 флакона по 11 мл, 0,5 М серной кислоты (H SO ), готов к
2 4
использованию.
1. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ
Материал/Реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест-набор закрытый 2...8 °С До истечения срока годности
Микропланшет открытый 2 ...S ®С в сумке с 6 недель
влагопоглотителем
Контроли/ открытые 2...S °С недель
6
калибратор
Промывочный буфер разведенный °С недель
2 ...8 6
Буфер для разбавления открытый 2...S °С недель
6
проб
Конъюгат открытый 2...8 °С недель
6
Субстрат ТМВ открытый ...S °С недель
2 6
Стоп-раствор открытый ...S X До истечения срока годности
2
Не использовать реагенты после истечения указанного срока годности.
2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
. . Aqua ad iniectabilia (вода для инъекций, бидистшшрованная Н О). Использование
2 1 2
деионизированной воды может привести к ошибкам в системе теста.
. . Микропипетки с изменяемым объемом.
2 2
2.3. Чистые стеклянные или пластиковые сосуды для |шведения промывочного буфера
3
и проб.
2.4. Соответствующее оборудование для промывания микропланшета (например,
мультистеппер или вошер ELISA).
2.5. Инкубатор с температурой 37 °С.
. . Микропланшетный фотометр (ридер) с фильтрами на 450 нм и 620 -650 нм.
2 6
3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Перед началом теста все компоненты набора должны быть доведены до комнатной
температуры.
Посчитайте, сколько лунок вам потребуется.
3.1. Микропланшет
Алюминиевый чехол с влагопоглотителем должен быть плотно закрыт после
каждого отбора проб. Условия хранения и стабильность неиспользованных лунок
указаны в пункте .
1
Примечание; лунки мвкропланшета имеют легкий зеленый оттенок. В
некоторых случаях в лунках появляются зеленовато-коричневые пятна. Это
обусловлено производственным процессом и не влияет на результаты теста.
3.2.
Одна часть промывочного буфера (10х) смешивается с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл промьшочного буфера (10х) на 450 мл воды для
инъекций). На восемь лунок потребуется 10 мл промывочного буфера.
Если в промывочном буфере (10х) присутствуют кристаллы, то перед
составлением смеси их необходимо растворить при помощи нагревания (макс.
37 °С) и/или размешивания при комнатной температуре.
Реагенты, специально предназначенные для теста (мякроплаишет, контроли,
конъюгат, калибратор), нельзя смешивать с реагентами из других наборов (партий).
В противоположность этому буфер для разбавления проб, промывочный буфер,
субстрат ТМВ и стоп-раствор являются, как правило, взаимозаменяемыми для всех
вирусологических тестов компании medac.
Не используйте реагенты других производителей.
Действительные и воспроизводимые результаты можно получить только при
точном соблюдении технологической инструкции.
4. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Тест подходит для изучения человеческой сыворотки.
4.2. Сыворотки не требуют предварительной обработки (например, инактивации), тем
не менее, они не должны бьпъ заражены микробами и микроорганизмами или
содержать эритроциты.
4.3. Сьшоротки разводят буфером для разведения проб в пропорции 1:200. Сначала мы
рекомендуем сделать раствор 1:50 (например, 10 мкл сыворотки + 490 мкл буфера
для разведения проб). Для дальнейшего разведения в пропорции 1:4 просто
приготовьте необходимый объем.
5.А. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ
5.1. Разрежьте алюминиевую сумку над креплением молнии, и достаньте необходимое
количество лунок планшета (см. пункт 3.1.).
Лунки микропланшета готовы к использованию и не требуют
предварительной промывки.
52. Лунка А1 остается свободной в качестве бланка или контрольной лунки (см. пункт
.А.). С пипетки внесите в лунки микропланшета по 50 мкл
6 ПОМОПЦ.Ю
отрицательного контроля, положительного контроля, а также проб в простом
определении и 50 мкл калибратора в двойном определении.
После внесения проб (рН-нейтральные или базовые жидкости) цвет меняется
на голубой/зеленый. Если в одной из лунок не происходит изменение цвета,
это говорит о том, что в лунку не внесены проба или контроль.
При необходимости лунки микроплаишета можно выдержать до 30 мин при
комнатной температуре перед обработкой.
5.3. Инкубируйте лунки в течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре 37°С (± 1 °С) во
влажной камере или заклеенными фольгой в качестве покрытия при инкубации.
5.4. После инкубации три раза промойте лунки микропланшета, используя по 200 мкл
промывочного буфера на каждую лунку. Следите за тем, чтобы во время промывки
все лунки были заполнены. После окончания промывки слейте содержимое лунок
планшета на фильтровальную бумагу.
Не допускайте высыхания лунок! Используйте незамедлительно!
5.5 С помощью пипетки внесите во все лунки (кроме А1) коньюгат (окрашен в зеленый
цвет).
При проведении теста вручную вносите 50 мкл конъюгата в каждую лунку.
Пожалуйста, обратите внимание:
При работе с автоматическими системами необходимо внести по 60 мкл
коньюгата в каждую лунку по причине более сильного испа{еиия в
1
инкубационных камерах автоматических систем.
Пригодность теста для автоматизированной обработки была
продемонстрирована во время его оценки. Тем не менее, мы рекомендуем
проверить совместимость теста с используемыми вами устройствами.
5.6. Снова поместите лунки во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в
течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре 37°С (± 1°С).
5.7. После инкубации промойте лунки микропланшета еще раз (см. пункт 5.4.)*
5.8. Внесите с помощью пипетки 50 мкл субстрата ТМВ в каждую лунку (включая А1),
поместите во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в темноте в
течение 30 мин. (± 2 мин.) при температуре 37 °С (± 1 °С). поменяют цвет на синий.
5.9. Остановите реакцию, добавив в каждую лунку (включая А1) по 100 мкл стоп-
раствора. Положительные пробы поменяют цвет на желтый.
Перед фотометрическим измерением необходимо протереть наружную поверхность
лунок и проследить за тем, чтобы в них не было пузырьков воздуха.
Измерение нужно провести в течение 15 минут после добавления стоп раствора.
5.Б. ТАБЛИЦА К ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ИНСТРУКЦИИ
Контр, лунка >грицательный Положительный Проба
(А1) контроль контроль
Отрицательный контроль - 50 мкл - -
Положительный контроль - - 50 мкл -
Образец - - - 50 мкл
Инкубировать в течение 60 минут при 37 С, промыть 3раза промывочным буфером по
2 0 0
мкл на одну лунку
Конъюгат - 150/60 мкл*') 50/60 мкл*) 150/60 мкл*)
Инкубировать в течение 60 минут при 37 С, промыть 3 раза промывочным буфером по 200
мкл на одну лунку
Субстрат ТМВ |50 мкл 50 мкл 50 мкл [50 мкл
Инкубировать в течение 30 минут при 37 С в темноте.
Стоп-раствор 1 1100 мкл [1 0 0 мкл 1 0 0 мкл 1100 мкл
Фотометрическое считывание результата при 450 нм
(длина референс-волны света 620-650 нм)
*) ручная/автоматическая обработка (см. 5.5)
6 ОПЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА ГВАЛИДНОСТЬ>
* Фотометрическое считывание происходит при длине волны 450 нм (референс-
волна 620-650 нм).
* Оптическая плотность (ОП) контрольной пробы/бланка (лунка А1) вычитается из
всех значений ОП.
* Усредненное значение негативного контроля должно быгь < 0,150
Усредненное значение позитивного контроля должно быть > 0,800
* Cut-off = Усредненное значение негативного контроля + 0Д40
* Серая зона = Cut-off ± 10 %
Повторите тесты, если результаты не соответствуют спецификации.
6.Б. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ПРЕДЕЛЫ МЕТОДА
* Пробы с величинами 0D ниже нижнего уровня серой зоны засчитываются как
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ относительно действующего иммунитета.
* Пробы с величинами 0D в пределах серой зоны засчитываются как
ГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ. Эти пробы необходимо снова протестировать вместе
со свежими пробами, взятыми у пациента через 14 дней, на предмет изменения
динамики титра.
* Пробы с величинами 0D вьппе верхнего уровня серой зоны засчитываются как
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ относительно действующего иммунитета.
* Результаты теста должны всегда интерпретироваться с учетом клинической
картины пациента, результатов исследований HSV-l/2-IgG -IgG и других
диагностических параметров.
* Высокие концентрации липидов и гемоглобина не влияют на результаты теста.
7> ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были получены нами в рамках диагностической оценки,
7.А. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
46 образцов сывороток были протестированы во время диагностической оценки.
Результаты были сопоставлены с диагностическими характеристиками германской
образцовой лаборатории в Йене, занимающейся изучением вирусов HSV и VZV.
Полученные результаты приведены ниже в таблице:
Предаарительво определенные 1Ш]^метры от
7
германской образцовой лаборатории
HSV-2-IgG- негативные граничные позитивные
ELISA PKS негативные 10 0 0
medac граничные 0 0 0
позитивные 0 0 36
Специфичность = 100%
Чувствительность = 100%
Соответствие: 100%
Тестирование 150 сывороток, полученных от доноров крови, дали в результате
преобладание антител к вирусу HSV-2-IgG на 12,7 %. Соответствие с номинальными
результаталш составило 99,3 %. Номинальные результаты были определены в сравнении
со специфическим к HSV-2 иммуноблотом ELISA/Immimoblot.
Номинальные результаты
HSV-2-IgG- негативные граничные позитивные
ELISAPKS негативные 130 0 0
medac граничные 0 0 0
позитивные 0 0 19
гВ. ТОЧНЫЕ ЗАМЕРЫ
Проба Отклонение результатов одного анализа Проба Отклонение результатов разныж анализов
(Intra-assay variation) (Inter-assay variation)
Усреднен. SD CV п Усреднен. SD СУ п
значение значение
(%) (%)
OD OD
NC 0,049 0,006 12,2 22 NC 0,033 0,0 21,2 11
ВС 0,396 0,013 3,3 22 ВС 0,352 0,0 4,5 11
PC 1,297 0,031 2,4 22 PC 1ДЗЗ 0.0 3,9 11
№1 0,069 0,010 14,5 22 №6 0,045 0,0 ИД 11
№2 0,085 0,012 14,1 22 №7 0,126 0,0 7,1 11
№3 0,387 0,013 3,4 22 №8 0377 0,0 5,6 И
№4 0,815 0,024 2,9 22 №9 0,877 0,0 3,4 11
№5 1,251 0,033 2,6 22 №10 2,660 0,0 2,9 11
N = отрицательный контроль; ВС = слабый положительный контроль; PC =
положительный контроль.
ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
* Не путайте флаконы с реагентами и их крышки, чтобы избежать перекрестного
загрязнения.
* Сразу же после использования плотно закрывайте флаконы с реагентами, чтобы
избежать испарения и микробиологического заражения.
* После использования реагенты необходимо хранить в соответствии с
предписанными условиями, чтобы обеспечить указанный срок службы.
* Чтобы избежать путаницы и смешения с реагентами другой тестовой системы или
партии, все компоненты набора одного теста должны бьпъ помещены сразу после
использования в оригинальную упаковку (см. также пункт 3).
УКАЗАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ
* Соблюдайте общеобязательные государственные правила техники безопасности.
* Реагенты, в которых использованы компоненты человеческого происхождения,
были протестированы на наличие HBsAg, Anti-HTV 1/2 и Anti-HCV и признаны
неинфицированными. Тем не менее, с такими реагентами, а также с реагентами,
составные части которых имеют животное происхождение (см. «Содержимое
упаковки»), необходимо обращаться как с потенциально инфекционно-опасными,
чтобы избежать риска заражения.
УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ
Остатки химикаты и препаратов относятся к опасньпй отходам. Утилизация таких отходов
регулируется государственными и региональными законалш и нормами. Информацию о
местах и порядке утилизации предоставляют компетентные органы власти или
предприятия, занимающиеся утилизацией отходов.
Дата выпуска: 15.11.2009
ЛИТЕРАТУРА
Эшли Р. Л., Уальд А.: Генитальный герпес: Обзор эпидемии и потенциальное
использование типоспецифической серологии. СИп Microbiol. Rev.l2 (1), 1-8 (1998).
Бергстрем Т., Трайбела Е.: Антигенные различия между гликопротеинами вирусов HSV-1
и HSV-2, а также их важность для типоспецифической серологии. Intervirology 39, 176-
184(1996).
Кимберлин Д. У.: Неонатальное инфицирование вирусом простого герпеса. Clin Microbiol.
Rev. 17 (1), 1-13 (2004).
Крибс И. М .: Понимание вируса простого герпеса: распространение, диагностика и
соображения по методике лечения при беременности. Журнал Midwifery Womens Health
53 (3), 202-208 (2008).
Мертенс Т., Хеллер О., Кленк Х-Д. (Hrsg.): Диагностика и терапия вирусных заболеваний.
126-137, издательство Urban &Fischer (2004).
Петерсен Е. Е., Дор X. В., Гросс Г., Петцольд Д., Вайзенбахер Е. Р., Вутцлер П.:
Генитальный герпес. 96,38, А-2358-2364 (1999).
Зауэрбр>ай А., Вютцлер П.: Инфицирование вирусами простого герпеса и ветряной оспы
при беременности. Современные концепции предотвращения, диагностики и терапии.
10
4. WB
Промывр;шый буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10х), pH 7,2 - 7,4, содержит
ProClin™300.
5. VIR-DIL
Буфер для разбавления проб: 1 флакон 110 мл, PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, готов
к использованию, содержит РгоСИп™ 300.
6. ANTIGEN-DIL
Растворитель антиггаов: 1 флакон с 14 мл PBS/Tween, готов к использованию,
содержит РгоСИп 300.
7. ANTIGEN
Антиген: 6 флаконов, каждый содержит по 2,0 мл высушенного в вакууме HSV-
антигена/BSA/FCS.
8. CON
Коньюгат: 1 флакон по 0,35 мл, содержит HSV-IgG антитела, моноклональные
антитела (мьппей) HRP-коньюгированные, готов к использованию, фашен в
01
красный цвет, содержит альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол, ProClin™ 300 и
гентамицина сульфат.
9. ТМВ
Субстрат ТМВ: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
10. STOP
Стоп-раствор: 2 флакона по 11 мл, 0,5 М серной кислоты (H SO ), готов к
2 4
использованию.
1. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ГТАКИЛКНОГТЬ
Матернал/Реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест-набор закрытый 2...8 °С До истечения срока годности
Микропланшет открытый 2...S в сумке с 6 недель
влагопогло тигелем
Контроли открытые 2...8 °С 6 недель
Промывочный буфер разведенный 2...S ®С 6 недель
Буфер для разбавления открытый 2...S °С 6 недель
проб
Растворитель антигена открытый 2...S °С 6 недель
Коньюгат открытый 2...8 °С 6 недель
Смесь антиген-конъюгат готовая к При комнатной 6 часов
использованию температуре
Субстрат ТМВ открытый 2...S °С 6 недель
Стоп-раствор открытый 2...S °С До истечения срока годности
Не использовать реагенты после истечения указанного срока годности.
2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.1. Aqua ad iniectabilia (вода для инъекций, бидистилированная Н О). Использование
2
деионизированной воды может привести к ошибкам в системе теста.
2.2. Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3. Чистые стеклянные или пластиковые сосуды для разведения промывочного буфера
и проб.
2.4. Соответствующее оборудование для промывания микропланшета (например,
мультистеппер или вошер ELISA).
2.5. Инкубатор с температурой 37 °С.
2.6. Микропланшетный фотометр (ридер) с фильтрами на 450 нм и 620 -650 нм.
3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Перед началом теста все компоненты набора должны быть доведены до комнатной
температуры.
Посчитайте, сколько лунок вам потребуется.
3.1. Микрр.планшет
Алюминиевый чехол с влагопоглотителем должен быть плотно закрыт после
каждого отбора проб. Условия хранения и стабильность неиспользованных лунок
указаны в пункте 1.
Примечание: лунки микропланшета имеют легкий зеленый оттенок. В
некоторых случаях в лунках появляются зеленовато-коричневые пятна. Это
обусловлено производственным процессом и не влияет на результаты теста.
3.2. Промывочный буфер
Одна часть промывочного буфера (10х) смешивается с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл промывочного буфера (10х) на 450 мл воды для
инъекций). На восемь лунок потребуется 10 мл промывочного буфера.
Если в промывочном буфере (10х) присутствуют кристаллы, то перед
составлением смеси их необходимо растворить при помощи нагревания (макс.
37 ^С) и/или размешивания при комнатной температуре.
3.3 Смесь антиген-конъюгат
Перерастворите антигены из лиофильного состояния с помощью 2,0 мл
антигенного растворителя для каждого из них. Аккуратно размешайте и
позаботьтесь о том, чтобы частицы, прилипшие к пробке, тоже растворились.
Добавьте 50 мл конъюгата к 2,0 мл антигена перед использованием.
После перерастворения антигенов и добавления конъюгата смесь антигена и
конъюгата приобретает красный цвет и становится готовой к использованию.
Готовая к использованию смесь антигена и конъюгата может быть
использована при комнатной температуре в течение 6 часов (см. 1).
Реагенты, специально предназначенные для тесга (микропланшет, контроли,
конъюгат, калибратор), нельзя смешивать с реагентами из других наборов (партий).
В противоположность этому буфер для разбавления проб, промывочный буфер,
субстрат ТМВ и стоп-раствор являются, как правило, взаимозаменяемыми для всех
вирусологических тестов компании medac.
Не используйте реагенты других производителей.
Действительные и воспроизводимые результаты можно получить только при
точном соблюдении технологической инструкции.
4. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Тест подходит для изучения человеческой сыворотки.
4.2. Сыворотки не требуют предварительной обработки (например, инактивации), тем
не менее, они не должны быть заражены микробами и микроорганизмами или
содержать эритроциты.
4.3. Сыворотки разводят буфером для разведения проб в пропорции 1:100
5.А. ТЕХНОЛОГИтеСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ
5.1. Разрежьте алюминиевую сумку над креплением молнии, и достаньте необходимое
количество лунок планшета (см. пункт 3.1.).
Лунки MHiqponAaHmera готовы к использованию н не требуют
предварительной промывки.
5.2. Лунка А1 остается свободной в качестве бланка или контрольной лунки (см. пункт
6.А.). С помопцоо пипетки внесите в лунки микропланшета по 50 мкл каждой из
разведенных проб, а также отрицательного контроля и положительного контроля в
двойном определении.
После внесения проб (рН>нейтральные или базовые жидкости) цвет меняется
на голубой/зеленый. Если в одной из лунок не происходит изменение цвета,
это говорит о том, что в лунку не внесены проба или контроль.
При необходимости лунки микропланшета можно выдержать до 30 мин при
комнатной температуре перед обработкой.
5.3. Инкубируйте лунки в течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре 37°С (± 1 °С) во
влажной камере или заклеенными фольгой в качестве покрытия при инкубации.
5.4. Приготовьте смесь антиген-конъюгат, (см. 3.3.).
5.5. После инкубации три раза промойте лунки миьсропланшета, используя по 200 мкл
промьшочного буфера на каждую лунку. Следите за тем, чтобы во время промывки
все лунки были заполнены. После окончания промывки слейте содержимое лунок
планшета на фильтровальную бумагу.
Не допускайте высыхания лунок! Используйте незамедлительно!
5.6. Добавьте смесь антиген-конъюгат (красного цвета) в каадую из лунок (кроме А1).
При проведении теста вручную вносите 50 мкл VZV-IgM-ELA в каждую
лунку.
Пожалуйста, обратите внимание:
При работе с автоматическими системами необходимо ввести но 60 мкл смеси
антиген-коньюгат в каждую лунку по причине более сильного испарения в
инкубационных камерах автоматических систем.
Пригодность теста для автоматизированной обработки была
продемонстрирована во время его оценки. Тем не менее, мы рекомецдуем
проверить совместимость теста с используемыми вами устройствами.
5.7. Снова поместите лунки во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в
течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре ЪТС (± 1°С).
5.8. После инкубации промойте лунки микропланшета еще раз (см. пункт 5.5).
5.9. Внесите с помопц>ю пипетки 50 мкл субстрата ТМВ в каждую лунку (включая А1),
поместите во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в темноте в
течение 30 мин. (± 2 мин.) при температуре 37 °С (± 1 °С). Положительные образцы
поменяют цвет на синий.
5.10. Остановите реакцию, добавив в каждую лунку (включая А1) по 100 мкл стоп-
раствора. Положительные пробы поменяют цвет на желтый.
Перед фотометрическим измерением необходимо протереть наружную поверхность
лунок и проследить за тем, чтобы в них не было пузырьков воздуха.
Измер^ие нужно провести в течение 15 минут после добавления стоп раствора.
5.Б. ТАБЛИПА К ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ИНСТРУКЦИИ
Контр, лунка >грицательный Положительный Проба
(А1) контроль контроль
Отрицательный контроль - 50 мкл - -
Положительный контроль - - 50 мкл •
Проба - - - 50 мкл
Инкубировать в течение 60 минут при 37 ”С, промыть 3раза промывочным буфером по 200
мкл на одну лунку
Смесь антиген-коньюгат |1 - . 1[50/60 мкл*) i150/60 мкл*) 150/60 мкл*)
Инкубировать в течение 60 минут при 37 "С, промыгь 3 раза промывочным буфером по 200
мкл на одну лунку
Субстрат ТМВ 150 мкл |50мкл |50мкл 1150 мкл
Инкубировать в течение 30 минут при 37 С в темноте.
Стоп-раствор 1|ЮОмкл 1100 мкл 100 мкл 1100 мкл
Фотометрическое считьюание результата при 450 нм
(длина референс-юлны света 620-650 нм)
*) ручная/автоматическая обработка (см. 5.5)
6.А. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА (ВАЛИДНОСТЬ)
* Фотометрическое считывание происходит при длине волны 450 нм (референс-
волна 620-650 нм).
* Оптическая плотность (СП) контрольной пробы/бланка (лунка Л1) вычитается из
всех значений ОП.
* Усредненное значение негативного контроля должно быть < 0,150
Усредненное значение позитивного контроля должно быть > 0,450
* Cut-off (точка раздела между отрицательным и положительным значениями
результата теста) = усредненное значение негативного контроля + 0,140
* Серая зона = Cut-off ± 10 %
Повторите тесты, если результаты не соотвегствуют спецификации.
6.Б. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ПРЕУЩЛЫ МЕТОДА
* Пробы с величинами оптической плотности ОП ниже нижнего уровня серой зоны
засчитываются как ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ относительно действующего иммунитета.
* Пробы с величинами ОП в пределах серой зоны засчитываются как
СОМНИТЕЛЬНЫЕ. Эш пробы необходимо снова протестировать вместе со
свежими пробами, взятыми у пациента через 14 дней, на предмет изменения
динамики титра
Пробы с величинами ОП выше верхнего уровня серой зоны засчитьюаются как
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ.
Результаты теста должны всегда интерпретироваться с учетом клинической
картины пациента, результатов исследований HSV’l/2-IgG, HSV-2-IgG и других
диагностических параметров.
В случае подозрения на первичное заражение вирусом HSV-1/2 во время
беременности следует провести дальнейшую диагностику, т.е. с PCR.
Нельзя исключать, в одиночных случаях, возможности перекрестных реакций,
вызванных антителами на другие вирусы герпеса.
* Гемолитическая сьгооротка не влияет на результаты теста.
7, ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были получены нами в рамках диагностической оценки.
7.А, ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
468 образцов сывороток (270 из лаборатории проф. Эндерса с коллегами, из г. Штуптарт,
а также 198 из крови доноров из Ганновера и Шуля) были протестированы в сравнении с
предварительным определением во время диагностической оценки. Предварительное
определение было оценено с использованием двух различных тестов ELISA в качестве
основы для сравнения.
Полученные результаты приведены ниже в таблице:
Предварительно определенные параметры
HSV-l/2-IgM- негативные Cut-ofF позитивные
ELA Test
негативные 409 0 9
PKS
Cut-ofF 0 0 0
medac
позитивные 0 0 50
Специфичность = 100 %
Чувствительность = 84,7 %
Соответствие: 98Д %
га.трщдлЕ замеры
#
Проба Отклонение результатов одного анализа Проба Отклонение результатов разных анализов
(Intra-assay variation) (Inter-assay variation)
Усреднен. SD CV п Усреднен. SD CV п
значение значение
(%) (%)
OD OD
NC 0,038 0,003 8 22 NC 0,050 0,011 22 11
ВС 0,313 0,008 3 22 ВС 0,360 0,036 20 11
PC 0,562 0,017 3 22 PC 0,705 0,088 12 И
№1 0,035 0,002 6 22 №6 0,033 0,007 21 11
№2 0,073 0,005 7 22 №7 0,098 0,013 13 11
№3 0,417 0,017 4 22 №8 0,505 0,054 11 11
№4 0,609 0,020 3 22 №9 0,734 0,061 8 11
№5 1,257 0,027 2 22 №10 1,365 0,103 8 11
N = отрицательный контроль; ВС = слабый положительный контроль (не включен в
набор); PC - положительный контроль.
ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
* Не путайте флаконы с реагентами и их крьппки, чтобы избежать перекрестного
загрязнения.
* Сразу же после использования плотно закрывайте флаконы с реагентами, чтобы
избежать испарения и микробиологического заражения.
* После использования реагенты необходимо хранить в соответствии с
предписанными условиями, чтобы обеспечить указанный срок службы,
* Чтобы избежать путаницы и смешения с реагентами другой тестовой системы или
партии, все компоненты набора одного теста должны быть помещены сразу после
использования в оригинальную упаковку (см. также пункт 3).
УКАЗАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ
* Соблюдайте общеобязательные государственные правила техники безопасности.
* Реагенты, в которых использованы компоненты человеческого происхождения,
были протестированы на наличие HBsAg, Anti-HTV 1/2 и Anti-HCV и признаны
неинфицированными. Тем не менее, с такими реагентами, а также с реагентами,
составные части которых имеют животное происхождение (см. «Содержимое
упаковки»), необходимо обращаться как с потенциально инфекционно-опасными,
чтобы избежать риска заражения.
УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ
Остатки химикаты и препаратов относятся к опасным отходам. Утилизация таких отходов
регулируется государственными и региональными законами и нормами. Информацию о
местах и порядке утилизации предоставляют компетентные органы власти или
предприятия, занимающиеся утилизацией отходов.
Дата выпуска: 15.03.2010
РАТУРА
10
ПРИНПИП ТЕСТА
Микропланшет, покрытый антигеном к gG-2 вируса HVS1/2.
Специфические антитела к HVS1/2 из пробы пациента выборочно связываются с
антигеном.
Коньюгированные пероксидазой античеловеческие IgG- антитела связываются с
антителами к HVSl/2-IgG (Р = пероксидаза).
Инкубация с субстратом ТМВ (*). Реакция останавливается добавлением серной кислоты.
Результат считывается фотометрически.
Преимущества теста
• С помощью дозировочной системы контроля можно визуально отслеживать
каждый шаг пипетки благодаря изменению цвета.
• Ломающиеся микротитровые стрипы обеспечивают оптимальное использование
теста.
• Возможна автоматизация на открытых системах ELISA.
• Одноточечная количественная оценка, больше нет необходимости в стандартной
калибровочной кривой.
• Нет необходимости в дополнительной калибрационной кривой для диагностики
CSF.
Содержимое упаковки Кат, №.: 105-PKS
1. МТР
Микропланшет: 12 стрипов по 8 лунок, маркированных белым цветом (с рамкой и
влагопоглотителем в запаянном вакуумном алюминиевом чехле), ломающихся, U-
образных, покрытых рекомбинантным антигеном вируса HVS, В8А(альбумин
бычьей сыворотки) и рН-индикатором, готов к использованию.
2. CONTROL-
Отрицательный контроль: I флакон 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, содержит альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол, ProClin™
300 и гентамицина сульфат.
3. CONTROL +
Положительный контроль: 1 флакон 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованшо, содержит FKS, альбумин бычьей сыюротки (BSA), фенол,
ProClin™ 300 и гентамицина сульфат.
4. КАЛИБРАТОР
2
Калибратор: 1 флакон 1,5 мл, человеческая сьшоротка, готов к использованию,
содержит FKS, альбумин бычьей сьшоротки (BSA), фенол, ProClin’^ 300 и
гентамицина сульфат.
5. WB
Промывочный буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10х), pH 7,2 - 7,4, содержит
РгоСИп^ЗОО.
6. VIR-DIL
Буфер для разбавления проб: 1 флакон 110 мл, PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, готов
к использованию, содержит РгоСИп™ 300.
7. CON
Конъюгат: 3 флакона по 4,5 мл, козьи античеловеческие IgG-антитела, HRP-
коньюгированные, готов к использованию, окрашен в зеленый цвет, содержит
альбумин бычьей сьшоротки (BSA), фенол, ProCIin™ 300 и гентамицина сульфат.
8. ТМВ
Субстрат ТМВ: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
9. STOP
Стоп-раствор: 2 флакона по 11 мл, 0,5 М серной кислоты (H SO ), готов к
2 4
использованию.
1. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ
Материал/Реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест-набор закрытый 2...8 °С До истечения срока годности
Микропланшет открытый 2...S °С в сумке с 6 недель
влагопоглотитеяем
Контроли/ открытые 2...S °С 6 недель
калибратор
Промывочный буфер разведенный 2...S °С 6 недель
Буфер для разбавления открытый 2...8 °С 6 недель
проб
Конъюгат открытый 2...S °С 6 недель
Субстрат ТМВ открытый 2..*8Х 6 недель
Стоп-раствор открытый 2...8 °С I До истечения срока годности
Не использовать реагенты после истечения указанного срока годности.
2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.1. Aqua ad iniectabiiia (вода для инъекций, бидистилированная Н О). Использование
2
деионизированной воды может привести к ошибкам в системе теста.
2.2. Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3. Чистые стеклянные или пластиковые сосуды для разведения промывочного буфера и
проб.
2.4. Соответствующее оборудование для промьшания микропланшета (например,
мультистеппер или вошер ELISA).
2.5. Инкубатор с температурой 37 °С.
2.6. Микропланшетный фотометр (ридер) с фильтрами на 450 нм и 620 -650 нм.
3, ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Перед началом теста все компоненты набора должны бьпъ доведены до комнатной
температуры.
Посчитайте, сколько лунок вам потребуется.
3.1. Микродланшет
Алюминиевый чехол с влагопоглотителем должен быть плотно закрыт после
каждого отбора проб. Условия хранения и стабильность неиспользованных лунок
указаны в пункте 1.
Примечание: лунки микропланшета имеют легкий зеленый оттенок. В
некоторых случаях в лунках появляются зеленовато-коричневые пятна. Это
обусловлено производственным процессом и не влияет на результаты теста.
3.2. Промывочный буфер
Одна часть промывочного буфера (10х) смешивается с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл промывочного буфера (10х) на 450 мл воды для
инъекций). На восемь лунок потребуется 10 мл промывочного буфера.
Если в промывочном буфере (10х) присутствуют кристаллы, то перед
составлением смеси их необходимо растворить при помощи нагревания
(макс. 37 ^С) и/или размешивания при комнатной температуре.
Реагенты, специально предназначенные для теста (микропланшет, контроли,
коньюгат, калибратор), нельзя смешивать с реагентами из других наборов (партий).
В противоположность этому буфер для разбавления проб, промывочный буфер,
субстрат ТМВ и стоп-раствор являются, как правило, взаимозаменяемыми для всех
вирусологических тестов компании medac.
Не используйте реагенты других производителей.
Действительные и воспроизводимые результаты можно получить только при
точном соблюдении технологической инструкции.
4. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Тест подходит для изучения человеческой сьшоротки и проб ликвора CSF (методика
обнаружения CSF изложена в п.8).
4.2. Сьшоротки не требуют предварительной обработки (например, инактивации), тем не
менее, они не должны быть заражены микробами и микроорганизмами или содержать
эритроциты.
4.3. Сыворотки разводят буфером для разведения проб в пропорции 1:200. Сначала мы
рекомендуем сделать раствор 1:50 (например, 10 мкл сьшоротки + 490 мкл буфера для
разведения проб). Для дальнейшего разведения в пропорции 1:4 просто приготовьте
необходимый объем. Пробы за пределами диапазона измерения могут быть разведены
дополнительно.
5.А. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ
5.1. Разрежьте алюминиевую сумку над креплением молнии, и достаньте необходимое
количество лунок планшета (см. пункт З.1.).
Лунки микропланшета готовы к использованию и не требуют
предварительной промывки.
5.2. Лунка А1 остается свободной в качестве бланка или контрольной лунки (см. пункт
6.А.). С помощью пипетки внесите в лунки микропланшета по 50 мкл
отрицательного контроля, положительного контроля, а также проб в простом
определении и 50 мкл калибратора в двойном определении.
После внесения проб (рН-нейтральные или базовые жидкости) цвет меняется
на голубой/зеленый. Если в одной из лунок не происходит изменение цвета,
это говорит о том, что в лунку не внесены проба или контроль.
При необходимости лунки микропланшета можно выдержать до 30 мин при
комнатной температуре перед обработкой.
5.3. Инкубируйте лунки в течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре 37°С (± 1 °С) во
влажной камере или заклеенными фольгой в качестве покрытия при инкубации.
5.4. После инкубации три раза промойте лунки микропланшета, используя по 200 мкл
промывочного буфера на каждую лунку. Следите за тем, чгобы во время промывки все
лунки были заполнены. После окончания промывки слейте содержимое лунок планшета
на фильтровальную бумагу.
Не допускайте высыхания лунок! Используйте незамедлительно!
5.5 С помощью пипетки внесите во все лунки (кроме А1) конъюгат (окрашен в зеленый
цвет).
При проведении теста вручную вносите 50 мкл конъюгата в каждую лунку.
Пожалуйста, обратите внимание:
При работе с автоматическими системами необходимо внести по 60 мкл
коньюгата в каждую лунку по причине более сильного испарения в
инкубационных камерах автоматических систем.
Пригодность теста для автоматизированной обработки была
продемонстрирована во время его оценки. Тем не менее, мы рекомендуем
проверить совместимость теста с используемыми вами устройствами.
5.6. Снова поместите лунки во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в
течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре ЪТС (± 1°С).
5.7. После инкубации промойте лунки микропланшета еще раз (см. пункт 5.4.).
5.8. Внесите с помощью пипетки 50 мкл субстрата ТМВ в каж ГУЮ лунку (включая А1),
1
поместите во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в темноте в течение
30 мин. (± 2 мин.) при температуре 37 °С (± 1 °С). Положительные пробы поменяют цвет
на синий.
5.9. Остановите реакцию, добавив в каж УЮ лунку (включая А1) по 100 мкл стоп-
11
раствора. Положительные пробы поменяют цвет на желтый.
Перед фотометрическим измерением необходимо протереть наружную поверхность
лунок и проследить за тем, чтобы в них не было пузырьков воздзгка.
Измерение нужно провести в течение 15 минут после добавления стоп раствора.
5.Б. ТАКЛИЦА К ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ИНСТРУКЦИИ
Контр. >грицательный Положительный Калибратор Проба
лунка контроль контроль
(А1)
Отрицательный контроль - 50 мкл - - -
Положительный контроль - - 50 мкл - -
Образец - - - 50 мкл -
- - 50 мкл
Инкубировать в течение 60 минут при 37 С, промыть 3 раза промывочным буфером по 200
мкл на одну лунку
Конъюгат - 50/60МКЛ*) 150/60МКЛ*) 50/60 мкл*) |5Ш60мкл*)
Шкубировать в течение 60 минут при 37 С, промыть 3 раза промывочным буфером по 200
мкл на одну лунсу
1
Субстрат ТМВ [зОмкл 150 мкл 50мкл 50мкл ж мкл
Инкубировать в течение 30 минут при 37 С в темноте.
Стоп-раствор 100 100 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл
Фотометрическое считывание результата при 450 нм
(длина референс-волны света 620-650 нм)
') ручная/автоматическая обработка (см. 5.5)
6.А. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА (ВАЛИДНОСТЬ)
* Фотометрическое считьтание происходит при длине волны 450 нм (референс-
волна 620-650 нм).
* Оптическая плотность (ОП) контрольной пробы/бланка (лунка А1) вычитается из
всех остальных значений ОП,
К тесту прилагается спецификация с параметрами для данного теста:
- Специальная калибровочная кривая набора
-Параметры кривой а и Ь
-Заданное значение ОП калибратора
-Нижний предел ОП калибратора
-Заданные границы значений для положительного контроля (в мЕД/мл)
Критерии валидности
- Значение ОП отрицательного контроля должно составлять < 0,150.
-Значение величины для положительного контроля должно находиться в
пределах, указанных в спецификации данных набора.
-Среднее значение ОП калибратора должно быть больше нижнего предельного
значения ОП, указанного в спецификации данных набора
-Дополнительные критерии валидности для анализа пар сыворотка-ликвор указаны
в пункте 8.
Если вышеперечисленные критерии валидности не соблюдены, тест
необходимо повторить.
* Корректировка результатов измерения
Величина ОП для положительного контроля и проб пациента корректируется
следующим образом:
Заданное знач^ие ОП калибратора
ОПисправл. = Измеренное значение ОП калибратора * «Пизмер.
* Квантификация результатов измерения
Для исправленных значений ОП необходимо определить соответствующие
концентрации в мЕД/мл по калибрационной кривой в спецификации данных
набора,
В качестве альтернативы величины концентраций можно вычислить с помощью
следующей формулы:
Концентрация [мЕД/мл]= Ь/[оп„спрад.
Большинство фотометров ELISA новой конструкции позволяют вводить такую
формулу, поэтому возможно прямое считывание результатов через них.
Диапазон измерения простирается от 11 до 200 мЕД/мл. Пробы со значением
активности фермента вьпне пределов измерения засчитываются как > 200 мЕД/мл.
Эти величины не должны экстраполироваться! Такие пробы должны
анализироваться снова при большем разведении.
Точка разделения (Cut-off) относительно действующего иммунитета
находится при 12,5 м£Д/мл.
Серая зона = 11-14 мЁД/мл
Граничный интервал = Cut-off :Ь 20 % (= от 12 до 18 мЁД/мл)
Внимание ! Важное примечание I
В связи с определенными свойствами алгоритма квантификации отрицательные или
неопределенные значения mAU могут быть получены в следующих случаях:
- Пробы с большой положительностью и со скорректированными величинам ОП
> а считаются отрицательными или неопределенными величинами мЕД
(деление на нуль не разрешено). Такие пробы следует проанализировать еще
раз при большем разведении или интерпретировать их как пробы со значением
> 200 мЕД /мл.
6.Б. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ПРЕДЕЛЫ МЕТОДА
* Пробы с величинами активности фермента менее нижнего предела серой зоны
засчитываются как ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ относительно действующего иммунитета.
* Пробы с величинами активности фермента в пределах серой зоны засчитываются
как ГРАНИЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Эти пробы необходимо контролировать и через 14
дней взять у пациента дополнительную пробу, которая будет исследована вместе с
первой пробой на предмет изменения динамики титра.
* Пробы с величинами активности фермента более вфхнего предела серой зоны
засчитываются как ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ относительно действующего
иммунитета.
Результаты теста должны всегда интерпретироваться с учетом клинической
картины пациента, результатов тестов на антитела к вирусам HSV-l/2-IgM HSV-
l/2-IgG и других диагностических параметров.
В одиночных случаях нельзя исключать перекрестные реакции, вызванные
воздействием антител против других вирусов герпеса.
Сыворотки с высоким содержанием липидов и гемолитические сьшоротки не
влияют на результаты тестов.
7. ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были получены нами в рамках диагностической оценки.
7.А. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Были исследованы 346 сывороток пациентов (300 из лаборатории проф.д-ра Эндерса с
коллегами, Штутггарт; 46 из образцовой лаборатории по изучению вирусов HSV и VZV,
Йена; и 200 сывороток от доноров крови из Гановера и Шуля) в сравнении с
предварительным определением во время оценки диагностики. Номинальные результаты
были получены при использовании теста HSV-l/2-IgG-ELISA в сочетании с пробами
иммуноблота. Результаты представлены ниже в таблице.
HSV-l/2-IgG-EUSA PKS medac
Огриц. значение Сомнительные Положит.
значения значение
Отрицательное знач. 158 0 3
Сомнительные знач. 5 1 0
Положительное знач. 3* 0 376
♦одна из этих проб была подтверждена как положительная на антитела HSV-IgM
Специфичность = 99,00 %
Чувствительность = 100 %
Соответствие = 98,0 %
7. Б. ТОЧНОСТЬ
Проба Отклонение результатов одного Проба Отклонение результатов разных
анализа (Intraassay-Varianz) анализов (Interassay-Varianz)
Уср.Аи 1 SD CV(%) п Yc|kAU SD CV(%) n
PC 25,4 1,0 4 22 PC 28,8 1,0 3 11
№.1 ... _ 0,3 7 22 №.6 4,4 0,2 5 11
№2 18,3 0,5 3 22 №7 20,3 0,5 2 11
№3 103,0 4,2 4 22 №8 93,9 3,6 4 И
№4 114,1 3,8 3 22 №9 100,7 3,9 4 11
№5 157,9 6,2 4 22 №10 154,9 7,7 5 11
PC == положительный контроль;
8, ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИКВОРА (CSF)
Определение специфического синтеза антител в ЦНС, вызванного вирусом HSV, в рамках
диагностического исследования ликвора является важной частью дифференциальной
диагностики хронических аутоиммунных заболеваний, затрагивающих ЦНС.
Определение индекса (AI) антител к вирусам не годится для случаев острой инфекции,
вызванной вирусом HSV, затрагивающей ЦНС. В таком случае, идентификация вирусов
с помопц>ю PCR является предпочтительным методом.
При таких хронических заболеваниях, как множественный склероз, увеличенные значения
индекса AI антител к кори, краснухе и/или вирусу ветряной оспы, а также к вирусу
HSV, обнаруживаются в порядка 95 % всех случаев.
Определение специфического интратекального синтеза антител, вызванного вирусом HSV
производится с помощью вычисления индекса антител (ИА) по Райберу (Reiber 1987,
1999). Для расчета ИА должны быть соблюдены следующие условия:
-Определение коэффициента альбумина (Qaib) для оценки барьерной функции и
вычисления предельного значения (Limes) при повышенном коэффициенте IgG
(Qtot ^ Qlim)
“Определение коэффициента общего IgG (Qtot)
8.1. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
8.1.1. Тест подходит для исследования пар сыворотка-ликвор.
8.1.2. Сыворотки и ликвор не требуют предварительной обработки (например,
инактивации), тем не менее, они не должны быть заражены микробами и
микроорганизмами или содержать эритроциты.
8.1.3. Сыворотка
Помимо раствора 1:200 для определения серологического статуса сыворотки
разводятся буфером для разбавления проб в пропорции 1:1000. Для вычисления
ИА выбирается раствор, значение концентрации (lU-Wcrt) которого в мЕД
находится в пределах диапазона измерений 11-200 мЕД (см. пункт 6.А. и 8.4.).
Если значения в мЕД для обоих растворов находятся в этих пределах , то для
вычисления ИА необходимо использовать растюр в пропорции 1:1000. Если
концентрации обоих растворов превышают 200 мЕД, пробу необходимо
разводить дальше.
8ЛА Ликвор
Ликвор разводят с помощью буфера для разбавления проб в пропорции 1:5 в
соответствии со стандартом. Если измеренное значение концентрации антител
10
находятся за границами диапазона измерений, пробу необходимо разводить
дальше (см. 8.4).
Сыворотку и ликвор необходимо исследовать параллельно в одном и том
же тесте (также при повторных измерениях)!
82 ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ
Дальнейшая процедура проведения теста для определения IgG вируса краснухи в парах
сыворотка-ликвор указана в пункте 5.А.
&3. ОПРЕЖЛЕНИЕ ОБЩЕГО IgG И СОДЕРЖАНИЯ АЛЬБУМИНА
При определении содержания IgG, специфического для HSV-1/2, необходимо также
дополнительно установить соответствующее содержание общего IgG и содержание
альбумина в каждой паре проб сьюоротки и ликвора.
R4 ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА /ВАЛИДНОСТИ
* Валидность
Действительными являются критерии валидности, указанные в пункте 6,А,
Если вышеперечисленные критерии валидности не соблюдены, тест необходимо
повторить.
Дополнительно для диагностики ликвора:
- Диапазон измерений для сыворотки простирается от 11 до 200 мЕД.
- Сьюоротки с содержанием антител < 11 мЕД в растворе 1:200 рассматриваются
как серонегативные. В этом случае ИА определить нельзя.
~ В крайне редких случаях у серонегативных пациентов вследствие наличия
специфических антител, обусловленных вирусом HSV, в люсворе могут быть
обнаружены интратекальные антитела. В таких случаях потребуются дальнейшие
меры для диффе^нциальной диагностики.
- Диапазон измерений для ликвора простирается от 4 до 200 мЕД.
- Пробы ликвора, которые в растворе 1:5 и при положительном серологическом
статусе находятся ниже пределов диапазона измерений, не могут быть определены
по итогам теста. В таком случае маловероятен синтез интратекальных антител к
вирусам HSV-l/2-IgG.
♦ Оценка результатов
- Порядок расчета значения концентрации в мЕД см. в пункте 6.А Вычисление
специфических IgG-коэффициентов возбудителя (Qspec)
11
_ мЕД' ликвора ’ X • раствор • ликвора
vspec —
мЕД • сыворотки • х • раствор • сыворотки
-Расчет ИА
Специфический индекс возбудителя вычисляется по следующей формуле:
1 - ИА = Qspec / Qtot (для Qtot ^ Qlim)
2 . ИА = Qspec/ Qlim (для Qtot > Qlim)
Qiin, = 0^3 X VqL+6x10-* - 1,7X -
10
8.5. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
* Значения ИА от 0,6 до 1,3 считаются нормальными.
* Значения ИА > 1,3 и < 1,5 считаются граничными.
* Область патологических значений находится при ИА >1^.
* Значения ИА < 0,6 указывают на наличие аналитических ошибок и не могут быть
интерпретированы.
ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
* Не путайте флаконы с реагентами и их крьппки, чтобы избежать перекрестного
загрязнения.
* Сразу же после использования плотно закрывайте флаконы с реагентами, чтобы
избежать испарения и микробиологического з^ажения.
* После использования реагенты необходимо хранить в соответствии с
предписанными условиями, чтобы обеспечить указанный срок службы.
* Чтобы избежать путаницы и смешения с реагентами другой тестовой системы или
партии, все компоненты набора одного теста должны быть помещены сразу после
использования в оригинальную упаковку (см. также пункт 3).
УКАЗАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ
12
Соблюдайте общеобязательные государственные правила техники безопасности.
Реагенты, в которых использованы компоненты человеческого происхождения,
были протестированы на наличие HBsAg, Anti-HIV 1/2 и Anti-HCV и признаны
неинфицированными. Тем не менее, с такими реагентами, а также с реагентами,
составные части которых имеют животное происхождение (см. «Содержимое
упаковки»), необходимо обращаться как с потенциально инфекционно-опасными,
чтобы избежать риска заражения.
УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ
Химикаты и препараты, содержащиеся в данном продукте, а также остатки, которые
образуются при использовании данного продукта, относятся, как правило, к отходам,
которые необходимо утилизировать в установленном законом порядке.
Утилизация таких отходов регулируется государственными законами и постановлениями.
Информацию о местах и порядке утилизации предоставляют компетентные органы власти
или предприятия, занимающиеся утилизацией отходов.
Дата выдачи: 15.03.2010
ЛИТЕРАТУРА
Эшли Р. Д., Уальд А.: Генитальный герпес: Обзор эпидемии и потенциальное
использование типоспецифической серологии. Clin Microbiol. Rev.12 (1), 1-8 (1998),
Бергстрем Т., Трайбела Е.: Антигенные различия между гликопротеинами вирусов HSV-1
и HSV-2, а также их важность для типоспецифической серологии. Intervirology 39,1 Тб-
184 (1996).
Кимберлин Д. У.: Неонатальное инфицирование вирусом простого герпеса, Clin MicrobioL
Rev. 17(1), 1-13(2004).
Крибс И. М .: Понимание вируса простого герпеса: распространение, диагностика и
соображения по методике лечения при беременности. Журнал Midwifery Womens Health
53 (3), 202-208 (2008).
13
Мертенс Т., Хеллер О., Кленк Х-Д. (Hrsg.): Диагностика и терапия вирусных заболеваний-
126-137, издательство Urban &Fischer (2004).
Петерсен Е. Е., Дор X. В., Гросс Г., Петцольд Д., Вайзенбахер Е. Р., Вутцлер П.:
Генитальный герпес. 96, 38, А-2358-2364 (1999).
Райбер X., Фельгенхауер К.: Перенос протеинов через кровяной барьер ликвора, а также
квантификация гуморального имунного отклика в центральной нервной системе. Clin
Chim Acta, 319-328 (1987).
Райбер X.: Диагностика ликвора, в журнале: Клиническая неврология, Берлит П., (Hrsg.):
издательство Springer Verlag, Heidelberg, 148 - 177 (1999).
Зауэрбрай А., Вутцлер П.: Инфекции при беременности, вызванные вирусами простого
герпеса и ветряной оспы. Современные концепции предотвращения, диагностики и
терапии. Часть I: Инфекции, вызванные вирусом простого герпеса. Журнал Med Microbiol
Immunol 196 (2), 89-94 (2007).
Вильдеман Б., Ошман П., Райбер X. (Hrsg.): Нейрологическая лабораторная диагностика:
Диагностика ликвора. 45-54, издательство Georg ТЫепе Verlag Stuttgart New York (2006).
Вутцлер П., Зауэрбрай А., Эйхорн У.: Вирулогическая диагностика простого герпеса -
вируса энцефалита. Журнал Mikrobiologe 9,11-15 (1999).
Вутцлер П., Дор X. У., Фарбер И., Эйхорн У., Хельбиг Б., Зауэрбрай А.: Доминирование
серотипа простейшего вируса типа 1 и типа 2 в избранных германских популяциях -
соотношения по частоте поражения генитальным герпесом. Журнал Med Virol 61,201-207
(2000).
14
Parvovirus B19 - IgG - ELISA PKS medac
Иммуноферментный анализ с Системой Контроля Раскапывания для
количественного определения антител класса IgG к Parvovirus В19ъ сьюоротке
крови
Кат. № 108-PKS
Только для диагностики in vitro
ВВЕДЕНИЕ
Человеческий патогенный парвовирус В19 (PVB19) относится к семейству
парвовирусов. Это вирус без оболочки с геномом, представленным единственной
цепочкой ДНК. Вирусный капсид состоит из двух структурных белков VPI и
VP2. Оба структурных белка отличаются по дополнительной
последовательности 227 аминокислот в VP1. Нейтрализирующие антитела
вызваны в отношении этой специфической области VP1 называемой белковый
домен.
PVB19 распространены во всем мире. Описаны три генетических варианта
вируса с региональным различным уровнем распространения и различия в
области кодирования VP1. До сих пор известен только один серотип. В
Германии распространенность антител к PVB19 составляет приблизительно 72
%.
Эритоидные клетки-предшественники - являются мишенью репликации вируса.
После инфицирования ДНК вируса сохраняется пожизненно в различных
клетках ткани. Методы реактивации генома вируса неизвестны до сих пор.
Вирус пер>едается воздушно-капельным путем через инфицирование слизистой
стомы и фарингеальной области. Детская экзантема, инфекционная эритема ~
типичная клиническая картина инфекцирования PVB19. Возможны
парентеральные инфекции, вызванные зараженной вирусом кровью и
препаратами крови, полученными во время ию^ационного периода.
Парвовирусная 319 инфекция обычно является некритической для
иммунокомпетентных пациентов. Серьезные нарушения со стороны различных
органов как ^)трит, артралгия, гепатит, энцефалит, менингит и миокардит могут
встречаться у пациентов с ослабленным иммунитетом и как результат
длительной виремии. Во время беременности парвовирусная В19 инфекция
может вызвать самопроизвольный аборт, гибель плода или водянку плода
Серология “ метод выбора для выявления неосложненной парвовирусной В19
инфекции. Определение IgM и IgG как правило проводится на парных образцах
сьшороток. Серология далее сопровождает выявление острой и персистирующей
парвовирусной В19 инфекции. Определение IgG антител также используется для
подтверждения иммунитета к парвовирусной В19 инфекции.
IgM антитела указывают на острую инфекцию. Они могут быть обнаружены
самое ранее спустя десять дней после контакта с вирусом. У некоторых
пациентов результат IgM остается отрицательным как следствие очень высокой
вирусной нагрузки и формирования иммунных комплексов. В некоторых
г
случаях количество антитела IgM снижается ниже предела чувствительности
очень быстро после контакта с вирусом.
Тест-набор для определения IgM антител к парвовирусу В19 (PKS medac) -
анализ для обнаружениг специфических IgM антител к структурным белкам VP1
и VP2 парвовирусной В19 инфекции. U-захват и принцип ELA предусматривает
высокочувствительную и специфическую диагностическую интерпретацию.
г
СОДЕРЖИМОЕ УПАКОВКИ
Кат. № 108-PKS
МТР
1.
Микропланшет: 12 стрипов по 8 лунок (с рамкой и влагопоглощающим
герметичным алюминиевым пакетом), коричневого цвета, разделяемые на
отдельные лунки, U-образной формы, покрыты VP 1/2 капсидным антигеном,
BSA, содержит рН-индикатор, готов к использованию.
CONTROL
2.
Отрицательный контроль: 1 флакон - 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, содержит бычий сывороточный альбумин (BSA), фенол,
ProClin^^ 300 и гентамицина сульфат.
CONTROL
3.
Положительный контроль: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, содержит фетальную телячью сыворотку, бычий сывороточный
альбумин, фенол, ProCIin™ 300 и гентамицина сульфат.
CAL
4.
Калибратор: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сьшоротка, готов к использованию,
содержит фетальную телячью сьшоротку, бычий сывороточный альбумин,
фенол, ProClin^ 300 и гентамицина сульфат.
WB
5.
Моющий буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10х), pH 7,2 - 7,4,
содержит ProClin™ 300.
VIR-DIL
6.
Буфер для разведения проб: 1 флакон 110 мл PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, готов
к использованию, содержит ProClin™ 300.
CON
7.
Конъюгат: 3 флакона по 4,5 мл, козий античеловеческий IgG, конъюгированный
HRP, готов к использованию, окрашенный в зеленый цвет, содержит бычий
сывороточный альбумин, фенол, РгоСИп™ 300 и гентамицина сульфат.
тмв
8.
T^ffi-субстрат: I флакон 10 мл, готов к использованию.
ЗТСФ
9.
Стоп - раствор: 2 флакона по И мл каждый, 0.5 М раствор серной кислоты
(H SO), готов к использованию.
2 4
с
1. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ
Материал/реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест - упаковка Не открыта 2... 8 °С До истечения
срока годности
Микропланшет Открыт 2 ... 8 ""С в пакете 6 недель
с
влагопоглотителем
Контроли/калибратор Открыт 2.,. 8 °С 6 недель
Моющий буфер разведен 2... 8 °С б недель
Буфер для разведения Открыт 2... 8 °С 6 недель
проб
Конъюгат Открыт 2... 8 °С 6 недель
ТМВ-субстрат Открыт 2... 8 °С 6 недель
Стоп - раствор Открыт 2... 8 °С До истечения
срока годности
Не использовать реагенты по истечении срока годности.
2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ
2Л. Вода для инъекций (Н О). Использование деионизированной воды может
2
привести к ошибкам при проведении теста.
2.2. Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3. Чистый стеклянный или пластиковый контейнер для приготовления
моющего буфера и образцов.
2.4. Необходимое оборудование для промывки микропланшет (мультистеппер
или микропланшетный вошер).
2.5. 37 °С - инкубатор.
2.6. Микропланшетный ридер (фотометр) с фильтрами 450 нм и 620-650 нм.
3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
Все компоненты набора должны быть доведены до комнатной температуры до
начала процедуры.
Рассчитать необходимое количество стрипов.
3.1. Микропланшет
После каждого взятия стрипов алюминиевый пакет должен плотно закрываться
вместе с влагопоглощающей прокладкой. Срок годности и условия хранения
указаны в п. 1.
Примечание: микропланшет окрашен в светло-зеленый цвет. В процессе
обработки ячейки могут приобретать бурый цвет внутри, что не влияет на
результаты теста.
3.2. Моюитий буфер
Смешать одну часть моющего буфера (10х) с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл моющего буфера (10х) с 450 мл воды для инъекций).
На восемь стрипов необходимо 10 мл разведенного моющего буфера.
Кристаллы моющего буфера (10х) растворяются при нагревании (макс.
37 °С) и/или при взбалтывании при комнатной температуре.
Не смешивать специальные для теста реагенты (микропланшет, контроли,
конъюгат, калибратор) с реагентами из других партий. Напротив, буфер для
разведения проб, моющий буфер, ТМВ-субстрат и стоп-раствор могут быть
заменены во всех вирусологических наборах medac ELISA.
Реагенты других производителей не должны быть использованы.
Точные и воспроизводимые результаты могут бьпъ получены, только если
процедура теста выполнена точно.
4. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
4.1. Для теста пригодны образцы сыворотки.
4.2. Сыворотки не требуют специальной инактивации. Однако они не должны
быть контаминированы микроорганизмами или содержать эритроциты.
4.3. Сыворотки должны быть разведены в пропорции 1:200 буфером для
разбавления проб. Мы рекомендуем приготовить первичный растворитель 1:50
(например, 10 мкл сыворотки + 490 мкл буфера для разбавления проб), а затем
использовать пропорцию разбавления 1:4 исключительно для приготовления
необходимого объема. Образы, выходящие за пределы измерения, могут быть
разведены дальше.
4.4. Диагностические исследования парных сыворотокЩСЖ подробно
описаны в п. 8.
5. А. ПРЕДПИСАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ТЕСТА
5. 1. Упаковку планшет вскрыть по линии вскрытия и взягь необходимое
количество стрипов (см. п. 3.1.).
Микропланшет готов к использованию и не требует предварительной
отмывки.
5. 2. Лунку А1 оставить пустой в качестве бланка (см.п. 6.А.). В
соответствующие лунки добавить по 50 мкл отрицательного контроля,
положительного контроля и разведенного образца в однокрагном измерении, а
также 50 мкл калибратора в двух повторах.
После пипетироваия образцов (pH нейтральный или исходная жидкость)
ячейки приобретают голубой/зеленый цвет. Если цвет не изменился в
одной из ячеек, это говорит о том, что образец или контроль не были
добавлены в ячейку.
При необходимости стрины можно держать в течение 30 минут при
комнатной температуре до начала проведения теста.
5. 3. Стрипы инкубировать в течение 60 мин (± 5 мин) при температуре 37 °С
(± 1 °С) во влажной камере или заклеенными инкубационной оберточной
фольгой.
5.4. После инкубации промыть стрипы три раза 200 мкл моющего буфера на
каждую лунку. Следить за тем, чтобы все лунки при промьюке были заполнены.
После окончания процесса отмывки вытряхнуть стрипы на фильтровальную
бумагу.
Не позволяйте лункам высохнуть! Незамедлительно использовать!
5.5. Добавить конъюгат (зеленого цвета) во все лунки (кроме А1).
50 мкл конъюгата добавляется в лунки, если процедура теста вьшолияется
вручную.
Пожалуйста, помните:
при работе на автоматическом приборе (имеется в виду полный автомат)
из-за большого испарения в инкубаторе прибора в каждую лунку должно
бьггь пипетировано по 60 мкл.
Условия использования тестов на автоматических анализаторах были
подтверждены эмпирическим путем. Кроме того, мы предлагаем проверять
совместимость тестов с используемым оборудованием.
5.6. Инкубировать в течение 60 мин. (± 5 мин) при температуре 37° С
(± 1 °С) во влажной камере или заклеенными в инкубационную оберточную
фольгу.
5.7. После инкубации снова промыть микрострипы (см. п. 5.4.).
5.8. Добавить во все лунки (также и в А1) 50 мкл ТМВ-субстрата и
инкубировать в течение 30 минут (± 2 мин) при температуре 37 °С (± 1 ®С) во
влажной камере или заклеенными в инкубационную фольгу в темноте.
Положительные пробы приобретут голубой цвет.
5.9. Добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку для остановки реакции
(также в лунку А1). У положительных сывороток происходит смена окраски на
желтый.
Перед фотомепгрическим считыванием очистите наружную поверхность дна
лунок н проследите, чтобы в лунках отсутствовали воздушные пузырьки.
Считывание необходимо производить в течение 15 минут после добавления
стоп-расгвора.
с
5. В. ТАБЛИЦА РАБОЧЕЙ ПРОЦЕДУРЫ
Бланк Отрицательный Положительный Калибратор Проба
(А1) контроль контроль
Отрицательный
контроль - 50 мкл - - -
Положительный - -
контроль - - 50 мкл - -
Калибратор - - - 50 мкл -
Проба - - 50 мкл
Инкубировать в течение 60 мин. при температуре 37 °С, промыть три рача 200 мкл
моющего буфера
Конъюгат - 50/60 мкл *) 50/60 мкл *) 50/60 мкл ♦) 50/60 мкл *)
Инкубировать в течение 60 мин. при температуре 37 °С, промыть три раза 200 мкл
моющего буфера
ТМВ-субстрат 50 мкл 50 мкл 50 мкл 50 мкл 50 мкл 1
Инкубировать в течение 60 мин. при температуре 37 промыть три раза 200 мкл
моющего буфера
Стоп - раствор 100 мкл 1 100 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл
Фотометрическое' считьюание при 450 нм (референс 620 - 650 нм)
*) ручная/автоматическая процедура (см. п. 5.5.)
6. А, ОПЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА (Валидность)
• Чтение оптической плотности осуществляется при 450 нм (референс
длины волны 620 “ 650 нм).
• Значение ОП бланка (лунка А1) вычитается из всех других значений
оптической плотности.
Вместе с набором предоставляется спецификация на каждую партию со
следующими данными:
- калибровочная кривая
- параметры кривой а и Ь
- номинальное значение ОП калибратора
- нижний предел ОП калибратора
- номинальный уровень концентрации (МЕ/мл) положительного контроля
• Критерии валидации
- значение ОП отрицательного контроля должно быть < 0.15€.
- значение положительного контроля должно быть в пределах номинальных
значений, указанных в спецификации для каждой п^угии теста.
- значение ОП калибратора должно быть выше нижнего уровня ОП, указанного
в спецификации для каждой п^пии теста.
Повторите процедуру, если результаты не соответствуют спецификации.
• Коррекция результатов
Измеренное значение ОП положительного контроля и пробы корректируется
следуюпщм образом:
номинальное значение ОП калибратора
ОПкорресг = ________________________________________ХОП смеренное
1
измеренное значение ОП калибратора
• Количественная оценка результатов
Значение концентрации уже скорректированного значения ОП в МЕ/мл можно
найти в спецификации для каждой партии теста (см. спецификацию).
Или, ее можно рассчитать по следующей формуле;
Ь/ - 1
Концентрация [МЕ/мл]- O D c o rre c te d
Большинство аппаратов для чтения планшетов ELISA вводят в программу
формулу, таким образом, обеспечивая автоматическую обработку данных.
Пределы измерений для образцов сьшоротки колеблются от 3.6 до 77 МЕ/мл.
Пробы с параметрами вьппе данного диапазона интерпретируются как > 77
МЕ/мл. Такие значения не могут быть экстраполированы. Образцы тестируются
повторно в более слабом растворе.
Среднее значение (уровень отсечения) = 4.0 МЕ/мл
Серая зона = 3.6 - 4.4. МЕ/мл
Внимание! Важно!
Согласно математическому алгоритму подсчет отрицательного или
неопределенного значения мМе может быть получено в следующих случаях:
- исключительно положительные образцы с скорректированным значением ОП >
а рассчитываются как отрицательные или неопределенные значения ME (не
допускается деление на 0). Такие образцы должны пройти повторное
тестирование в более слабом растворе или интерпретироваться как > 77 МЕ/мл.
6. в. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
• Образцы, значения которых лежат ниже предела серой зоны,
оцениваются как Отрицательные.
• Образцы, значения которых находятся в пределах серой зоны,
оцениваются как Неопределенные.
Такие образцы должны быть повторно протестированы параллельно со
свежими образцами, взятыми 14 дней спустя, для того чтобы определить
изменение титра.
Образцы, значения которых лежат выше предела серой зоны,
оцениваются как Положительные.
Результаты теста всегда интерпретируются вместе с клиническими
данными пациента, результатами parvovirus B19-IgM и другими
возможными диагностическими параметрами.
В случае выявления иммунного статуса во время беременности,
рекомендуется подтвердить слабоположительный результат (< 10 МЕ/мл)
во втором IgG тесте с целью исключения ложноположительных
результатов.
Перекрестная реактивность с ANA реактивной сыворотки не обнаружена.
Lipaemic и гемолитическая сьюоротки не влияют на результаты теста.
7. ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были определены в процессе диагностических
исследований.
7. А. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Сыворотка крови 468 пациента (292 сыворотка пациентов, 77 - беременных
женпщн и 99 образцов сьшоротки крови доноров) была исследована в сравнении
номинальными результатами во время диагностической оценки. Номинальные
результаты определялись двумя различными методами ИФА в качестве
референса.
Результаты указаны в таблице:
Parvovirus Отрицательный Неопределенный Положительный
B19-IgG- Отрицательный 217 0 0
ELISA Неопределенный 0 0 1*
Test PKS Положительный 2 0 248
medac
^образец одного пациента с острой парвовирусной В19 инфекцией.
Специфичность = 99.1%
Чувствительность = 99.6%
Соответствие: 99.4%
7. В. ТОЧНОСТЬ
Проба Среднестатистическая погрешность Проба Среднестатистическая погрешность
Средн. СО КВ (%) Средн. СО КВ (%)
ОЕ ОЕ
PC 10.7 0.18 22 PC 10.3 0.39
т 1.0 0.04 22 №6 0.8 0.10 13
№2 8.3 0.28 22 №7 8.45 0.29
№3 23.0 0.83 22 №8 10.2 0.77
№4 40.1 1.45 22 №9 24.4 1.23
№5 69.3 3.84 22 №10 44.6 2.43
PC = положительный контроль
ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
* Не путать флаконы с реактивами и их крышки во избежание перекрестного
загрязнения.
* Флаконы с реактивами после использования необходимо сразу же плотно
закрыть, во избежание испарения и микробного заражения.
* После использования остатки реагентов хранить согласно предписаниям по
хранению, чтобы обеспечить указанный срок годности.
* После использования все компоненты тестового набора должны храниться в
своей оригинальной упаковке, во избежание смешивания реактивов из других
тестов или партий (см. п. 3).
УКАЗАНИЯ ПО БЕЗОПАСНОСТИ
* Следует придерживаться предписаний по технике безопасности.
* Реактивы, произведенные из человеческих биоматериалов, были проверены
на HBsAg, анти-HIV-1/2-антитела, HCV и классифшдарованы как
неинфицированные. Однако рекомендуется обращаться с данным материалом
как потенциально инфицированным, полученным из биологических образцов
животных (см. содержимое упаковки), соблюдая необходимые меры
предосторожности.
ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ
Остатки химических препаратов в целом рассматриваются как опасные отходы.
Обезвреживание и удаление отходов этого характера производится в
соответствии с национальными и региональными инструкциями. Свяжитесь с
местными специалистами или учреждениями по вопросам обезвреживания и
удаления опасных отходов, где вы смогли бы получить соответствующие
рекомендации.
Дата составления: 06.08Л010
Parvovirus B19 - IgM - ELA Test PKS medac
Иммуноферментный анализ с Системой Контроля Раскапывания для
определения антител класса IgM к Parvovirus В19ъ сыворотке крови
Кат. № 107-PKS
Только для диагностики in vitro
ВВЕДЕНИЕ
Человеческий патогенный парвовирус В19 (PVB19) относится к семейству
парвовирусов. Это вирус без оболочки с геномом, представленным единственной
цепочкой ДНК. Вирусный капсид состоит из двух структурных белков VP1 и
VP2. Оба структурных белка отличаются по дополнительной
последовательности 227 аминокислот в VP1. Нейтрализирующие антитела
вызваны в отношении этой специфической области VP1 называемой белковый
домен.
PVB19 распространены во всем мире. Описаны три генетических варианта
вируса с региональным различным уровнем распространения и различия в
области кодирования VP1. До сих пор известен только один серотип. В
Германии распространенность антител к PVB19 составляет приблизительно 72
%.
Эритоидные клетки-предшественники ~ являются мишенью репликации вируса.
После инфицирования ДНК вируса сохраняется пожизненно в различных
клетках ткани. Методы реактивации генома вируса неизвестны до сих пор.
Вирус передается воздушно-капельным путем через инфицирование слизистой
стомы и фарингеальной области. Детская экзантема, инфекционная эритема -
типичная клиническая картина инфекцирования PVB19. Возможны
парентеральные инфекции, вызванные зараженной вирусом кровью и
препаратами крови, полученными во время инкубационного периода.
Парвовирусная В19 инфекция обычно является некритической для
иммунокомпетентных пациентов. Серьезные нарушения со стороны различных
органов как артрит, артралгия, гепатит, энцефалит, менингит и миокардит могут
встречаться у пациентов с ослабленным иммунитетом и как результат
длительной виремии. Во время беременности парвовирусная В19 инфекция
может вызвать самопроизвольный аборт, гибель плода или водянку плода.
Серология - метод выбора для выявления неосложненной парвовирусной В19
инфекции. Определение IgM и IgG как правило проводится на парных образцах
сывороток. Серология далее сопровождает выявление острой и персистирующей
парвовирусной В19 инфекции. Определение IgG антител также используется для
подтверждения иммунитета к парвовирусной В19 инфекции.
IgM антитела указывают на острую инфекцию. Они могут быть обнаружены
самое ранее спустя десять дней после контакта с вирусом. У некоторых
пациентов результат IgM остается отрицательным как следствие очень высокой
вирусной нагрузки и формирования иммунных комплексов. В некоторых
случаях количество антитела IgM снижается ниже предела чувствительности
очень быстро после контакта с вирусом.
Тест-набор для определения IgM антител к парвовирусу В19 (PKS medac) -
анализ для обнаружени специфических IgM антител к структурным белкам VP1
2
и VP2 парвовирусной В19 инфекции. U-захват и принцип ELA предусматривает
высокочувствительную и специфическую диагностическую интерпретацию.
СОДЕРЖИМОЕ УПАКОВКИ
Кат. № 107-PKS
Микропланшет: 12 стрипов по лунок (с рамкой и влагопоглощающим
8
герметичным алюминиевым пакетом), разделяемые на отдельные лунки, U-
образной формы, покрыты козьим античеловеческим IgM иммуноглобулином,
BSA, содержит рН-индикатор, готов к использованию.
CONTROL
.
2
Отрицательный контроль: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, содержит бычий сывороточный альбумин (BSA), фенол,
РгоСИп*^^ 300 и гентамицина сульфат.
CONTROL
3.
Положительный контроль: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, содержит бычий сьшороточный альбумин, фенол, ProClin™ 300
и гентамицина сульфат.
т
4.
Моющий буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10х), pH 7,2-7,4,
содержит ProClin^ 300.
VIR-DIL
5.
Буфер для разведения проб: 1 флакон 110 мл PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, готов
к использованию, содержит ProClin'™ 300.
A N T IG EH -D IL
.
6
Буфер для разбавления антигена: 1 флакон 14 мл PBS/Tween, готов к
использованию, содержит ProClin™ 300.
7.
Антиген: флаконов, 2.0 мл, VP 1/2 капсидный антиген /BSA/Tween,
6
сублимированный
со»
.
8
Конъюгат: 1 флакон по 0.35 мл, антипарвовирус B19-IgG антитела,
моноклональные (мыши), конъюгированный HRP, готов к использованию,
окрашенный в красный цвет, содержит бычий сывороточный альбумин, фенол,
ProCiin™ 300 и гентамицина сульфат.
9.
ТМВ-ч:убстрат: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
10. STOP
Стоп - раствор: 2 флакона по 11 мл каждый, 0.5 М раствор серной кислоты
(H SO), готов к использованию.
2 4
1. ХРАНЕНИЕ и СРОК ГОДНОСТИ
Материал/реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест - упаковка Не открыта ... X До истечения
2 8
срока годности
Микропланшет Открыт 2 ... 8 °С в пакете 6 недель
с
влагопоглотителем
Контроли Открыт ,.. °С недель
2 8 6
Моющий буфер разведен 2.,. 8 °С 6 недель
Буфер для разведения Открыт 2... °С недель
8 6
проб
Буфер для разведения Открыт 2... °С недель
8 6
антигена
Конъюгат Открыт ... °С недель
2 8 6
Смесь антиген- Готова к При комнатной 6 часов
конъюгат использованию температуре
ТМВ-субстрат Открыт ... °С недель
2 8 6
Стоп - раствор Открыт ... X До истечения
2 8
срока годности
Не использовать реагенты по истечении срока годности.
2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ
2Л. Вода для инъекций (Н О). Использование деионизированной воды может
2
привести к опшбкам при проведении теста.
2.2. Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3. Чистый стеклянный или пластиковый контейнер для приготовления
моющего буфера и образцов.
2.4. Необходимое оборудование для промывки микропланшет (мультистеппер
или микропланшетный вошер).
2.5. 37 °С ~ инкубатор.
2.6. Микропланшетный ридер (фотометр) с фильтрами 450 нм и 620-650 нм.
3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
Все компоненты набора должны быть доведены до комнагной температуры до
начала процедуры.
Рассчитать необходимое количество стрипов.
После каждого взятия стрипов алюминиевый пакет должен плотно закрываться
вместе с влагопоглощающей прокладкой. Срок годности и условия хранения
указаны в п. .
1
Примечание: микропланшет окрашен в светло-зеленый цвет. В процессе
обработки ячейки могут приобретать бурый цвет внутри, что не влияет на
результаты теста.
3.2. Моющий буфер
Смешать одну часть моющего буфера (10х) с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл моющего буфера (10х) с 450 мл воды для инъекций).
На восемь стрипов необходимо 10 мл разведенного моющего буфера.
Кристаллы моющего буфера (10х) растворяются при нагревании (макс.
37 ^С) и/или при взбалтывании при комнатной температуре.
3.3. Смесь антиген-конъюгат
Восстановить сублимированный антиген 2.0 мл буфера для разведения антигена.
Осторожно перемешать и следить за тем, чтобы прилипшие к пробке частицы
также были растворены. За 60 минут до использования добавить 50 мкл
конъюгата в мл антигена.
2.0
После восстановления антигена и добавления конъюгата, смесь антиген-
конъюгат приобретет красный цвет и готова к использованию.
Готовая к использованию смесь антиген - конъюгат должна быть использована в
течение часов при комнатной температуре (см. .п. ).
6 1
Не смешивать специальные для теста реагенты (микропланшет, контроли,
конъюгат, антиген, буфер для разбавления антигена) с реагентами из
других партий. Напротив, буфер для разведения проб, моющий буфер,
ТМВ-субстрат и стоп-раствор могут быгь заменены во всех
вирусологических наборах medac ELISA.
Реагенты других производителей не должны быть использованы.
Точные и воспроизводимые результаты могут быть получены, только если
процедура теста выполнена точно.
4, ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
4.1. Для теста пригодны образцы сыворотки.
4.2. Сыворотки не требуют специальной инактивации. Однако они не должны
быть контаминированы микроорганизмами или содержать эритроциты.
4.3. Сыворотки разводятся в пропорции 1:1(Ю буффом для разведения проб.
5. А. ПРЕДПИСАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ТЕСТА
5 Л. Упаковку планшет вскрыть по линии вскрытия и взять необходимое
количество стрипов (см. п. З.1.).
Микропланшет готов к использованию и не требует предварительной
отмывки.
5. 2. Лунку А1 оставить пустой в качестве бланка (см.п. .А.). В
6
соответствующие лунки добавить по 50 мкл отрицательного контроля,
положительного контроля и разведенного образца в двух повторах.
После пипетироваия образцов (нейтральный pH или исходная жидкость)
ячейки приобретают голубой цвет. Если цвет не изменился в одной из
ячеек, это говорит о том, что образец или контроль не были добавлены в
ячейку.
При необходимости стрипы можно держать в течение 30 минут при
комнатной температуре до начала проведения теста.
5. 3. Стрипы инкубировать в течение 60 мин (± 5 мин) при температуре 37 °С
(± 1 °С) во влажной камере или заклеенными инкубационной оберточной
фольгой.
5.4. Приготовить смесь антиген - конъюгат (см. .п. 3.3.)
5.5. После инкубации промыть стрипы три раза 200 мкл моющего буфера на
каждую лунку. Следить за тем, чтобы все лунки при промывке были заполнены.
После окончания процесса отмывки вытряхнуть стрипы на фильтровальную
бумагу.
Не позволяйте лункам высохнуть! Незамедлительно использовать!
5.6. Добавить смесь антиген - конъюгат (красного цвета) во все лунки (кроме
А1).
50 мкл смеси добавляется в лунки, если процедура теста выполняется
вручную.
Пожалуйста, помните;
при работе на автоматическом приборе (имеется в виду полный автомат)
из-за большого испарения в инкубаторе прибора в каждую лунку должно
быть пипетировано по 60 мкл.
Условия использования тестов на автоматических анализаторах были
подтверждены эмпирическим путем. Кроме того, мы предлагаем проверять
совместимость тестов с используемым оборудованием.
5.7. Инкубировать в течение 60 мин. (± 5 мин) при температуре 37° С
(± *"С) во влажной KaMqje или заклеенными в инкубационную оберточную
1
фолыу.
5.8. После инкубации снова промыть микросхрипы (см. п. 5.5.)-
5.9. Добавить во все лунки (и в А1) 50 мкл ТМВ-субстрата и инкубировать в
течение 30 минут (± 2 мин) при температуре 37 °С (± °С) во влажной камере
1
или заклеенными в инкубационную фольгу в темноте. Положительные пробы
приобретут голубой цвет.
5.10. Добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку для остановки реакции
(также в лунку А1). У положительных сывороток происходит смена окраски на
желтый.
Перед фотометрическим считыванием очистите наружную поверхность дна
лунок и проследите, чтобы в лунках отсутствовали воздушные пузырьки.
Считывание необходимо производить в течение 15 минут после добавления
стоп-раствора.
5. В. ТАБЛИЦА РАБОЧЕЙ ПРОЦЕДУРЫ
Бланк Отрицательный Положительный Проба
(А1) контроль контроль
Отрицательный
контроль 50 мкл
■
Положительный
контроль - “ 50 мкл -
Проба - - - 50 мкл
Инкубировать в течение 60 мин. при температуре 37 °С, промыгь три раза 200 мкл
моющего буфера
Смесь антиген - “ 50/60 мкл *) 50/60 мкл ♦) 50/60 мкл*)
конъюгат
Инкубировать в течение 60 мин. при температуре 37 °С, промыть три раза 200 мкл
моющего буфера
ТМВ-субстрат 50 мкл 1 50 мкл 1 50мкл 11 50 мкл
Инкубировать в течение 60 мин. при температуре 37 °С, промыть три раза 200 мкл
моющего буфера
Стоп - раствор 100 мкл 100 мкл 1 100 мкл 1100 мкл
Фотометрическое считывание при 450 нм (референс 620 - 650 нм)
*) ручная/автоматическая процедура (см. п. 5.6.)
6. А. OITKHKA РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА ГВалияносгь)
• Чтение оптической плотности осуществляется при 450 нм ( референс
длины волны 620 - 650 нм).
• Значение ОП бланка (лунка А1) вычитается из всех других значений
оптической плотности.
• значение ОП негативного контроля должно быть <0.150
• значение ОП положительного контроля должно быть > 0.800
• Cat-ofT=значение ОП отрицательного котроля + 0Л40
• Серая зона = cut off ± 10%
Повторите процедуру, если результаты не соответствуют спецификации.
. в. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
6
• Образцы, значения которых лежат ниже предела серой зоны,
оцениваются как Отрицательные.
• Образцы, значения которых находятся в пределах серой зоны,
оцениваются как Неопределенные.
Такие образцы должны быть повторно протестированы параллельно со
свежими образцами, взятыми 14 дней спустя, для того чтобы определить
изменение титра.
• Образцы, значения которых лежат выше предела серой зоны,
оцениваются как Положительные.
• Результаты теста всегда интерпретируются вместе с клиническими
данными пациента, результатами parvovirus B19-IgG и другими
возможными диагностическими параметрами.
При подозрении на первичную парвовирусную В19 инфекцию во время
беременности необходима дальнейшая диагностика, например методом
ПЦР.
• Перекрестная реактивность с антителами IgM в активной сыворотке к
ANA, RF и коревой краснухе не обнаружена.
• Гемолитическая сыворотка не влияет на результаты теста.
7. ХАРАКТЕР] ж
Следующие х^актеристики были определены в процессе диагностических
исследований.
7.А.Ч ГВИТЕЛЬНОСТЬ и СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Сыворотка крови 471 пациента (293 сыворотка пациентов, 79 - беременных
женщин и образцов сыворотки крови доноров) была исследована в
100
сравнении номинальными результатами во время диагностической оценки.
Номинальные результаты определялись двумя различными методами ИФА в
качестве референса
Parvovirus Отрицательный Cut-off Положительный
B19-IgM- Отрицательный 377
0 0
ELATest Cut-off
0 0 0
PKS medac Положительный 5 89
0
Специфичность = 98.7%
Чувствительность = 100.0%
Соответствие: 98.9%
7. В. ТОЧНОСТЬ
Проба Среднестатистическая погрешность Проба Среднестатистическая погрешность
Средн. СО КВ (%) Средн. СО КВ(%)
ОЕ ОЕ
NC 0.050 0.002 22 NC 0.049 0.004
ВС 0.573 0.015 22 ВС 0.568 0.025
PC 1.343 0.025 22 PC 1.332 0.059
№1 0.087 0.005 22 №5 0.056 0.005
№2 0,608 0.019 22 №6 0.150 0.007
№3 1.257 0.025 22 №7 0.285 0.010
№4 1.858 0.029 22 №8 0.583 0.020
№9 1.996 0.048
NC = негативный контроль, ВС = слабоположительный контроль (не включен в
набор), PC = положительный контроль
ОБ1ЦИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
* Не путать флаконы с реактивами и их крышки во избежание перекрестного
загрязнения.
* Флаконы с реактивами после использования необходимо сразу же плотно
закрыть, во избежание испарения и микробного заражения.
* После использования остатки реагентов хранить согласно предписаниям по
хранению, чтобы обеспечить указанный срок годности.
* После использования все компоненты тестового набора должны храниться в
своей оригинальной упаковке, во избежание сменшвания реактиюв из других
тестов или партий (см. п. 3).
УКАЗАНИЯ ПО БЕЗОПАСНОСТИ
* Следует придерживаться предписаний по технике безопасности.
* Реактивы, произведенные из человеческих биоматериалов, были проверены
на HBsAg, анти-HIV-1/2-антитела, HCV и классифицированы как
неинфицированные. Однако рекомендуется обращаться с данным материалом
как потенциально инфицированным, полученным из биологических образцов
животных (см. содержимое упаковки), соблюдая необходимые меры
предосторожности.
ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ
Остатки химических препаратов в целом рассматриваются как опасные отходы.
Обезвреживание и удаление отходов этого характера производится в
соответствии с национальными и региональными инструкциями. Свяжитесь с
местными специалистами или учреждениями по вопросам обезвреживания и
удаления опасных отходов, где вы смогли бы получить соответствующие
рекомендации-
Дата составления: 06.08.2010
СОДЕРЖИМОЕ УПА1ЩВКИ
Кат. №202
МТР
.
1
Микропланшет: 12 стрипов по лунок, окрашен в серый цвет (с рамкой и
8
влагопоглощающим герметичным алюмш иевым пакетом), разделяемые на
1
отдельные лунки, U-образной формы, покрыты VlsE пептидным антигеном и
BSA, готов к использованию.
CONTROL -
.
2
Отрицательный контроль: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, окрашен в оранжевый цвет, содержит NBCS, фенол, ProClin™
300 и гентамицина сульфат.
COKTROL
3.
Положительный контроль: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, окрашен в оранжевый цвет, содержит фетальную телячью
сыворотку, бычий сывороточный альбумин, фенол, ProClin™ 300 и гентамицина
сульфат.
CAL
4.
Калибратор: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к использованию,
окрашен в оранжевый цвет, содержит фетальную телячью сьшоротку, бычий
сывороточный альбумин, фенол, РгоСИп^^ 300 и гентамицина сульфат.
WB
5.
Моющий буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10х), pH 7,2 - 7,4,
содержит ProCiin™ 300.
BO-DIL
.
6
Буфер для разведения проб: 1 флакон 110 мл PBS/Tween/NBCS, pH 7,0 - 7,2,
готов к использованию, окрашен в оранжевый цвет, содержит ProCIin™ 300.
соя
1.
Конъюгат: 3 флакона по 4,5 мл каждый, козий античеловеческий IgG,
конъюгированный HRP, готов к использованию, окрашенный в зеленый цвет,
содержит бычий сывороточный альбумин, фенол, ProClin™ 300 и гентамицина
сульфат.
.
8
ТМВ-субстрат: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
9.
Стоп - раствор: 2 флакона по 11 мл каждый, 0.5 М раствор серной кислоты
(H SO), готов к использованию.
2 4
202-VPRmi0610
1. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ
Материал/реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест - упаковка Не открыта .., °С До истечения
2 8
срока годности
Микропланшет Открыт 2 ... 8 °С в пакете 6 недель
с
влагопоглотителем
Контроли/Калибратор Открыт 2... 8 °С 6 недель
Моющий буфер разведен 2... 8 °С 6 недель
Буфер для разведения Открыт 2... 8 °С 6 недель
проб
Конъюгат Открыт 2...8°С 6 недель
ТМВ-субстрат Открыт 2 ... 8 °С 6 недель
Стоп - раствор Открыт 2 ... 8 '’С До истечения
срока годности
Не использовать реагенты по истечении срока годности.
2, ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ
2.1. Вода для инъекций (НгО). Использование деионизированной воды может
привести к ошибкам при проведении теста.
2.2. Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3. Чистый стеклянный или пластиковый контейнер для приготовления
моющего буфера и образцов.
2.4. Необходимое оборудование для промывки микропланшет (мультистеппер
или микропланшетный вошер).
2.5. 37 °С - инкубатор.
2.6. Микропланшетный ридер (фотометр) с фильтрами 450 нм и 620-650 нм.
3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
Все компоненты набора должны быгь доведены до комнатной температуры до
начала процедуры.
Рассчитать необходимое количество стрипов.
3.1. Микропланшет
После кавдого взятия стрипов алюминиевый пакет должен плотно закрываться
вместе с влагопоглощающей прокладкой. Срок годности и условия хранения
указаны в п. .
1
202-VPR/O106I0
3.2. Моющий буфер
Смешать одну часть моющего буфера (10х) с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл моющего буфера (10х) с 450 мл воды для инъекций).
На восемь стрипов необходимо 10 мл разведенного моющего буфера.
Кристаллы моющего буфера (10х) растворяются при нагревании (макс.
37 ®С) и/или при взбалтывании при комнатной температуре.
Не смешивать специальные для теста реагенты (микропланшет, контроли,
калибратор и конъюгат) с реагентами из других партий. Напротив, моющий
буфер, ТМВ-субстрат и стоп-раствор могут быть заменены во всех наборах
Borrelia medac.
Реагенты других производителей не должны быть использованы.
Точные и воспроизводимые результаты могут быть получены, только если
процедура теста выполнена точно.
4. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
4.1. Для теста пригодщы образцы сьшоротки и цереброспинальной жидкости (для
исследования цереброспинальной жидкости см. п. ).
8
4.2. Сыворотки не требуют специальной инактивации. Однако они не должны
бьггь контаминированы микроорганизмами или содержать эритроциты.
4.3. Сыворотки должны быть разведены 1:250 буфером для разбавления проб.
Мы рекомендуем приготовить первичный растворитель 1:50 (например, 10 мкл
сыворотки + 490 мкл буфера для разбавления проб), а затем использовать
пропорцию разбавления 1:5 (например, 10 мкл 1:50 разбавленной сыворотки + 40
цл буфера для разбавления проб). Образцы выше пределов измерения могут
быть разведены дальше.
4.4. Диагностическое исследование парных сывороток/ЦСЖ подробно описано в
пункте .
8
5. А. ПРЩ ШСАВДЯЛС Ш>ОВЕЖ ^
5.1. Упаковку планшет вскрыть по линии вскрытия и взять необходимое
количество стрипов (см. п. 3.1.).
Микропланшет готов к использованию и не требует предварительной
отмывки.
5.2. Внести 50 мкл разводящего буфера в лунку А1, используемую в качестве
бланка (см.п. .А.). В соответствующие лунки добавить по 50 мкл
6
отрицательного контроля, положительного контроля и разведенного образца в
однократном измерении, а также 50 мкл калибратора в двух повторах.
При необходимости стрипы можно держать в течение 30 минут при
комнатной температуре до начала проведения теста.
202-VPRA)10610
5.3. Стрипы инкубировать в течение 60 мин (± 5 мин) при температуре 37 °С
(± °С) во влажной камере или заклеенными инкубационной оберточной
1
фольгой.
5.4. После инкубации промыть стрипы три раза 200 мкл моющего буфера на
каждую лунку. Следить за тем, чтобы все лунки при промывке были заполнены.
После окончания процесса отмывки вытряхнуть стрипы на фильтровальную
бумагу.
Не позволяйте лункам высохнуть! Незамедлительно использовать!
5.5. Добавить конъюгат (зеленого цвета) во все лунки.
50 мкл конгьюгата добавляется в лунки, если процедура теста выполняется
вручную.
Пожалуйста, помните:
при работе на автоматическом приборе (имеется в виду полный автомат)
из-за большого испарения в инкубаторе прибора в каждую лунку должно
быть пипетировано по 60 мкл.
Условия использования тестов на автоматических анализаторах были
подтверяздены эмпирическим путем. Кроме того, мы предлагаем проверять
совместимость тестов с используемым оборудованием.
5.6. Р1нкубировать в течение 60 мин. (± 5 мин) при температуре 37° С
(± 1 °С) во влажной камере или заклеенными в инкубационную оберточную
фольгу.
5.7. После инкубации снова промыть микрострипы (см. п. 5.4).
5.8. Добавить во все лунки 50 мкл ТМВ-субстрата и инкубировать в течение 30
минут (± 2 мин) при температуре 37 °С (± 1 °С) во влажной камере или
заклеенными в инкубационную фольгу в темноте. Положительные пробы
приобретут голубой цвет.
5.9. Добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку для остановки реакции. У
положительных сывороток происходит смена окраски на желтый.
Перед фотометрическим счяггывани^ очистите наружную поверхность дна
лунок и проследите, чтобы в лунках отсутствовали воздушные пузырьки.
Считывание необходимо производить в течение 15 минут после добавления
стоп-раствора.
202-VPR/010610
5. В. ТАБЛИЦА РАБОЧЕЙ ПРОЦЕДУРЫ
Бланк Отрицательный Положительный Калибратор Проба
(А1) контроль контроль
Буфер для разведения 50 мкл - - - -
проб
Отрицательный 50 мкл • •
контроль
Положительный “ 50 мкл
контроль ■ ■
Калибратор - - - 50 мкл -
Проба - - - - 50 мкл
Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 °С, промыть 3 раза моющим буфером
мкл
200
Конъюгат 1 50/60 50/60 мкл ♦) 50/60 мкл*) 50/60 мкл 50/60
мкл *) *) . J мкл *)
Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 °С, промыть 3 раза моющим буфером
мкл
200
ТМВ-субстрат 1 50 мкл 1 50 мкл 50 мкл 1j 50 мкл 1 50 мкл
Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 °С в темноте
Стоп - раствор 1 100 мкл 1 100 мкл 100 мкл 1100 мкл 1 100 мкл
Фотометрическое считьшание при 450 нм (референс 620 -- 650 нм)
♦) ручная/автоматическая процедура (см. п. 5.5)
6, А. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА (Валидация)
• При оценке теста используются относительные единицы (AU).
• Чтение оптической плотности осуществляется при 450 нм (референс
длины волны 620 - 650 нм).
• Значение СП бланка (лунка А1) вычитается из всех других значений
оптической плотности.
• Спецификация
Вместе с набором предоставляется спецификация на каждую партию со
следующими данными:
> калибровочная кривая
- параметры кривой а и Ь
- номинальное значение ОП калибратора
- нижний предел ОП калибратора
- номинальный уровень концентрации (ОЕ/мл) положительного контроля
• Критерии валидации
- значение ОП бланка должно быть < .100.
0
- значение ОП отрицательного контроля должно быть < 0.150.
- значение положительного контроля должно быть в пределах номинальных
значений, указанных в спецификации для каждой п^ггии теста.
202-VPR/0I0610
♦ значение ОП калибратора должно быть выше нижнего уровня ОП, указанного в
спецификации для каждой партии теста.
- дополнительный критерий правильности данных оценки парных
сьюоротках/ЦСЖ указан в п. .
8
Повторите процедуру, если результаты не соответствуют спецификации.
• Коррекция результатов
Измеренное значение ОП положительного контроля и пробы корректируется
следующим образом:
номинальное значение ОП калибратора
ОПкоррект ~ ______________________________________X ОП измеренное
измеренное значение ОП калибратора
• Количественная оценка результатов
Значение концентрации уже скорректированного значения ОП в ОЕ/мл можно
найти в спецификации для каждой партии теста (см, спецификацию).
Или, ее можно рассчитать по следующей формуле:
Ь/ -
1
Концентрация [мОЕ/мл]== V 0 D c o rre c te d
Больпшнство аппаратов для чтения планшетов ELISA вводят в программу
формулу, таким образом, обеспечивая автоматическую обработку данных.
Пределы измерений для образцов сыворотки колеблются от 10.8 до 200 ОЕ/мл.
Пробы с параметрами ниже данного диапазона интерпретируются как <10.8
ОЕ/мл, а выше - как > 200 ОЕ/мл. Такие значения не могут быть
экстраполированы.
Среднее значение (уровень отсечения) = 12 ОЕ/мл
Серая зона =10.8-13.2 ОЕ/мл
6. В. ИНТЕРПРЕТАШЮ РЕЗУЛЬТАТОВ/ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
• Образцы, значения которых лежат ниже предела серой зоны,
оцениваются как Отрицательные.
• Образцы, значения которых находятся в пределах серой зоны,
оцениваются как Неопределенные.
Такие образцы должны быть повторно протестированы п^>аллсльно со
свежими образцами, взятыми 14 дней спустя, для того чтобы определить
изменение титра.
• Образцы, значения которых лежат выше предела серой зоны,
оцениваются как Положетельные.
202-\ГРКЛ)10610
• Результаты теста всегда интерпретируются вместе с клиническими
данными, результатами Borrelia-IgM и другими возможными
диагностическими параметрами.
• Согласно стандартам качества микробиологической диагностики болезни
Лайма (боррелиоза) (MiQ12), неопределенные и положительные
результаты иммуноферментного анализа подтверждаются с помощью
Вестерн-блотгинга.
• Высокое содержание гемоглобина и липидов в сьшоротке не влияет на
результаты теста,
• Перекрестная реактивность с антителами на Т.раШёит не исключается в
отдельных случаях (см. п. 7. В).
1. ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были определены в процессе диагностических
исследований.
7. А. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Сыворотка крови 100 доноров была исследована в сравнении с конкурирующими
методами ИФА. Было установлено преимущество в 7% по сравнению с
конкурирующими методами (5%).
Результаты конку]рирующиж методов ELISA
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgG- Отрицательный 90 92
2 0
ELISA Неопределенный
1 0 0 1
medac Положительный 5 7
1 1
Итого 92 1 3 5 100
1. В. ПЕРЕКРЕСТНАЯ РЕАКТИВНОСТЬ
Сыворотки крови 75 пациентов с антителами к Т. pallidum были оценены в
сравнении с конкурентами иммуноферментного метода. Полученные результаты
отображены в таблице:
Результаты конкурирующих методов ELISA
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgG- Отрицательный 3 72
68 1
ELISA Неопределенный
0 0 0 0
medac Положительный 3
2 0 1
Итого 70 3 2 75
1. С. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Образцы 290 пациентов с подозрением на боррелиоз прошли диагностическую
оценку. Полученные данные сравнили с номинальными результатами.
Номинальные результаты определялись в соответствии со стандартами MiQ,
разработанных для диагностики болезни Лайма (MiQ12), с помощью
конкурирующих методов ИФА и вестерн-блот набором в качестве сравнения.
202-VPRA)I06I0
Сыворотка с пограничными результатами ELISA и блот-анализа была исключена
и не оценивалась.
Номинальные результаты
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgG- Отрицательный 116 0 5 121
ELISA Неопределенный
0 0 2 2
medac Положительный 18 149 167
0
Итого 134 156 290
0
Специфичность = 87%
Чувствительность = 96%
Соответствие = 91%
Результаты IgG и IgM в сравнении с номинальными результатами, указанными
вьппе, внесены в таблицу:
Номинальные результаты
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgGЛgM- Отрицательный 48 5 53
0
ELISA 1 Неопределенный
1 0 0 1
medac Положительный 232 243
11 0
Итого 60 237 297
1 0
Специфичность = 80%
Чувствительность = 98%
Соответствие = 94%
7. D. ТОЧНОСТЬ
Проба Среднестатистическая погрешность Проба Среднестатистическая погрешность
Средн. С О К В (% ) п Средн. С О К В (•/•) 0
О Е О Е
П К 24.8 1.2 4.8 22 П К 23.8 0.7 2.9 11
т 50.9 1.5 3.0 22 44.8 2.1 4.7 11
№ 2 99.9 2.8 2.8 22 № 5 100.3 5.6 5.6 И
№ 3 147.5 2.5 1.7 22 № 6 43.7 2.3 5.3 И
№ 7 1 86.3 4.5 5-2 п
№ 8 1 108.3 8.4 7.8 11
ПК = положительный контроль
202-VPR/010610
8. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ
ЖЩЦСОСТИ
Выявление синтеза Яогге//а-специфичных антител в центральной нервной
системе (ЦНС), как часть диагаостического исследования цереброспинальной
жидкости, является важным этапом установления диагноза нейроборрелиоза.
Выявление синтеза интратекальных ВоггеНа-сиетфтяык антител
осуществляется путем оценки индекса антител по формуле Райбера (Райбер
1987,1999). Чтобы рассчитать индекс, необходимо выполнить следующие
условия:
- рассчитать индекс альбумина (Qaib) для оценки функций
гематоэнцефалического барьера, а также рассчитать значение Лайма у пациентов
с повышенным индексом общего IgG (Qtot > Qiim)
- провести оценку индекса общего IgG (Qtot)
Л ОБШ Ш
8
8.1.1. Тест подходит для обнаружения антител в парных сыворотках/ЦСЖ.
8.1.2. Образцы сыворотки и цереброспинальной жидкости не требуют
специальной инактивации. Однако они не должны быть контаминированы
микроорганизмами или содержать эритроциты.
8.1.3. Сыворотка.
Сыворотки должны быть разведены 1:250 буфером для разбавления проб. Если
значение ОЕ вьппе 200 ОЕ/мл, образец разбавляют 10-кратно (см. п. 8.4.).
.1.4. Цереброспинальная жидкость
8
ЦСЖ разводят в стандартной пропорции 1:5 буфером для разбавления проб.
Если полученная концентрация вьппе 200 ОЕ/мл, необходимо развести образец
10-кратно (см. .п. 8.4.).
Сыворотка крови и цереброспинальная жидкость всегда оцениваются
параллельно в одной процедуре проведения теста (это правило также
применимо к повторным измерениям).
8.2. ПРЕДПИСАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ТЕСТА
Выявление Borrelia-IgG в парных сыворотках/ ЦСЖ осуществляется согласно
процедуре, описанной в п. 5. А.
83. ВЫЯВЛЕНИЕ КОШ1ЕНТРА1ШИ ОБЩЕГО lnQ И АЛЬЪУМЗША
Дополнительно к процедуре выявления ВоггеИа-специфичных антител класса
IgG, необходимо определить в каждом образце пары сьюоротка - ЦСЖ
концентрацию общего IgG и альбумина.
202-VPRA)10610
8.4. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА
Критерии точности описаны в п. .А.
6
Повторить процедуру, если результаты не соответствуют спецификации.
Следующие условия применимы к процедуре исследования ЦСЖ:
- пределы чувствительности теста для сыворотки 10.8 - 200 ОЕ/мл.
- Сыворотки с содержанием антител < 10.8 ОЕ/мл в растворе 1:250 считаются
сероотрицательными. В этом случае индекс антител не определяется.
- В отдельных случаях, пациенты с отрицательным серологическим статусом
могут иметь интратекальные Borrelia антитела класса IgG, указывающие на
предположительное наличие нейроборрелиоза, что подгверждается
дальнейшими диагностическими исследованиями и расчетами.
- Пределы чувствительности для ЦСЖ - 6.25 - 200 ОЕ/мл.
- Образцы ЦСЖ пациентов с положительным серологическим статусом,
значение которого лежит ниже допустимого предела чувствительности при
разбавлении в пропорции 1:5, не рассчитьюаются. В этом случае наименее
вероятен интратекальный синтез антител класса IgG к Borrelia.
- чтобы рассчитать значение ОЕ см. п. .А.
6
- рассчитать индекс патогенных специфичных антител IgG (Qspec).
ОЕ ЦСЖ X раствор ЦСЖ
Qspec = ОЕ сыворотки X раствор сыворотки
- рассчитать индекс антител
Индекс патогенности рассчитывается по формуле:
* AI = Qspez/Qges (ftir Qges Qllra)
1
2. AI = Qspez/Qlim (flir Qges > Qlira)
3. Qiii. = 0, 93 X VQaib^ + X 10’® - 1 ,7 X 10"^
6
8.5. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
• значение индекса антител от 0.6 - .3 относится к норме.
1
• значение ищ^екса антител > 1.3 и < 1.5 относится к пограничным
значениям.
• Пределы патогенности индекс антител > 1.5.
202-VPR/ai0610
• значение индекса антител < относится к аналитической ошибке и не
0.6
интерпретируется.
• измененная воспалением ЦСЖ и повышенный индекс альбумина
являются критериями диагностики ЦСЖ для острого, активного
заболевания ЦНС. Это говорит о нарушении проходимости ЦСЖ,
возникшего из>за воспаления.
• повышенный индекс антител не является достоверным доказательством
острой фазы инфекционного заболевания ЦНС, поскольку антитела, даже
интратекально, могут присутствовать в течение долгого периода времени,
а также может протекать синтез полиспецифичных антител, свойственных
ЦНС. В некоторых случаях целесообразно выявить значимые изменения в
среднем значении индекса антител путем проведения тестирования
второй пары образцов сыворотка крови - ЦСЖ. В этих целях необходим
сбор других образцов, который проводится спустя промежуток времени, в
зависимости от клинической картины.
ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
* Не путать флаконы с реактивами и их крышки во избежание перекрестного
загрязнения.
* Флаконы с реактивами после использования необходимо сразу же плотно
закрыть, во избежание испарения и микробного заражения.
* После использования остатки реагентов хранить согласно предписаниям по
хранению, чтобы обеспечить указанный срок годности.
* После использования все компоненты тестового набора должны храниться в
своей оригинальной упаковке, во избежание смешивания реактивов из других
тестов или партий (см. п. 3).
УКАЗАНИЯ ПО БЕЗОПАСНОСТИ
* Следует придерживаться предписаний по технике безопасности.
* Реактивы, произведенные из человеческих биоматериалов, были проверены
на HBsAg, анти-Н1У-антитела, анти-ЬПУ-1/2-антитела, HCV и
классифицированы как неинфицированные. Однако рекомендуется обращаться с
данным материалом как потенциально инфицированным, полученным из
биологических образцов животных (см. содержимое упаковки), соблюдая
необходимые меры предосторожности.
ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ
Остатки химических препаратов в целом рассматриваются как опасные отходы.
Обезвреживание и удаление отходов этого характера производится в
соответствии с национальными и региональными инструкциями. Свяжитесь с
местными специалистами или учреждениями по вопросам обезвреживания и
удаления опасных отходов, где вы смогли бы получить соответствующие
рекомендации.
Дата соегавления: 01.06.2010
202-VPR/010610
CONTROL -
2.
Отрицательный контроль: 1 флакон * 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, окрашен в оранжевый цвет, содержит NBCS, фенол, РгоСНп™
300 и гентамицина сульфат.
CONTROL
3.
Положительный контроль: 1 флакон - 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к
использованию, окрашен в оранжевый цвет, содержит фетальную телячью
сыворотку, бычий сывороточный альбумин, фенол, РгоСИп^ 300 и гентамицина
сульфат.
CKL
4.
Калибратор: 1 флакон -1,5 мл, человеческая сьшоротка, готов к использованию,
окрашен в оранжевый цвет, содержит фетальную телячью сыворотку, бычий
сывороточный альбумин, фенол, ProClin'^^ 300 и гентамицина сульфат.
ив
5.
Моющий буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10х), pH 7,2- 7,4,
содержит ProClin^ 300.
BO-DIL
.
6
Буфер для разведения проб: 1 флакон 110 мл PBS/Tween/NBCS, pH 7,0 - 7,2,
готов к использованию, окрашен в оранжевый цвет, содержит ProClin™ 300.
CON
7.
Конъюгат: 3 флакона по 4,5 мл каждый, козий античеловеческий IgM,
конъюгированный HRP, готов к использованию, окрашенный в красный цвет,
содержит бычий сывороточный альбумин, фенол, ProCiin™ 300 и гентамицина
сульфат.
тмв
.
8
ТМВч:убстрат: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
Стоп - раствор: 2 флакона по 11 мл каждый, 0.5 М раствор серной кислоты
(H SO), готов к использованию
2 4
RF-ABS
.
10
IgG/RF-абсорбент: 1 флакон - 4 мл, козий античеловеческий IgG, готов к
использованию, содержит < % азид натрия.
0.1
1. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ
Материал/реагент Состояние Хранение Стабильность
Тест - упаковка Не открыта 2 ... 8 °С До истечения
срока годности
Микропланшет Открыт 2 ... 8 '"С в пакете 6 недель
с
влагопоглотителем
Контроли/Калибратор Открыт 2 ...8 °С 6 недель
Моющий буфер разведен 2... 8 °С 6 недель
Буфер для разведения Открыт 2 ... 8 X 6 недель
проб
Конъюгат Открыт 2 ... 8 °С 6 недель
ТМВ-субстрат Открыт 2 ... 8 °С 6 недель
Стоп - раствор Открыт ... X До истечения
2 8
срока годности
IgG/RF-абсорбент Открыт 2 ... 8 °С 6 недель
Не использовать реагенты по истечении срока годности.
.
2
2.1. Вода для инъекций (НгО). Использование деионизированной воды может
привести к ошибкам при проведении теста.
2.2. Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3. Чистый стеклянный или пластиковый контейнер для приготовления
моющего буфера и образцов.
2.4. Необходимое оборудование для промывки микропланшет (мультистеппер
или микропланшетный вошер).
2.5. 37 °С - инкубатор.
2.6. Микропланшетный ридер (фотометр) с фильтрами 450 нм и 620-650 нм.
3, ПРИГОТОВЛЕНВД: реактивов
Все компоненты набора должны быть доведены до комнатной температуры до
начала процедуры.
Рассчитать необходимое количество стрипов.
3.1. Микропланшет
После каждого взятия стрипов алюминиевый пакет должен плотно закрываться
вместе с влагопоглощающей прокладкой. Срок годности и условия хранения
указаны в п. .
1
Смешать одну часть моющего буфера (10х) с девятью частями воды для
инъекций (например, 50 мл моющего буфера (1 Ох) с 450 мл воды для инъекций).
На восемь стрипов необходимо 10 мл разведенного моющего буфера.
Кристаллы моющего буфера (10х) растворяются при нагревании (макс.
37 °С) и/или при взбалтывании при комнатной температуре.
Не смешивать специальные для теста реагенты (микропланшег, коитроли,
калибратор и конъюгат) с реагентами из других партий. Напротив, моющий
буфер, IgG/RF-абсорбент, ТМВ-субстрат и стоп>раствор могут быть
заменены во всех наборах Borrelia medac.
Реагенты других производителей не должны бьггь использованы.
Точные и воспроизводимые результаты могут быть получены, только если
процедура теста выполнена точно.
4. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
4.1. Для теста пригодны обра?цы сьюоротки и цереброспинальной жидкости (для
исследования цереброспинальной жидкости см. п. ).
8
4.2. Во избежание интерференции с высоким IgG титром и ревматоидного
фактора (RF), абсорбция IgG/RF проводится для всех сывороток. Сыворотки
используются в конечном растворе в пропорции 1:150. Они разбавляются в
пропорции буфером для разбавления образцов после разбавления в
1:100
пропорции 1:1.5 IgG/RF абсорбентом. Образцы выше пределов измерения могуг
быть разведены дальше буфером для разбавления проб после RP абсорбции.
4.3. Сьюоротки не требуют специальной инактивации. Однако они не должны
быть контаминированы микроорганизмами или содержать эритроциты.
4.4. Диагностическое исследование парных сывороток/ЦСЖ подробно описано
в пункте .
8
5. ПРЕДПИСАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ТЕСТА
S. А. IgG/RF-АБСОРБЦИЯ
Внимание;
* контроли готовы к использованию (абсорбция не требуется)
* указанные объемы применимы только для однократного измерения
5. А. I. Сыворотки: 10 мкл сыворотки разводягся 990 мкл буфером для
разведения проб (пропорция : ).
1 100
5. А. 2. Абсорбция: смешивают 20 мкл IgG/RF-апбсорбента и 40 мкл разведенной
сыворотки (пропорция 1:15), затем инкубируют при комнатной температуре в
течение 15 минут.
5. А. 3. Пропорция разведения составляет 1:150.
5. В, ПРОЦЕДУРА
5. В. 1. Упаковку планшет вскрыть по линии вскрытия и взять необходимое
количество стршюв (см. п. З.1.).
Микропланшет готов к использованию и не требует предварительной
отмывки.
5. В. 2. Внести 50 мкл разводящего буфера в лунку А1, используемую в качестве
бланка (см.п. .А.). В соответствующие лунки добавить по 50 мкл
6
отрицательного контроля, положительного контроля и разведенного образца в
однократном измерении, а также 50 мкл калибратора в двух повторах.
При необходимости стрипы можно держать в течение 30 минут при
комнатной температуре до начала проведения теста.
5. В. 3. Стрипы инкубировать в течение 60 мин (± 5 мин) при температуре 37 °С
(± °С) во влажной камере или заклеенными инкубационной оберточной
1
фольгой.
5. В. 4. После инкубации промыть стрипы три раза 200 мкл моющего буфера на
каждую лунку. Следить за тем, чтобы все лунки фи промывке были заполнены.
1
После окончания процесса отмывки вытряхнуть стрипы на фильтровальную
бумагу.
Не позволяйте лункам высохнуть! Незамедлительно использовать!
5. В. 5. Добавить конъюгат (красного цвета) во все лунки.
50 мкл коигьюгата добавляется в лунки, если процедура теста выполняется
вручную.
Пожалуйста, помните;
при работе на автоматическом приборе (имеется в виду полный автомат)
из-за большого испарения в инкубаторе прибора в каждую лунку должно
быть пипетировано по 60 мкл.
Условия использования тестов на автоматических анализаторах были
подтверждены эмпирическим путем. Кроме того, мы предлагаем проверять
совместимость тестов с используемым оборудованием.
5. В- - Инкубировать в течение 60 мин. (± 5 мин) при темпфатуре 37° С
6
(± 1 °С) во влажной камере или заклеенными в шпсубационную оберточную
фольгу.
5. В. 7. После инкубации снова промыть мнкрострнпы (см. п. 5. В. 4).
5. в. . Добавить во все лунки 50 мкл ТМВ-субстрата и инкубировать в течение
8
30 минут (± 2 мин) при температуре 37 °С (± 1 °С) во влажной камере или
заклеенными в инкубационную фольгу в темноте. Положительные пробы
приобретут голубой цвет,
5. В. 9. Добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку для остановки реакции.
У положительных сывороток происходит смена окраски на желтый.
Перед фотометрическим считыванием очистите наружную поверхность дна
лунок и проследите, чтобы в лунках отсутствовали воздушные пузырьки.
Считывание необходимо производить в течение 15 минут после добавления
стоп-раствора.
5. С. ТАБЛИЦА IgG/RF-АБСОРБШШ СЬШОРОТКИ
Показатель на измерение
60 мкл; пропорция разведения ; 150
1
I
воронка
1
Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут
i
Пропорция разведения в данной процедуре 1:150
5. р. ТАБЛИЦА РАБОЧЕЙ ПР011КЛУРЫ
Бланк Отрицательный Положительный Ккпмбратор Проба
(А1) контроль контроль
Буфер для разведения 50 мкл - - •• -
проб
Отрицательный 50 мкл
контроль
Положительный " 50 мкл -
контроль
Калибратор - - - 50 мкл -
Абсорбированная - - 50 мкл
-
проба
Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 °С, промыть 3 раза моющим буфером
мкл
200
Конъюгат 50/60 50/60 мкл *) 50/60 мкл *) 50/60МКЛ 50/60
мкл *) мкл *)
.*)
______
Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 °С, промыть раза моющим буфером
3
мкл
200
ТМВ-субстрат 50 мкл 50 мкл 50 мкл 50 мкл 50 мкл
Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 в темноте
Стоп - раствор I 100 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл
________Фотометрическое считьшание при 450 нм (референс 620 - 650 нм)
*) ручная/автоматическая процедура (см. п. 5. В. 5)
. А. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА (Валидность)
6
• При оценке теста используются относительные единицы (AU).
• Чтение оптической плотности осуществляется при 450 нм ( референс
длины волны 620 - 650 нм).
• Значение СП бланка (лунка А1) вычитается из всех других значений
оптической плотности.
Вместе с набором предоставляется спецификация на каждую партию со
следующими данными:
- калибровочная кривая
- параметры кривой а и Ь
- номинальное значение ОП калибратора
- нижний предел ОП калибратора
- номинальный уровень концентрации (ОЕ/мл) положительного контроля
• Критерии валидации
- значение ОП бланка должно быть < 0.100.
- значение ОП отрицательного контроля должно быть < 0.150.
- значение положительного контроля должно быть в пределах номинальных
значений, указанных в спецификации для каждой партии теста.
- значение ОП калибратора должно быть выше нижнего уровня ОП, указанного
спецификации для каждой партии теста.
- дополнительный критерий правильности данных оценки пары сыворотка -
ЦСЖ указан в п. .
8
Повторите процедуру, если результаты не соответствуют спецификации.
• Коррекция результатов
Измеренное значение ОП положительного контроля и пробы корректируется
следующим образом:
номинальное значение ОП калибратора
ОПкоррект ~ ______________________________________X ОП изв«еренное
измеренное значение ОП калибратора
• Количественная оценка результатов
Значение концентрации уже скорректированного значения ОП в ОЕ/мл можно
найти в спецификации для каждой партии теста (см. спецификацию).
Или, ее можно рассчитать по следующей формуле:
Ы -
1
Концентрация [мОЕ/мл]= 0 D c o rre c te d
Большинство новых аппаратов для чтения планшетов ELISA вводят в программу
формулу, таким образом, обеспечивая автоматическую обработку данных.
Пределы измерений для образцов сыворотки колеблются от 12.6 до 200 ОЕ/мл.
Пробы с параметрами ниже данного диапазона интерпретируются как < 12.6
ОЕ/мл, а вьппе - как > 200 ОЕ/мл. Такие значения не могут бь^ть
экстраполированы.
Среднее значение (уровень отсечения) = 14 ОЕ/мл
Серая зона = 12.6- 15.4 ОЕ/мл
. В. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
6
• Образцы, значения которых лежат ниже предела серой зоны,
оцениваются как Отрицательные.
• Образцы, значения которых находятся в пределах серой зоны,
оцениваются как Неопределенные.
Такие образцы должны быть повторно протесгарованы параллельно со
свежими образцами, взятыми 14 дней спустя, для того чтобы определить
изменение титра.
• Образцы, значения которых лежат выше предела серой зоны,
оцениваются как Положительные.
• Результаты теста всегда интерпретируются вместе с клиническими
данными, результатами Borrelia-IgM и другими возможными
диагностическими параметрами.
• Согласно станд^ам качества микробиологической диагностики болезни
Лайма (боррелиоза) (MiQ12), неопределенные и положительные
результаты иммуноферментного анализа подтверждаются с помопц»ю
Вестерн-блоттинга.
• Высокое содержание гемоглобина и липидов в сыворотке не влияет на
результаты теста.
• Перекрестная реактивность с антителами на T.pallidam не исключается в
отдельных случаях (см. п. 7. В).
7. ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были определены в процессе диагностических
исследований.
7. А. ДОМИНИРОВАНИЕ СЕРОТИПА
Сыворотка крови 00 доноров была исследована в сравнении с конкурирующими
1
методами ИФА. Было установлено преимущество в 1% по сравнению с
конкурирующими методами ( %).
2
Результаты конкурирующих методов ELISA
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgM- Отрицательный 95 2 1 98
ELISA Неопределенный
0 1 0 1
medac Положительный
0 0 1 1
Итого 95 3
2 100
7, В, ПЕРЕКРЕСТНАЯ РЕАКТИВНОСТЬ
Сьшоротки крови 75 пациентов с антителами к Т. pallidum были оценены в
сравнении с конкурентами иммуноферментного метода Полученные результаты
отображены в таблице:
Результаты конкурирующих методов ELISA
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgM- Отрицательный 5 4 69
68
ELISA Неопределенный
0 1 1 2
medac Положительный 4
1 1 2
Итого 61 7 7 75
7. С. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Образцы 322 пациентов с подозрением на боррелиоз прошли диагаостическую
оценку. Полученные данные сравнили с номинальными результатами.
Номинальные результаты определялись в соответствии со стандартами MiQ,
разработанных для диагностики болезни Лайма (MiQ 12), с помощью
конкурирующих методов ИФА и вестерн-блот набором в качестве сравнения.
Сыворотка с пограничными результатами ELISA и блот-анализа была исключена
и не оценивалась.
Номинальные результаты
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgM- Отрицательный 154 36 190
0
ELISA Неопределенный 5 7
2 0
medac Положительный И 114 125
0
Итого 167 155 322
0
Специфичность = 92%
Чувствительность = 74%
Соответствие = 83%
Результаты IgG и IgM в сравнении с номинальными результатами, указанными
выше, внесены в таблицу:
Номинальные результаты
Borrelia- Отрицательный Неопределенный Положительный Итого
IgGAgM- Отрицательный 48 5 53
0
ELISA Неопределенный
1 0 0 1
medac Положительный 232 243
11 0
Итого 60 237 297
0
Специфичность = 80%
Чувствительность = 98%
Соответствие = 94%
7. D. ТОЧНОСТЬ
Проба Среднестатистическая погрешность Проба Среднестатистическая погрешность
Средн. С О К В (% ) п Средн. С О К В (% ) п
О Е О Е
П К 27.6 0.9 3.3 22 П К 29.7 2.6 8.8 11
№ 1 80.5 1.8 2.2 22 № 4 62.2 7,3 11.7 И
№ 2 29.8 0.8 2.7 22 № 5 150Л 16.7 11.1 11
№ 3 185.9 3.9 2.1 22 № 6 66.3 6.2 9.4 11
№ 7 28.7 1.3 4.5 11
ПК = положительный контроль
8. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИГГЛКЛОВАНИЕ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ
ЖИДКОСТИ
Выявление синтеза Логге//а-специфичных антител в центральной нервной
системе (ЦНС), как часть диагностического исследования цереброспинальной
жидкости, является важным этапом установления диагноза нейроборрелиоза
Выявление синтеза интратекальных ^£»гг?/|а-специфичных антител
осуществляется путем оценки индекса антител по формуле Райбера (Райбер
1987, 1999). Чтобы рассчитать индекс, необходимо выполнить следующие
условия:
- рассчитать индекс альбумина (Qaib) для оценки функций
гематоэнцефалического барьера, а также рассчитать значение Лайма у пациентов
с повышенным индексом общего IgM (Qtot > Qiim)
- провести оценку индекса общего IgM (Qtot)
8Л> ОБРАЗЦЫ
8.1.1. Тест подходит для образцов парных сывороток/ЦСЖ.
8.1.2. Во избежание интерференции с высоким IgG титром и ревматоидного
фактора (RF), абсорбция IgG/RF проводится для всех сывороток и ЦСЖ.
8.1.3. Образцы сьшоротки и ЦСЖ не требуют специальной инактивации. Однако
они не должны быть контаминированы микроорганизмами или содержать
эритроциты.
8.1.4. Сыворотка.
Сыворотки должны быть разведены 1:150 (см .п. 5.А). Если значение ОЕ выше
200 ОЕ/мл, образец разбавляют 10-кратно буфером для разведения проб после
RF абсорбции (см. п. 8.4.).
8.1.5. Цереброспинальная жидкость
ЦСЖ разводят в стандартной пропорщш 1:5 буфером для разбавления проб. Для
начала разводят в пропорции 1:4 буфером для разведения проб, а затем в
пропорции 1:1.25 абсорбентом IgG/M". Если полученная концентрация антител
выше 200 ОБ/мл, необходимо развести образец 10-кратно буфером для
разведения проб после RF абсорбции (см. .п. 8.4.).
Сыворотка крови и цереброспинальная жидкость всегда оцениваются
параллельно в одной процедуре проведения теста (это правило также
применимо к повторным измерениям).
8.1.6. ТАБЛИЦА IgG/RF-АБСОРБЦИИ СЫВОРОТКИ
Показатель на измерение
100 мкл; пропорция разведения 1:5
i
воронка
i
Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут
i
Пропорция разведения в данной процедуре 1:5
8-2- ПРЕДПИСАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ТУ.ГТА
Выявление Borrelia-IgM в паре сьюоротка - ЦСЖ осуществляется согласно
процедуре, описанной в п. 5. В.
8,3. ВЫЯВЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО IgG И АЛЬБУМИНА
Дополнительно к процедуре выявления ВоггеИа-специфичных антител класса
IgM, необходимо определить в каждом образце пары сыворотка - ЦСЖ
концентрации общего IgM и альбумина.
8.4. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА
* Точность
Критерии точности описаны в п. .А.
6
Повторить процедуру, если результаты не соответствуют спецификации.
Следующие условия применимы к процедуре исследования ЦСЖ:
- пределы чувствительности теста для сьшоротки 12.6- 200 ОЕ/мл.
- Сыворотки с содержанием антител < ОЕ/мл в растворе 1:150 считаются
12.6
сероотрицательными. В этом случае индекс антител не определяется.
- В отдельных случаях, пациенты с отрицательным серологическим статусом
могут иметь интратекальные Borrelia антитела класса IgM, указывающие на
предположительное наличие нейроборрелиоза, что подгверадается
дальнейшими диагностическими исследованиями и расчетами.
- Пределы чувствительности для ЦСЖ - 6.25 - 200 ОЕ/мл.
- Образцы ЦСЖ пациентов с положительным серологическим статусом,
значение которого лежит ниже допустимого предела чувствительности при
разбавлении в пропорции 1:5, не рассчитьтаются. В этом случае наименее
вероятен интратекальный синтез антител класса IgM к Borrelia.
♦ Оценка
- чтобы рассчитать значение ОЕ см. п. .Л.
6
- рассчитать индекс патогенных специфичных антител IgM (Qspec)-
ОЕЦСЖхрастаорЦСЖ
Qspec ~ ОЕ сыворотки X раствор сыворотки
- рассчитать индекс анггнтел
Индекс патогенности рассчитывается по формуле:
AI — Ospec/Qtot (fo r Otot < Qlim)
2 » A I = Q s p e c / Q l i m ( f o r Q t o t > Q l i m )
3 . Q l i m = 0 , 6 7 X V O aifc^ + 1 2 0 X 1 0 '* - 7 , 1 X 1 0 " ^
8.5. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
• значение индекса антител от 0.6 - 13 относится к норме.
• значение индекса антител > 1.3 и < 1.5 относится к пограничным
значениям.
• Пределы патогенности индекс антител > 1.5.
• значение индекса антител < относится к аналитической ошибке и не
0.6
интерпретируется.
• измененная воспалением ЦСЖ и повышенный индекс альбумина
являются критериями диагностики ЦСЖ для острого, активного
заболевания ЦНС. Это говорит о нарушении проходимости ЦСЖ,
возникшего из-за воспаления.
• повышенный индекс антител не является достоверным доказательством
острой фазы инфекционного заболевания ЦНС, поскольку антитела, даже
интратекально, могут присутствовать в течение долгого периода времени,
а также может протекать синтез полиспецифичных антител, свойственных
ЦНС. В некоторых случаях целесообразно выявить значимые изменения в
среднем значении индекса антител путем проведения тестирования
второй пары образцов сыворотка крови - ЦСЖ. В этих целях необходим
сбор других образцов, который проводится спустя промежуток времени, в
зависимости от клинической картины.
ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
* Не путать флаконы с реактивами и их крышки во избежание перекрестного
загрязнения.
* Флаконы с реактивами после использования необходимо сразу же плотно
закрыть, во избежание испарения и микробного заражения.
* После использования остатки реагентов хранить согласно предписаниям по
хранению, чтобы обеспечить указанный срок годности.
* После использования все компоненты тестового набора должны храниться в
своей оригинальной упаковке, во избежание смешивания реактивов из других
тестов или партий (см. п. 3).
УКАЗАНИЯ ПО БЕЗОПАСНОСТИ
* Следует придерживаться предписаний по технике безопасности.
* Реактивы, произведенные из человеческих биоматериалов, были проверены
на HBsAg, анти-Н1У-антитела, анти-HIV-l/2-антитела, HCV и
классифицированы как неинфицированные. Однако рекомендуется обращаться с
данным материалом как потенциально инфицированным, полученным из
биологических образцов животных (см. содержимое упакоыси), соблюдая
необходимые меры предосторожности.
ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ
Остатки химических препаратов в целом рассматриваются как опасные отходы.
Обезвреживание и удаление отходов этого характера производится в
соответствии с национальными и региональными инструкциями. Свяжитесь с
местными специалистами или учреждениями по вопросам обезвреживания и
удаления опасных отходов, где вы смогли бы получить соответствующие
рекомендации.
Дата составления: 01.06.2010